Name: 유 방 우유 Enteroids의 성장을 강화: 세포 증식의 Ex Vivo 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 배우세요 유방 우유로 처리한 엔테로이드 배양법을 통해 장 상피 세포 증식을 연구하는 방법을. 이 기술은 신생아 괴사성 장염 등의 소화기 질환 연구에 활용됩니다.

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MG은 K08DK101608와 R03DK111473는 건강의 국가 학회 3 월의 천 재단 보조금 No. 5-FY17-79, 어린이 디스커버리 연구소의 워싱턴 대학, 세인트 루이스 아동 병원과의 학과에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 워싱턴 대학 대학원 의학의 세인트 루이스에서 소아과. CJL R01DK104946에 의해 지원 됩니다 (PI: 실버), 어린이 디스커버리 연구소의 워싱턴 대학 및 St. 루이 아동 병원.

이 연구에서 모든 동물 절차는 세인트 루이스 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (20160187 프로토콜) 또는 피츠버그 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (14103918 프로토콜)에 워싱턴 대학에 의해 승인 되었다. 24 주 미만의 임신에서 인간의 태아 소장 기관 검토 위원회 승인 (PRO14100537 프로토콜)의 대학에서 후 피츠버그 대학 해 부 조직 조달 지침에 따라 얻은 피츠버그는 정직한 브로커 시스템을 통해 건강 과학 조직 은행. 취소 확인 된 인간 유 방 우유 나 저온 살 균된 기증자 모유 피츠버그 기관 검토 위원회의 대학에서 동의의 포기와 함께 얻은 것입니다.
1. 토 굴 고립과 신생아 쥐 또는 조 인간의 소장에서 Enteroids의 설립
<ol><li>미디어 준비 참고: 미디어 준비 되어야 한다 후드에 하루 토 굴 격리 전에.<ol>
<li>1.11 L 문화 미디어를 준비 합니다. 포도 당 4.5 g/L와 L-글루타민 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 1 L로 시작 하 고 110 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) (최종 농도 10%), 11 mL 페니실린-스 (최종 농도 1%), 그리고 1.1 mL 살 균 인슐린 (최종 추가 농도 0.1%)입니다.</li>
		<li>500 mL PBS 항생제 혼합을 준비 합니다. 500 mL 1 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) x 10% 시작 FBS 5 mL Gentamicin (최종 농도 1%), 1 mL 암포 B (최종 농도 0.2%), 추가 5 ml 페니실린-스 (최종 농도 1%).</li>
		<li>30 mL 셀 중단 미디어 # 1을 준비 합니다. 먼저 30 mL 문화 미디어 준비. 600 µ L 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 추가 (최종 농도 10 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 및 60 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%).</li>
		<li>30 mL 셀 중단 미디어 # 2를 준비 합니다. 먼저 30 mL 문화 미디어 준비. 300 µ L 0.5 M EDTA를 추가 (최종 농도 5 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 및 60 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%).</li>
		<li>성장 인자 없이 50 mL 토 굴 문화 미디어를 준비 합니다. 33.4 mL 1 측정 x 고급 DMEM/F-12 10 mL FBS (최종 농도 20%)를 추가 하 고.<ol>
<li>500 µ L 추가 페니실린-스 (최종 농도 1%), 500 µ L L-글루타민 (최종 농도 1%), 500 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 100 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%), 2.5 µ L 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane 술 폰 산 (HEPES) (최종 농도 0.05 m m), 500 µ L 100 mM N Acetylcysteine (최종 농도 1 m m), 500 µ L 100 N-2 보충, 비타민 A, 마이너스 혈 청 무료 보충 (예를 들어, B-27) x 1 mL 50 및 500 µ 1 m 100 m L x Y-27632 x.</li>
		</ol>
</li>
		<li>성장 요인 1 mL 토 굴 문화 미디어를 준비 합니다. 첫째 1 mL의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 요소를 준비 합니다. 2.5 µ L 40 µ g/mL Wnt3a 추가 (최종 농도가 100 ng/mL), 1 µ L 100 µ g/mL 머리 (최종 농도가 100 ng/mL), 2 µ L 250 µ g/mL R-Spondin (최종 농도 500 ng/mL), 및 0.5 µ L 100 µ g/mL EGF (최종 농도 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>토 굴 절연
	<ol>
<li>장소 solubilized 지하실 막 추출 물 ( 재료의 표참조) 시작 하기 전에 해 동 얼음에. 참고: 얼음에 계속 지하실 멤브레인 유해 것입니다.</li>
		<li>쥐 나이의 14 일 보다 큰에 대 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜, 준수와 안락사의 두 가지 방법으로 마우스를 안락사 되 고 죽음을 보장 하기 위해 실제 절차. 참고: 마우스에 대 한 나이의 14 일 아래 잘린은가 위를 사용 하 여 표준 절차.</li>
		<li>가 위와 집게를 이용, 피부 및 복 막, 복 부의 전체 길이 통해 복 부의 정중 선 아래로 수직 절 개 만들. 가 위 맹 하 위장에서 소장을 소비 세 고 집게로는 mesentery를 제거 합니다. 참고: 2 주 된 남성과 여성의 C57BL/6J 마우스 새끼, 각 무게 5.5-7 g, 토 굴 격리 사용 되었다. 토 굴 격리에 대 한 어떤 나이 또는 크기 마우스를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>갓 수확된 소장 토 굴 격리를 준비 하려면 소장 똑바로 놓고 잘라가 위를 사용 하 여 그것의 전체 길이 따라 경도 소장. 참고: 마우스 및 인간의 장 수 준비 마찬가지로.</li>
		<li>부드럽게 앞뒤로 집게를 사용 하 여 PBS 항생제 혼합 가득 페 트리 접시에 소장을 떨고 하 여 소장에서의 하의 깨끗 한 자</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브에 세포 장애 미디어 # 1의 30 mL를 추가 합니다. 소장을 튜브에 직접 0.5 c m 길이 조각을 잘라. 튜브는 얼음 양동이에 설정 하 고 부드럽게 15 분에 대 한 최저 속도로 통에 선동.</li>
		<li>조직 뿌리에 있는 동안, 24 또는 48 잘 플레이트는 enteroids RNA, DNA, 또는 단백질 격리에 사용 되는 경우 지하실을 성장 하는 것을 얻을. 사용 8 잘 챔버 슬라이드 전체에 사용 되는 enteroids 있다면 지하실을 성장 하는 confocal 영상을 탑재 합니다.</li>
		<li>후드, 24 또는 48 잘 플레이트의 각의 밑에 지하실 막의 15 µ L를 추가 합니다. 챔버 슬라이드를 사용 하 여 각 챔버의 바닥에 지하실 막의 9 µ L를 추가 합니다. 참고: 필요한 경우 접시의 크기에 따라 지하실 막의 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>우물의 바닥에 얇은 층을 형성 하는 지하실 멤브레인을 피 펫 팁 지하실 막을 빠르게 확산. 유해를 지하실 멤브레인 수 있도록 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 놓습니다. 참고:는 지하실 지하실 멤브레인은 얇은 층 또는 지하실 멤브레인 기포를 포함 하는 경우 첨부 하지 않습니다.</li>
		<li>후 통에 15 분, 100 µ m 스 트레이너를 통해 조직을 필터링 합니다. 삭제를 통해 흐름.</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 튜브에 30 mL 셀 중단 미디어 # 2를 추가 합니다. 스 트레이너에서 조직을 제거 하 고 관에 추가 합니다.</li>
		<li>튜브는 얼음 양동이에 설정 하 고 부드럽게 15 분에 대 한 최저 속도로 통에 선동.</li>
		<li>통에 15 분 후 조직 100 µ m 스 트레이너를 통해 필터링. 수율은 나중 단계에서 낮은 경우에이 단계에서를 통해 흐름을 유지. 참고: 튜브를 통해 모든 흐름은 얼음에 유지 되어야 한다.</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 튜브에 15 mL DMEM 포도 당 4.5 g/L와 L-글루타민을 추가 합니다. 스 트레이너에서 조직을 제거 하 고 관에 추가 합니다. 적극적으로 100 µ m 스 트레이너를 통해 10 s. 필터에 대 한 손으로 튜브를 흔들을 통해 수집 합니다. 통해 아무 입자 포함 될 때까지 반복 합니다.</li>
		<li>후드, 70 µ m 멤브레인을 사용 하 여 마우스 조직 또는 인간의 조직에 대 한 100 µ m 멤브레인에 대 한 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 이전 단계에서 통해 흐름 필터링. 참고: 대기, 여분의 멤브레인 있고 멤브레인 파편으로 방해할 것으로 천천히 붓는 다.</li>
		<li>4 ° C와 후드에 얼음 양동이에 직접 장소에서 8 분 200 x g에서 튜브 원심 펠 릿을 방해 하지 않고 피 펫으로는 상쾌한을 제거 합니다. 총 원하는 금액의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 인자와 펠 릿 resuspend 참고: 농축된 지하실은 펠 릿의 '모래' 레이어. 각 잘 250 µ L의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 인자를 요구 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroids의 설립
	<ol>
<li>지하실 멤브레인에 직접 토 굴 미디어 혼합 플레이트</li>
		<li>격리 프로세스 성공적이 되도록 현미경으로 지하실을 확인 합니다. 참고: 셀과 셀의 공을 원하는 됩니다. 약 100 개인 지하실 잘 당 도금 된다.</li>
		<li>지하실 지하실 멤브레인에 있도록 3 h 37 ° C에서 접시를 품 어. 참고:이 부 화와 토 굴 문화 미디어 없이 성장 요인입니다.</li>
		<li>천천히 제거 미디어 초과 지하실 P-200 피 펫을 사용 하 여 연결 하지 못했습니다. 참고: 연결 된 지하실 제거 될 수 있다로 지하실 막을 방해 하지 마십시오.</li>
		<li>천천히 각 우물에 250 µ L의 토 굴 문화 미디어와 성장 인자를 추가 합니다. 참고: 24-48-잘 접시, 또는 챔버 슬라이드, 250 µ L의 토 굴 문화 미디어와 함께 성장 요인 충분 하다.</li>
		<li>대체 미디어 2 일 마다와 신선한 토 굴 문화 미디어와 함께 성장 요인 5 일전 최적의 부착과 성장을 허용 하기 위해 치료에 대 한.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 마우스 유 방 우유 컬렉션
<ol><li>그 새끼 짤 전에 6 h에서 산 후 7-12 일 C57BL/6J 양모 댐을 구분 합니다.</li>
	<li>Anesthetize 코 콘 통해 isoflurane와 양모 댐 하 고 0.15 IU/kg 몸 무게에서 oxytocin의 피하 주사를 관리. 절차를 짜기 전에 3 분을 기다립니다.</li>
	<li>절차를 짜기 전에 70% 에탄올과 꼭지를 깨끗 하 고 건조 하 게.</li>
	<li>실리콘 튜브 마우스 꼭지 5 mL 컬렉션 튜브에 맞게 크기와 전기 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 한 번에 한 꼭지에서 우유를 추출 합니다. 참고: 최적의 유 방 펌프는 두 개의 설정 속도, 하나 흡입 있습니다. 그것은 각각의 낮은 설정으로 시작 하 고 둘 다 우유 추출 될 때까지 천천히 증가입니다. 이상적으로, 총 수익률 됩니다 ~ 500 µ L-마우스 모유 수 댐 당 1 mL.</li>
	<li>즉시 aliquot 모유와-80 ° c.에 게 참고: 동결/동결 해제 방지 주기.</li>
	<li>37 ° c.에 24 h에 대 한 성장 인자와 토 굴 문화 미디어의 mL 당 마우스 유 방 우유의 50 µ L/mL와 5 일에 enteroids를 취급</li>
</ol>3. 전체 Enteroids의 Staining 탑재
<ol><li>
시 약의 준비
	<ol>
<li>8 우물 당 16 mL 1 x PBS를 준비 합니다.</li>
		<li>8 우물 당 1 x PBS에 2 mL 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다.</li>
		<li>준비 2 mL 0.1 %8 우물 당 1 x PBS에 트라이 톤 X-100.</li>
		<li>준비 24 mL PBS 트윈 (PBST은 0.1% Tween 20 1 x PBS) 8 웰 스 당.</li>
		<li>준비 2 mL 0.1%에 10% 정상 당나귀 세럼 (NDS) PBST (10 %NDS / PBST) 8 웰 스 당.</li>
		<li>준비 4 mL 1% 0.1%에서 NDS PBST (1 %NDS / PBST) 8 웰 스 당.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
주 1 얼룩
	<ol>
<li>치료에서 aspirate와 enteroids PBS로 세척. 추가 250 µ L 4 %PFA 잘 당. 1-2 h 4 ° c.에 대 한 회전에 4% 제거 PFA와 피 펫.</li>
		<li>250 µ L/잘 1과 4 번 세척 PBS x. 실 온 (RT)에서 10 분 동안 회전에 놓습니다. 참고: 필요한 경우 4 ° C에서 1-2 일에 대 한 접시를 저장 가능 하다.</li>
		<li>추가 250 µ L/잘 0.1% 트라이 톤 X-100. 1 h 실시간 제거에 대 한 품 어 0.1% 피 펫과 트라이 톤 X-100.</li>
		<li>250 µ L/잘 1과 4 번 세척 PBS x. 실시간에서 15 분 동안 회전에</li>
		<li>250 µ L/잘 10% 추가 NDS/PBST. 실시간 제거에서 45 분 동안 품 어 10 %NDS / PBST 피 펫과.</li>
		<li>250 µ L/잘 1 차적인 항 체, 희석된 1/250에서 1 %NDS / PBST을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 참고: 최적의 항 체 희석 제조업체에 따라 다릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
얼룩이 Day 2
	<ol>
<li>4-5 h 250 µ L/잘 PBST에 대 한 5 번 이상 씻는 다. 각 씻어 사이의 4 ° C에서 회전자에 놓습니다.</li>
		<li>250 µ L/잘 이차 항 체, 희석된 1/1000에서 1 %NDS / PBST을 추가 합니다. 호 일에 접시를 포장 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 일을 착 색
	<ol>
<li>250 µ L/음 핵 얼룩 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 분 추가 합니다. 참고: 어둠 속에서 접시를 유지.</li>
		<li>250 µ L/잘 PBST 6 번 씻어. 각 씻어 사이의 4 ° C에서 10 분 동안 회전에 놓습니다.</li>
		<li>챔버에 마운트 coverslip 설치 미디어와 슬라이드.</li>
		<li>객관적인 confocal 현미경 40x와 이미지와 래스터 그래픽 편집기에서 동일 하 게 렌더링 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 아무것도 공개 및 충돌의 관심 있다.

장 상피 직감 장벽 무결성을 유지 하는 병원 체에 대 한 호스트 방어를 제공 하 고 여러 질병의 병 인에 위반 될 수 있는 많은 세포질 하위 구성 됩니다. 동물 모델 질병의 몇 가지 측면을 정리 수 있습니다, 하는 동안 생쥐와 인간의 작은 창 자에서 파생 된 enteroids의 비보 전 모델 다양 한 치료의 효과 테스트 플랫폼을 제공 합니다. Enteroid 모델의 중요성 문화 순진한 또는 병에 걸린 동물과 기존 방법으로 사용할 수 없습니다 인간에서 모든 상피 세포 하위로 장 줄기 세포를 분화 하는 연구자를 수 있습니다. 이 모델 시스템 마우스 등 엔테로바이러스25 또는 노로바이러스26 다른 사람 사이 쉽게 변환 되지 않을 수 있습니다 인간 병원 체와 감염에 대 한 사용할 수 있습니다. Enteroid 모델에는 몇 가지 이점이 사용; 그러나, 배려는 미디어와 enteroids의 생존에 필요한 특정 세 성장 요인에 사용 되는 시 ...

Necrotizing enterocolitis (NEC)에 영향을 미치는 거의 1/10 유아 29 주 태동1,2,3전에 태어난 조산에 위장 질환에서 죽음의 주요 원인입니다. 생존은 단지 10-304,5가장 심각한 형태를 NEC 진행과 유아의 반은. 미국에는 약된 2-3 십억 달러/년 소비 하는 NEC6,7, 유아 치료 아직 생존 율도 치료는 지난 30 년 동안 변경 되었습니다. 그러나 NEC의 병 장 부상으로 특징은 점 막 치유8,,910,11,, 신호 경로 악화를 선도 염증 반응 및 메커니즘 염증을 불완전 하 게 이해 남아 있습니다.
인간의 모유의 조산에 대 한 NEC에 대 한 유일한 보호 전략 발견 되었습니다. 우리는 이전 유 방 우유는 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR) 신호 통로11를 통해 장 상피에 타고 난 면역 수용 체 통행세 같이 수용 체 4 (TLR4)의 억제를 통해 NEC 개발에 대 한 보호 나타났습니다. 실험 NEC 수식 모유의 보충 감쇠 NEC enterocyte apoptosis의 억제 및 복원 enterocyte 확산 했다 표 피 성장에 의존 하는 방식으로 여로 염증 반응 인자 (EGF) 고 EGFR11. 또 다른 연구에서는 그것은 표시 했다 질 산, 모유의 다른 구성 요소, 분유, 질산염 부족 하 고 NEC에의 증가 주파수에 기여할 수에 비해 장 관류를 변조 하 여 자연 보호에 기여 수식 먹이 유아12,13. 선관위에 대 한 보호에서 포함 되기 위하여 보였다 다른 화합물 모유에 존재 인간의 우유 oligosaccharides, 등 L-아르기닌, 글루타민, lactoferrin14,,1516, 17,,1819. 유 방 우유의 이러한 유익한 요소 NEC의 예방에 있는 그것의 사용의 필요성을 공개 하지만 또한 신호 경로, 및 세포 효과 모유는 선관위에 대 한 보호를 중재 하는 방법에 관련 된 메커니즘의 중요성을 강조 .
진학 하기 위해서는, NEC의 마우스 모델에서 모유의 보호 속성 우리 소설, 사용 하기 쉬운 기술을 개발 모유는 전기 인간 유 방 펌프11,12 사용 하 여 마 취 댐에서 추출 수 있는 마우스에 의해 . 마우스 모유 인수의이 전략이 아니다 유리한, 인간 유 방 펌프 쉽게 사용할 수 있으며 유 방 우유의 조달에 효율적인 뿐만 아니라 종의 유 방 우유 분석을 위해이 방법을 수 있기 때문에 때문에. 결과적으로, 우리 그 표현된 인간의 모유 마우스 유 방 우유의 효과 비교할 수 있습니다 뿐만 아니라 종의 모델에서 우유 은행에서 인간 기증자 우유를 저온 살 균. 이 기술은 NEC 예방으로 그들의 공헌에 관하여 유 방 우유 구성의 연구에 대 한 수 있습니다. 그러나 다른 조사 유 방 우유 추출 방법 개발,, 이러한 기술은 수동는 일반적으로 하나 이상의 연구소 회원20,,2122필요. 여기는 마우스에서 우유를 수집 하는 인간의 전기 유 방 펌프를 수정 하 여 활용할 수 있는 쉬운 기술 제공 됩니다. 이 기술은 또한 다른 종에 적용할 수 있습니다.
가 적절 하 게 신호 경로 NEC와 관련된, 모델 시스템의 질병 과정에 영향을 받을 것으로 알려져 다른 세포 유형 모두 평가 필요 합니다. 여기, 우리가 같은 모델 시스템-enteroids-및 마우스 및 인간의 소장에서 그들의 설립 하나 설명합니다. 인간의 장 enteroids (HIEs)는 혁신, 유전으로 다양 한 비보 전 인간의 모델 위장에서 자리를 차지할 pathophysiological 프로세스의 연구에 도움을 제안 하기 때문에 특히 중요 한 약속를 제공합니다 23. Enteroids 장기 배양 될 발견 되었습니다 나중 사용23, 얼 수 있다 그리고 누구의 문화는 유도할 수 있는 만능 줄기 세포에서 개발 하 고, 인간의 장 Organoids (HIOs), 달리 enteroids 줄기 세포에서 생성 되 고립된 장 지하실24내. Enteroids 유지 일 수 있다25, 신속 하 게 감염 하 고 이후 장 지하실 HIOs23보다 더 분화 된다 쉽게 설정할 수 있습니다. 따라서, HIEs 인간의 위장 상피23의 지역별 구성 및 기능적 속성을 전시 하기 위하여 개발 될 수 있기 때문에 기존 기술을 통해 많은 이점을 제공 합니다. Enteroids 사용 하 여 지역별 제한 및 사용의 용이성에 대 한 준수와 내장의 인간의 모델 필요 때 매우 효과적인 선택입니다. 여기 분리 하 고 기본 줄기 세포 유래 작은 창 자 enteroids 생쥐와 인간의 조산에서 유지 하는 기술을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>4.5g/L 포도당 및 L-글루타민이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N(인슐린)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수( DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 설폰산(HEPES)</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 보충제 마이너스 비타민 A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK 억제제 Y-27632, 디하이드로클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 Wnt3a 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 R-Spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 표피 성장 인자(EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 성장 인자 감소 기저막 매트릭스</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm 세포 배양 페트리 디쉬</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48웰 셀 배양 플레이트</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II 챔버 슬라이드 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; M 멸균 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M 멸균 세포 여과</td>기 <td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청 (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>포토샵 CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 인치 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>시그마 알드리치</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>옥시토신</td><td>시그마 알드리치</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>인간 이중 전기 유축기</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 둥근 바닥 시험관</td><td>코닝</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>고무 마개</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 항체</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 프라이머 F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

유 방 우유 enteroids의 성장을 강화: 세포 증식의 ex vivo 모델

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

인간의 작은 창 자 enteroids는 지하실에서 파생 되 고 줄기 세포 틈새 시장에서 성장 하는 때 모든 상피 세포 유형을 포함. 인간의 enteroid ex vivo 문화 시스템을 설정 하는 기능 모델 장 이상 하 고 특정 세포 응답 관련된 공부에 중요 하다. 최근 몇 년 동안, 쥐와 인간 enteroids 되 고 교양, passaged, 그리고 은행 떨어져 여러 실험실에서 나중에 사용에 대 한 전 세계에 걸쳐. 이 enteroid 플랫폼은 다양 한 치료와 약물의 효과 및 어떤 효과 소장에 다른 세포 유형에가 해지는 테스트를 사용할 수 있습니다. 여기, 신생아 쥐에서 파생 된 기본 줄기 세포 유래 작은 창 자 enteroids를 설정 하기 위한 프로토콜 이며 조 인간의 내장 제공 됩니다. 또한,이 enteroid 문화 시스템 종의 유 방 우유의 효과 테스트에 이용 되었다. 마우스 모유 수정된 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 효율적으로 얻을 수 있다 고 표현된 마우스 우유 추가 연구 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 우리 이제 표현된 마우스, 인간의 효과 입증 하 고 성장 및 enteroids의 확산에 기증자 모유 신생아 쥐 또는 조 인간의 작은 창 자에서 파생 된.

우리는 먼저 인간의 모유를 표현 하는 여부를 조사 하고자 또는 저온 살 균된 기증자 모유 작은 장 enteroids에 영향을 했다. 실제로, 인간 유 방 우유와 모유 기증자 신생아 마우스 (그림 1A)와 조 인간의 파생된 enteroids (그림 1B)의 성장을 증가 했다.
인간의 모유 증가 작은 창 자 enteroids의 성장, 이후 우리는 다음 모유 했다 조 인간 enteroids의 확산에 영향을 조사. 우리 인간의 모유 제어 (B, Ki67, 붉은 얼룩-그림 2A)에 비해 조 숙한 인간 enteroids의 확산을 증가 입증. 중요 한 것은,...

이 프로토콜에서는 쥐에서 우유를 수집 하는 효율적인 방법 뿐만 아니라 신생아 마우스 또는 조 인간의 창 자에서 enteroid 문화 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다.

유 방 우유 Enteroids의 성장을 강화: 세포 증식의 Ex Vivo 모델

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

이 절차의 전반적인 목표는 실험실에서 엔테로이드라고 하는 소형 내장을 배양하는 것입니다. 엔테로이드는 실험실에서 추출한 쥐 모유로 처리하여 모유가 체외 증식에 미치는 영향을 밝힙니다. 이 방법은 미숙아에게 영향을 미치는 괴사성 장염과 같은 다양한 위장 질환과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 장내 상피가 유지 관리가 거의 필요하지 않고 빠르게 확립될 수 있으며 위장 상피의 많은 기능적 특성을 나타낸다는 것입니다. 장내 로이드를 확립하는 이 기술은 인간 소장의 매우 효과적인 모델입니다. 이 방법은 소장에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 위장관의 다른 영역에 있는 다른 장기 시스템에도 적용할 수 있습니다.먼저 가용성 기저막 추출물을 얼음에서 해동합니다. 그런 다음 가위와 집게를 사용하여 안락사된 쥐의 복부 정중선 전체를 수직으로 절개합니다. 겸자를 사용하여 소장을 절제하고 장간막을 제거합니다.소낭선 분리 및 장 생성을 위해 소장을 준비하려면 장을 똑바로 놓고 가위를 사용하여 전체 길이를 따라 세로로 자릅니다. PBS 항생제 혼합물로 채워진 페트리 접시에 집게로 장을 부드럽게 흔들어 대변을 제거합니다. 그런 다음 30ml의 세포 파괴 매체 1번을 50ml 원뿔형 튜브에 추가합니다.장의 반 센티미터 분절을 튜브에 넣고 튜브를 셰이커의 얼음 양동이에 넣습니다. 후드에서 8개의 웰 챔버 슬라이드에 있는 각 웰의 바닥에 9마이크로리터의 기저 멤브레인을 추가합니다. 피펫 팁으로 멤브레인을 빠르게 펴고 기저막이 인큐베이터에서 중합되도록 합니다.기저막을 빠르게 펴서 우물 바닥에 얇은 층을 형성하도록 하는 것이 중요합니다. 기포가 존재하거나 기저막이 너무 두꺼우면 crypts가 부착되지 않습니다. 원뿔형 튜브를 교반한 후 100마이크로미터 스트레이너를 사용하여 멤브레인 조직을 여과하고 관류를 폐기합니다.새로운 50ml 원뿔형 튜브에 30ml의 세포 파괴 매체 2번을 추가한 다음 장 조직을 튜브에 추가합니다. 튜브를 15분 동안 교반한 후 100마이크로미터 스트레이너를 통해 조직을 여과합니다. 이 단계에서 흐름을 유지합니다.새 원뿔형 튜브에 1리터당 포도당 4.5g과 L-글루타민이 함유된 TMEM 15ml를 추가합니다. 100마이크로미터 스트레이너에서 조직을 제거하고 새 원뿔형 튜브에 추가합니다. 그런 다음 튜브를 10초 동안 수동으로 흔들고 100마이크로미터 스트레이너를 통해 여과합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

암 종양 주변 조직뿐만 아니라 로컬 프 및 항 염증 매개 의해 영향 복잡한 질환이다. 따라서, 오히려 피하 모델보다 이방성 주입 모델은 방식으로 더 잘 모방 인간의 병리 암의 진행을 연구하기 위해 유용 할 수 있습니다.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.

유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

이 프로토콜은 30 일 동안 배양 된 마우스 후기 태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관 내에서 빨기 - 투 - 위닝 전이를 모방하는 방법을 설명합니다.

태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관내 빨기-위닝 전환 반복

제시된 프로토콜은 유세포측정을 사용하여 배양된 마우스 장용체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화합니다. 이 방법은 약물 치료가 오르가노이드 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 된다.

엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

이 프로토콜의 목표는 약물 선별 연구에 사용될 수 있는 3D 유방 내피 상양 모델을 빠르게 만들기 위해 사전 형성된 내피 네트워크에 다세포 스페로이드로서 유방 상피 세포를 직접 바이오프린트하는 것입니다.

내피 네트워크에 3D 다세포 유방 스페로이드의 직접 생체 인쇄

유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

이 프로토콜은 태아의 장 조직에서 3 차원 장 모델 인 enteroids의 확립을 자세히 설명합니다. 상피 바이오마커의 면역형광 영상화를 모델 특성화에 사용하였다. 박테리아 내독소인 리포폴리사카라이드의 정점 노출은 미세주입 기술을 사용하여 형광 덱스트란의 누출에 의해 측정된 용량 의존적 방식으로 상피 투과성을 유도하였다.

태아 조직 유래 장내 투과성 테스트

본 연구는 소량의 유방 조직에서 주요 인간 유방 상피 세포(HMEC)를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 더 쉽고 시간을 절약하며 경제적인 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 실험실 및 임상 응용 분야 모두를 위한 1차 HMEC를 신속하게 생산하는 데 적합합니다.

Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

배우세요 유방 우유로 처리한 엔테로이드 배양법을 통해 장 상피 세포 증식을 연구하는 방법을. 이 기술은 신생아 괴사성 장염 등의 소화기 질환 연구에 활용됩니다.

유 방 우유 Enteroids의 성장을 강화: 세포 증식의 Ex Vivo 모델

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