Name: 신경 대 식 세포 공동 문화 Neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포를 활성화 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 cAMP로 대식세포를 활성화하여 신경 돌기 성장 인자를 분비시키는 방법을. DRG 신경세포와의 공동 배양을 통해 재생 메커니즘을 탐구하고 신경 손상 치료 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 NRF-2015R1A2A1A01003410 사역의 과학, 정보 통신, 미래 계획, 한국에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.

모든 실험 동물 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 아주 대학의과 대학에 의해 승인 되었다.
1. 문화 준비 해리 성인 DRG 신경의
<ol><li>문화를 설정 하기 전에 미리 폴 리-D-리와 laminin 6 잘 플레이트 코트. 밤새 0.01% 폴 리-D-리 또는 2 h 동안 37 ° C에서 4 ° C에서 6 잘 플레이트를 품 어. 다음, 증류수로 두 번 접시 세척.</li>
	<li>실 온에서 2 h 3 µ g/mL의 농도에서 laminin 솔루션 접시를 품 어 그리고 증류수와 두 번 접시를 세척. 1 시간 이상 실 온에서 접시를 건조.</li>
	<li>압축된 CO2 가스 실린더에 연결 된 투명 한 공동2 챔버에 마우스 안락사 Incise 수술 칼 날 척추 열을 overlying 피부와 척추 뼈를 양측 paravertebral 근육 해 부. 척추 뼈는 Drg 완전히 노출 될 때까지 꼼꼼하게 좁은 밀고 수술 rongeur를 사용 하 여 제거 합니다. 참고: 성인 Drg 신경 성인 C57BL6 남성 쥐 8 주 12 주 오래 된 사이에서 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>Iridectomy 위와 뾰족한 집게 해 현미경을 사용 하 여 c 1 수준까지 s 1에서 양자는 Drg를 제거 합니다. Schwann 세포 또는 섬유 아 세포의 오염을 최소화 하기 위해 Drg에서 완전히 뿌리를 잘라 하려고 합니다.</li>
	<li>60 mm 페 트리 접시까지 모두는 Drg 수집 5 mL의 찬 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 얼음에를 포함 하는 해 부 Drg를 저장 합니다. 참고: 그것은 중요 최대한 빨리는 Drg를 해 부하입니다. 한 마우스에서 모든 Drg의 컬렉션은는 안락사 후 30 분 30 분 보다 더 오래 걸릴 한다는 Drg 수집 중지 하 고 고 단계를 진행 하는 경우에 여전히 Drg 나머지는 수 없습니다.</li>
	<li>1.5 mL Eppendorf 관 푸른 피 펫 팁 (1000 µ L)을 사용 하 여 잘라 끝에 Drg를 전송. 미니 원심 분리기를 사용 하 여 몇 초 동안 빠른 스핀 후는 DMEM을 제거 합니다. DMEM 125 U/mL 유형 사이 콜라 포함의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 트위스터 셰이 커를 사용 하 여 부드러운 회전 (35-40 rpm) 90 분에 대 한 튜브를 품 어. 테이프를 사용 하 여 통 바닥에 튜브를 고정 하 고</li>
	<li>콜라-포함 된 DMEM 버립니다 하 고 신선한 DMEM 1 mL를 추가 합니다. 부동 Drg 완전히 바닥에 가라앉 고 조직 파편과 DMEM 제거 될 때까지 기다립니다. 이 세척 단계 6 번 이상 반복 합니다. 참고:는 상쾌한을 완전히 삭제 하지 마십시오. 수 표면에 뜨는 DMEM와 어떤 Drg를 제거 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>잘라 끝을 가진 파란 피 펫 팁 (1000 µ L)을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브에는 Drg를 전송. 그런 다음 아래로 부드럽게 플라스틱 적어도 15 번 블루 팁 (1000 µ L)를 사용 하 여 균질 세포 현 탁 액을 만들기 위해. 거품을 만드는 것을 방지 하 고 피 펫 팁 원뿔 튜브의 바닥을 터치 하지 않으려고.</li>
	<li>239 x g 3 분에 튜브 원심 하 고 신중 하 게 떠 있는 잔해와 함께 상쾌한 삭제. Neurobasal 매체 B27 보충의 1 mL을 추가 (2.0 %v / v) 5 10 배를 위아래로 부드럽게 pipetting으로 셀 펠 릿을 resuspend 하 고.</li>
	<li>세포 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브 위에 겹쳐 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 2 분 동안 기다립니다 그리고 Neurobasal/B-27 매체 피 펫 컨트롤러를 사용 하 여 여과기에 붓는 다.</li>
	<li>모든 수집된 DRG 뉴런 (한 마우스에서 대략 2 x 106 DRG 신경 총) 6 잘 플레이트의 2 개의 우물에 접시 한 성인 마우스에서 DRG 신경 6 잘 플레이트에서 두 개의 우물을 커버. 다음 37 ° C에서 CO2 인큐베이터에 접시를 두고는 대 식 세포 공동 문화 때까지.</li>
</ol>2. 공동 문화 P rimary 복 막 대 식 세포의 A 셀 문화 삽입에
참고: 해리 DRG 뉴런의 초기 도금 후 4 h 공동 문화 확립
<ol><li>기본 복 막 대 식 세포는 성인 C57BL6 남성 쥐 8 주 12 주 오래 된 사이에서 준비 된다. CO2 챔버에 동물 안락사 복 부 피부를 섬세 하 게 incise 하 고, 복 막 게 액체의 누설을 방지 하기 위해 복을 절단 하지 않도록.</li>
	<li>펑크 22 G 바늘과 주사기를 사용 하 여 복 막 및 복 막 구멍에 얼음 처럼 차가운 인산 염 버퍼 사린 (PBS)의 10 mL를 주입. 부드럽게 마사지 1-2 분 복. 다음, 바늘을 꺼내 바늘 찔린 사이트 통해 PBS에 밖으로 짜 내 고 50 mL 원뿔 튜브에 게 액체를 수집. 참고: 사용 하기 전에 PBS의 추위를 유지 하기 위해 얼음에 주사기를 넣어.</li>
	<li>239 x g 작은 세포질 분 대에 4 ° C에서 10 분에 게 액체 원심 실 온에서 3 분에 대 한 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 3 mL와 펠 릿을 resuspend. 그런 다음 다시 4 ° c.에서 10 분 동안 239 x g에 세포 현 탁 액을 원심 PBS의 3 mL와 펠 릿을 resuspend 하 고 모든 나머지 RBC 세포의 용 해 버퍼를 제거 하는 다시 세포 현 탁 액을 원심. 참고: RBC 세포의 용 해 버퍼 완전히 제거 되었는지 확인 합니다. 그렇지 않으면 나머지 RBC 세포의 용 해 버퍼 배양된 세포에 독성이 있을 수 있습니다.</li>
	<li>Neurobasal/B-27 매체의 1 mL에 수송과 셀 resuspend 플레이트 모든 수집 된 대 식 세포 (3 × 106 6 x 106 세포의 총) 세포 배양에의 절반 4.2 cm2, 해리 DRG의 우물 위에 배치의 효과적인 지역으로 삽입. 참고: 공동 문화 기간 동안 세포 Neurobasal/B-27 신경 문화 매체에서 성장 된다. 이 조건 하에서 세포의 적절 한 생존 확인 됐다.</li>
</ol>3. Db-캠프 및 Macrophage CM의 컬렉션의 치료
참고: 시작 신경 macrophage 공동 문화 후 db 캠프 치료 4 h.
<ol><li>신경 대 식 세포 공동 문화를 100 µ M db 캠프 솔루션의 2 µ L를 추가 합니다. 제어 실험에 대 한 PBS의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>24 시간 후 빈 잘 동일한 6 잘 플레이트에 대 식 세포 배양의 1ml 채워 놓습니다. 대 식 세포 배양 매체와 빈 잘 신경 macrophage 공동 문화에 셀 문화 삽입 전송. 매체를 변경 하지 않고 72 h에 대 한 동일한 조건 하에서 세포를 유지. 참고: 우리는 수 있도록 CM 컬렉션 중 대 식 세포 배양의 1ml만 집중 CM 추가 합니다. CM 수집 하는 동안 필요한 경우, 우리는 추가 삽입 내 대 식 세포를 표지에 더 많은 것.</li>
	<li>72 h 후 macrophage CM 세포 구성 요소를 제거 하려면 5 분 동안 239 x g에서 원심. 어떤 나머지 세포질 파편 든 지 제거 하는 0.2 µ m 필터에는 상쾌한 통과. 사용까지-70 ° C에서 수집 된 CM을 저장 합니다.</li>
</ol>4. Neurite 결과 분석 결과 수집 cm
<ol><li>별도 성인 DRG 신경 문화를 설정 하기 전에 미리 1.1 및 1.2에 설명 된 동일한 절차에 따라 8-잘 챔버 슬라이드 코트.</li>
	<li>Neurobasal 매체 B27 보충에 천연된 성인 DRG 뉴런을 얻을 1.10 1.3에서 설명한 동일한 방법을 사용 하 여. 미리 코팅된 8 잘 챔버 슬라이드에 잘 당 5 x 104 의 세포를 플레이트.</li>
	<li>셀 아래에 연결할 수 있도록 2 h 37 ° C 배양 기에서 챔버 슬라이드를 놓습니다. 그런 다음 37 ° c.에 preheated 해 동된 CM 문화 매체를 바꿉니다 참고: 문화 매체를 제거 하는 때 8 잘 챔버 슬라이드의 하단을 터치 하지 않도록 주의 하 고 수집 된 CM을 추가.</li>
	<li>초기 도금 후 15 h 매체를 제거 하 고 PBS 가진 셀을 한 번 씻어. 다음, 웰 스, 얼음 4 %paraformaldehyde 솔루션의 200 µ L을 추가 하 고 셀 paraformaldehyde 솔루션 4 ° C에서 20 분을 품 어 참고: neurite 결과 분석 결과 대 한 DRG 신경 문화 15 h를 정확 하 게 제한 해야 합니다. 이 조건 하에서 거기 아무 감지할 neurite 결과가입니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS로 세 번 세척 하 고 10% 차단 수행 정상 염소 혈 청 (NGS) 0.1% 트리톤-X 30 분에 대 한 1 차적인 항 체 (안티-Tuj-1) 솔루션 10% 희석 고정된 셀을 품 어 룸에서 4 h (1 µ g/mL의 농도)에서 NGS 온도 또는 4 ° c.에서 하룻밤</li>
	<li>PBS로 세 번 세척 하 고 실 온에서 2 h에 대 한 2 차 항 체 (염소-안티 마우스) 솔루션 셀을 품 어. 다음, PBS로 두번 세척 하 고 장착 솔루션을 사용 하는 coverslip (24 × 50 m m)와 문화 슬라이드를 탑재.</li>
	<li>Neurite 결과 시각화 하는 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 가져가 라.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
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<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 공동 문화 시스템의 생성에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 그것은 마우스 DRG 신경 및 복 막 대 식 세포가 신선한 준비는 되었는지 확인 하는 것이 중요 하 고 건강 한입니다. 우리 모든 Drg의 해 부 했다 30 분 이상 CM의 저하 neurite 결과 활동을 경험 했다. 또한, 복 막 대 식 세포 구성 요소 혈액의 오염 또한 CM에 neurite 결과 활동의 감소에 지도 했다. Db-캠프로 강력한 신경-대 식 세포 상호 작용을 유도 하기 위해 철저 한 세척 것도 조직 파편의 완전 한 제거 및 잠재적으로 남아 있는 세포 독성의 제거를 보장 하기 위해 중요 한 단계 콜라 또는 RBC 세포의 용 해 버퍼 등의 구성 요소. 또 다른 지점을 강조 되는 Drg에 연결 된 뿌리 제거 되어야 가능한 이다. 남은 뿌리의 스텁을 DRG 신경 문화에 Schwann 세포의 오염을 증가 했다. Schwann 세포는 결과 혼동할 지도 모른 문화에 neurotrophic 요인의 높은 금액을 생성할 수 있습니다.
<p class="j...

다양 한 연구는 척수 또는 뇌의 부상 후 CNS 축 삭 재생을 강화 하고자 했다. 염증 성 반응, 신 경계에 상해를 필연적으로 동반 해로운 결과1,2에 지도 하는 보조 병 적인 프로세스에 참여 하도록 전통적으로 생각 된다. 실제로, 염증 반응 억제 수 있습니다 methylprednisolone 급성 척수 부상3에 대 한 유일한 승인 된 치료입니다. 그러나, 최근 연구 제공 증거 대 식 세포, 대표적인 염증 성 세포 유형, 재생 또는 부상된 신 경계4,,56의 수리에 참여할 수 있습니다. 예를 들어 다음과 같은 렌즈 부상 생산 프로 재생 분자 망막 신경 절 신경7,8의 재생을 촉진 하는 대 식 세포 침투. 또한, 이식된 DRG 신경 축 삭 성장 세포 zymosan9에 의해 활성화 된 지역까지 증가. 또한, 병 변 사이트에서 대 식 세포는 부상된 주변 신경10성장 허용 환경을 만들 수 있습니다.
우리의 일은 또한 대 식 세포는 인접 한 뉴런의 축 삭 재생의 용량에 기여할 수 있는 강력한 증거 제공. 우리 느 루트 신경 절 (DRG)에서 대 식 세포의 활성화 했다 나타났습니다 DRG의 향상 된 재생 능력에 필수적인 감각 신경을 따라 늘어진 주변 신경 상해11. 비슷한 연구 독립적으로 다른 실험실12에서 보고 되었다. 우리는 또한 dibutyryl 축 삭 재생13의 용량을 강화 하는 잘 알려진 분자 인 순환 앰프 (db-캠프)의 intraganglionic 주입 대 식 세포의 활성화를 유발을 보여주었다. 대 식 세포의 비활성화 폐지 neurite 결과 활동에 db 캠프의 효과. 후속 작품 부상 유도 식 CCL2의 뉴런에 프로 재생 형14,15대 식 세포를 자극 하는 신호를 확인.
위의 실험 결과 바탕으로, 우리는 체 외에서 모델 닮은 Drg preconditioning 부상 모델11,14다음에 발생 하는 분자 이벤트를 설립 했다. 이 모델에서는 db-캠프 프로 재생 형으로 대 식 세포의 활성화에 이르게 신호 세포 도출 신경 macrophage 공동 문화에 적용 됩니다. 여기, 우리는 우리가 분자 요인 홍보 neurite 결과 (그림 1)을 분 비 하는 세포를 생성할 수 있습니다 자세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험적인 모델 세포 자극 하 하거나 신 경계에 상해 다음 축 삭 재생을 지원 하기 위해 유도 수 개념을 보여 줍니다. 우리의 모델 프로 재생 세포의 활성화에 지도 하는 세포 신호 메커니즘을 공부에 유용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>세포 배양 삽입 투명 PET 멤브레인 0.4&mu; m 기공 크기</td><td>Corning, Falcon</td><td>353090</td><td>0.4-&mu의 투명 PET 멤브레인; m 기공 크기, 6웰 플레이트</td></tr><tr><td>70-&mu; m 나일론 세포 스트레이너</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>8-well culture slide</td><td></td><td><</td>em>Clostridium histolyticumSigma-Aldrich C9407-100MG <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Neurobasal medium Thermo Fisher의 Poly-D-Lysine <tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr> Collagenase의 균일한 적용을 354632 Biocoat <tr><td></td><td> Scientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>글루타맥스 1% 및 페니실린-스트렙토마이신</td></tr><tr><td>B-27 보충제 1% 함유, 무혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>세포외 용액</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신 하이드로 브로마이드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 3 ', 5'- 고리 형 모노 포스페이트, N6 , O2'- 디부 티릴 -, 나트륨 염</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10 % 일반 염소 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>대정화학금속(주</td>) <td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>안티 &베타; III tubulin (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>마우스 단클론 항체</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H+L) 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 CO2 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>해부 실체 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>트위스트 쉐이커</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS(소 태아 혈청)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST(Fine Science Tools)</td><td>16021-14</td><td>스테인레스 스틸, 14cm, 곡선, 단일 관절 동작</td></tr><tr><td>미세 가위 - 텅스텐 카바이드 & ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td> <td>14558-11</td><td>날카롭고 톱니 모양의</td></tr><tr><td>Dumont # 7 Forceps</td><td>FST (Fine Science Tools)</td> <td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>FST (Fine Science Tools)</td> <td>15000-00</td><td>직선, 3mm 절삭 날, 날카로운</td></tr><tr><td>Qualitron DW-41 마이크로 원심 분리기</td><td>Artisan Technology Group</td><td>DW-41</td><td>입력 전압 : 115VAC</td></tr></tbody></table>

신경 대 식 세포 공동 문화 neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포를 활성화 하

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

세포 재생 또는 손상 신경 복구에 참여할 수 있는 강력한 증거가 있다. 여기, 우리 세포 생산 조절 매체 (CM) neurite 결과 촉진 유도 된다 프로토콜을 설명 합니다. 성인 지 루트 신경 절 (DRG) 뉴런 심하게 해리 하 고 도금. 뉴런 안정적으로 연결 하 고, 후 복 막 대 식 세포는 잘 동일한 중첩 셀 문화 삽입에 공동 경작. Dibutyryl 순환 앰프 (db-캠프) 후 세포 배양 삽입 대 식 세포를 포함 하는 24 시간에 대 한 공동 문화에 적용 됩니다 다른 잘 CM 72 h에 대 한 수집을 이동 합니다. 별도 성인 DRG 신경 문화에 적용 될 때 db-캠프로 치료 공동 문화에서 CM 강력한 neurite 결과 활동을 전시 한다. 혼자 단일 셀 형식의 구성 된 db 캠프 대우 문화에서 얻은 CM, DRG의 신경 또는 복 막 대 식 세포, neurite 결과 활동을 전시 하지 않았다. 이 신경 세포와 세포 사이의 상호 작용은 CM에 neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포의 활성화를 위한 불가결 하지 나타냅니다. 따라서, 우리의 공동 문화 패러다임 프로 재생 형으로 부여를 대 식 세포를 자극 하 신경-대 식 세포의 상호 작용에서 세포 신호 공부 유용할 또한.

우리 세포 neurite 결과 활동 분자 요인 은닉 할 수 생성할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 대 식 세포 CM db 캠프로 치료 공동 문화에서 얻은 강력한 neurite 결과 별도 DRG 신경 문화 (그림 2A)에 적용 될 때 귀착되는. 비교에서는, PBS 처리 공동 문화에서 얻은 CM는 우리의 15 h 문화 기간 (그림 2B)에 neurite 결과 유도 하지 않았다. Db-캠프는 혼자 대 식 세포와 문화에 처리 됩니다, CM이이 조건에서 얻은 neurite 결과 (그림 2C) 지원에 효과가 되지 않았습니다. 이것은 신경-대 식 세포 상호 작용은 필수 proregenerative 용량으로 부여를 대 식 세포를 자극 하는 제안. 우리는 또한 CM db 캠프 치료 신경 전용 문화에서 얻은 고 아무 neurit...

현재 프로토콜 neurite 결과 홍보 하는 분자 요인 출시 용량 부여 배양된 세포를 자극 하는 실험 절차를 제공 합니다. 치료 신경 macrophage 공동 문화 캠프의 강한 neurite 결과 활동을가지고 바른된 매체를 생산 하는 세포를 유도 합니다.

신경 대 식 세포 공동 문화 Neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포를 활성화 하

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

이 절차의 전반적인 목표는 신경돌기 성장을 촉진하는 분자 인자를 분비할 수 있는 대식세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 뉴런과 대식세포가 어떻게 서로 상호 작용하여 재생 전 대식표현형을 활성화하여 우수한 재생을 촉진하는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 아데노신 혈청 분자인 Cyclic AMP를 사용한다는 것인데, 이는 이전 연구에서 재생 표현형으로 대식세포를 자극하기 위해 훨씬 더 많은 생리학적 효소입니다.우리는 대식세포 활성화가 액시온 성장 능력을 향상시키는 데 필수적이며 영구적인 엽 손상에 대한 예방 조치에 따라 우수한 뉴런을 생성할 수 있다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 배양을 설정하기 전에 poly-D Lycine 및 laminin으로 6웰 플레이트를 사전 코딩합니다. 다음으로, 6웰 플레이트에 0.01 poly-D Lycine을 섭씨 37도에서 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.그런 다음 증류수로 접시를 두 번 씻으십시오. 그런 다음 실온에서 2시간 동안 밀리리터당 3마이크로그램의 농도로 라미닌 용액으로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 증류수로 플레이트를 두 번 세척하고 실온에서 최소 1시간 동안 플레이트를 건조시킵니다.이제 수술용 칼날로 안락사된 쥐의 척추 위에 있는 피부를 절개하고 한 쌍의 척추 근육을 양측으로 절개하여 척추뼈를 노출시킵니다. DRG가 완전히 노출될 때까지 끝이 좁은 수술용 롱거를 사용하여 척추뼈를 꼼꼼하게 제거합니다. 해부 현미경으로 홍채 절제술 가위와 끝이 가는 집게를 사용하여 S1에서 C1 수준까지 DRG를 양측으로 제거합니다.끝이 잘린 파란색 피펫 팁을 사용하여 DRG를 1.5ml eppendorf 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 미니 원심분리기를 사용하여 몇 초 동안 빠르게 회전한 후 DMEM을 제거합니다. 11형 콜라겐 125단위를 함유한 DMEM 1ml를 첨가하고 섭씨 37도에서 트위스터 쉐이커를 사용하여 부드럽게 회전하면서 튜브를 90분 동안 배양합니다.그 후, DMEM이 함유된 콜라겐 분해 효소를 버리고 새로운 DMEM 1ml를 첨가합니다. 끝이 잘린 파란색 피펫 팁을 사용하여 DRG를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 균질한 세포 현탁액을 만들기 위해 최소 15회 이상 위아래로 피펫팅합니다.239G에서 튜브를 3분 동안 원심분리하고 떠다니는 파편이 있는 상등액을 조심스럽게 버립니다. B27이 보충된 뉴로바질 배지 1ml를 추가하고 5-10회 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 50ml 원뿔형 튜브 위에 오버레이된 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다.그런 다음 수집된 모든 DRG 뉴런을 6개의 웰 플레이트의 2개의 웰에 플레이트합니다. 성체 마우스의 일차 복막 대식세포를 준비하려면 복막을 섬세하게 절개하여 복막을 노출시키고 복막을 절단하지 않도록 세척액의 누출을 방지합니다. 다음으로 22게이지 바늘이 있는 주사기를 사용하여 복막에 구멍을 뚫고 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 복강에 주입합니다.1-2분 동안 복막을 부드럽게 마사지합니다. 그런 다음 바늘을 빼내고 바늘 구멍을 통해 PBS를 짜내고 50ml 원추형 튜브에 세척액을 모읍니다. 그 후, 세척액을 239g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 세포 성분을 펠릿화합니다.그 후, 펠릿을 3ml의 적혈구 용해 완충액으로 실온에서 3분 동안 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 239g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 세포 현탁액을 다시 원심분리합니다. 펠릿화된 세포를 1ml의 neurobasil B27 배지에 다시 현탁시킵니다.수집된 모든 대식세포의 절반을 세포 배양 삽입물에 4.2cm 제곱의 유효 면적을 플레이트로 배치하여 해리된 DRG의 웰 위에 놓습니다. 뉴런 대식세포를 공동 배양한 후 4시간 후, 100마이크로몰 DB 고리형 암페어 용액 2마이크로리터를 뉴런 대식세포 공동 배양에 추가합니다. 24시간 후, 동일한 6웰 플레이트에 1ml의 대식세포 배양 배지로 빈 웰을 채웁니다.뉴런 대식세포 공동 배양에 삽입된 세포를 대식세포 배양 배지가 있는 빈 우물에 옮깁니다. 72시간 후, 대식세포 조건화 배지를 239배 g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 성분을 제거합니다. 상층액을 0.2마이크로미터 필터에 통과시켜 남아 있는 세포 파편을 제거합니다.이 절차에서는 8웰 챔버 슬라이드를 poly-D lycine과 laminin으로 사전 코팅합니다. 그런 다음 앞서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 B27이 보충된 해리된 성인 DRG 뉴런과 뉴로바질 배지를 얻습니다. 웰당 4개의 셀에 5회 10회 플레이트를 사전 코팅된 8웰 챔버 슬라이드에 놓습니다.그런 다음 챔버 슬라이드를 섭씨 37도의 인큐베이터에 2시간 동안 놓고 세포가 바닥에 부착되도록 합니다. 그런 다음 배양 배지를 섭씨 37도로 예열된 해동 및 컨디셔닝 배지로 교체합니다. 초기 도금 후 15 시간, 매체를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척 한 다음 200 마이크로 리터의 얼음 차가움, 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 우물에 첨가하고 섭씨 4 도에서 20 분 동안 파라 포름 알데히드 용액으로 세포를 배양합니다.그 후, 10% 정상 염소 혈청으로 희석된 1차 항체 용액으로 고정된 세포를 실온에서 4시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하여 신경돌기 성장을 시각화합니다. DB cyclic AMP로 처리된 공동 배양에서 얻은 대식세포 조건 배지는 별도의 DRG 뉴런 배양에 적용했을 때 강력한 신경돌기 증식을 초래했습니다.이에 비해, PBS를 처리한 공동 배양물에서 얻은 조건화된 배지는 신경돌기 성장을 유도하지 않았습니다. DB cyclic AMP를 대식세포만으로 배양에 처리한 경우, 조건화된 배지는 신경돌기 성장을 지원하는 데 효과적이지 않았습니다. 이는 뉴런 대식세포 상호작용이 대식세포가 재생능력을 부여받도록 자극하는 데 필수적임을 시사합니다.또한 DB cyclic AMP 처리된 뉴런 전용 배양액에서 얻은 컨디셔닝 배지를 테스트한 결과 신경돌기 성장이 발견되지 않았습니다. 뉴런과 마이크로플레이트는 신선하고 건강하게 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 우리는 박리가 너무 오래 지속되거나 복막 대식세포가 혈액 성분으로 오염되었을 때 일정한 배지의 신경돌기 성장 활성이 감소하는 것을 경험했습니다.이 프로토콜에서 해리된 DRG 뉴런은 세포 배양 삽입물의 대식세포와 재정적으로 분리되었습니다. 따라서 우리의 공동 배양 시스템은 완전히 재생되는 대식세포의 활성화를 매개하는 세포 간 신호 전달을 담당하는 세포 인자를 식별할 수 있게 할 것입니다.

neuron-macrophage-co-cultures-to-activate-macrophages-secreting

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

이 비디오는 쥐, 등뿌리, 신경절, 뉴런 및 대식세포의 공동 배양을 보여줍니다. 뉴런은 코팅된 플레이트에 파종되고, 대식세포는 안락사된 마우스에서 채취하여 처리한 후 배양 삽입물에 첨가합니다. db-cAMP를 사용한 치료는 뉴런을 활성화하고 대식세포가 뉴런 성장을 지원하기 위해 재생 전 표현형을 채택하도록 유도합니다.

In vitro에서 뉴런 및 대식세포 공동 배양 개발

이 비디오는 대식세포 조건 배지를 사용하여 신경돌기 성장으로 알려진 뉴런 돌출부의 성장을 촉진하기 위한 분석을 보여줍니다. cAMP와 함께 뉴런과 대식세포를 공동 배양하고 대식세포 유래 조건화된 배지를 수확합니다. 조건화된 배지로 뉴런을 성장시키면 신경돌기 성장이 촉진됩니다. 이러한 파생물은 형광 표지되고 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

뉴런 확장을 촉진하기 위해 대식세포 조건 배지를 사용합니다.

이 비디오는 인간 유도 뉴런(iN)과 유도 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양 확립을 보여줍니다. iNm은 공동 배양에서 iOPC와 혼합된 다음 두 iNm이 뉴런으로, iOPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지원하기 위해 배양됩니다. 뉴런은 다른 뉴런 및 희소돌기아교세포와 시냅스 연결을 형성하는 반면, 희소돌기아교세포는 뉴런의 축삭돌기 주위에 수초를 발달시킵니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용을 모델링하는 공동 배양 방법

다세포 유기체에서 분비된 용해성 인자는 부분비 신호의 결과로 다른 세포 유형으로부터 반응을 이끌어냅니다. Insert co-culture 시스템은 세포-세포 접촉이 없을 때 분비된 용해성 인자에 의해 매개되는 변화를 평가하는 간단한 방법을 제공합니다.

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

이 프로토콜은 신경 세포 - glia의 상호 작용의 실형 분석을위한 간접적 인 신경 세포 성상 세포의 공 배양을 설명합니다.

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

우리는 치과 펄프 (DP) 1 차 세포의 격리, 분산 및 도금이 지나치게 트랜스웰 필터 위에 배양된 삼차 (TG) 뉴런을 설명합니다. DP 세포의 세포 반응은 면역 형광 또는 RNA /단백질 분석으로 분석 될 수있다. 공초점 현미경검사법을 가진 신경 마커의 면역형광은 신경질성 파생 반응의 분석을 허용합니다.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

배우세요 cAMP로 대식세포를 활성화하여 신경 돌기 성장 인자를 분비시키는 방법을. DRG 신경세포와의 공동 배양을 통해 재생 메커니즘을 탐구하고 신경 손상 치료 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

신경 대 식 세포 공동 문화 Neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포를 활성화 하

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