고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

이 절차의 전반적인 목표는 신경 세포 성장에 내포된 동적 구조의 신경돌기를 분석하는 데 필요한 서브마이크로미터 축 분해능으로 체외 신경 세포 부피의 전체 필드 측정을 허용하는 것입니다. 이 방법은 비성장 또는 축삭 변성 동안 보조 규모에서 부피 변화의 역학에 관한 세포 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 완전 맞춤 관찰 및 시간 척도와 결합된 서브마이크로미터 축 분해능을 제공한다는 것입니다.

절차를 시작하려면 화학 후드 아래에 있는 PDMS 블록에 이소프로판올을 부어 분해합니다. 다음으로 후드의 스테인리스 스틸 벤치에 놓습니다. 실리콘 웨이퍼 주위를 절단하고 PDMS 복제본을 탈형합니다.

그런 다음 칩 주위를 자르고 메스나 면도날을 사용하여 2mm의 여백을 남겨 둡니다. 직경 1.5mm의 펀처를 단단히 눌러 흡입구를 펀칭하고 작동시켜 흡입구의 구멍을 자르고 조각합니다. 액체가 주입될 칩의 4개 전용 영역에서도 동일한 작업을 수행합니다.

그런 다음 미세 구조 면에 접착 테이프를 붙이고 벗겨내어 칩을 청소합니다. 양쪽에 이소프로판올을 뿌립니다. 그런 다음 에어 블로우 건을 사용하여 가압 질소로 칩을 건조시킵니다.

이 절차에서는 클린룸 환경에 있는 스핀 코팅기에 각 커버슬립을 놓습니다. 포지티브 포토레지스트 한 방울을 떨어뜨려 커버슬립의 약 75%를 덮고 4000rpm에서 30초 동안 스핀 코팅하여 최종 두께 0.45마이크로미터에 도달합니다. 표면 온도가 섭씨 115도인 핫플레이트에 커버슬립을 1분 동안 놓습니다.

마스크 얼라이너를 사용하여 제작 매개변수에 따라 전용 마스크를 통해 435나노미터 파장의 각 커버슬립을 노출시킵니다. 다음으로, 두 개의 유리 결정화 접시를 준비하는데, 하나는 희석되지 않고 현상액을 포함하고 다른 하나는 탈 이온수를 포함합니다. 커버슬립을 현상액에 하나씩 1분 동안 담그면서 결정화 접시를 지속적이고 부드럽게 저어줍니다.

그런 다음 웨이퍼를 약 5초 동안 탈이온수에 담그십시오. 웨이퍼를 흡수성 종이로 옮기고 에어 블로우 건을 사용하여 가압 질소로 건조시킵니다. PDMS 칩과 PDMS 칩이 결합될 유리 접시를 모두 플라즈마 챔버에 배치하여 표면 활성화를 수행합니다.

다음으로, 직사각형 두께의 현미경 유리 슬라이드에 물 한 방울을 떨어뜨리고 모세관으로 유리 슬라이드에 커버슬립을 붙입니다. 현미경으로 유리 슬라이드 뒤쪽에 있는 포토레지스트 줄무늬의 위치를 표시합니다. 마스크 얼라이너의 마스크 홀더에 패턴 유리 커버슬립을 놓습니다.

포토레지스트 참조 물체를 중앙에 배치하기 위해 만들어진 표시에 의존합니다. 광학 대비를 높이려면 PDMS 칩 아래에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. 실리콘 웨이퍼는 정렬 과정에서 척에 단단히 부착된 상태로 유지되어야 합니다.

그런 다음 PDMS 칩을 마스크 얼라이너의 모바일 기판 홀더에 놓습니다. 그런 다음 기계적 접점 뒤에 있는 동안 커버슬립에 있는 칩과 포토레지스트 스트라이프 배열을 모두 시각화할 수 있을 만큼 척을 들어 올립니다. PDMS 필러의 표면이 유리 커버슬립에 닿을 때까지 척을 들어 올려 정렬을 수행하고 칩과 커버슬립 사이에 기계적 접촉을 달성합니다.

그런 다음 척을 내립니다. 마스크 홀더에서 칩에 결합된 커버슬립을 제거합니다. 그런 다음 장치를 35mm 페트리 접시에 넣고 접착 강도를 높이기 위해 5-10분 동안 모든 것을 오븐에 옮깁니다.

접착 후 30분 후에 PLO 용액으로 채워진 10마이크로리터 피펫 팁을 주입구에 놓습니다. 그런 다음 위에 물방울이 형성될 때까지 액체를 로드합니다. 배출구와 저장소에서 동일한 작업을 반복합니다.

그런 다음 칩 주변의 페트리 접시에 PBS를 추가합니다. 페트리 접시를 파라핀 필름으로 밀봉하고 최소 5시간 동안 실온에서 배양합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터 팁 콘을 각 주입 구멍에 가볍게 누르고 여분의 액체를 빨아 들입니다.

다음으로, PLO와 칩을 둘러싼 PBS를 배양 배지로 교체합니다. 그 후, 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 조절되는 인큐베이터에 칩을 넣고 뉴런이 최소 5시간의 배양 시간으로 시드될 때까지 칩을 놓습니다. 이 절차에서는 칩에서 배양 배지를 추출합니다.

2-3 마이크로리터의 갓 재현탁한 세포 용액을 모아 주입구에 주입합니다. 즉시 콘센트에서 동일한 작업을 반복하십시오. 각 저장소에 거의 동일한 부피의 배양 배지를 주입합니다.

현미경으로 칩을 빠르게 관찰하여 세포의 밀도를 확인하십시오. 최적 셀 밀도의 크기 순서는 4개의 기둥으로 구분된 정사각형 표면 내에서 약 5-10개의 셀에 해당합니다. 목표 세포 밀도에 도달하기 위해 0.5-1 μl의 세포 현탁액을 주입하는 절차를 반복합니다.

이미징을 위해 배양 배지를 이미징 배지로 교체하십시오. 그런 다음 칩을 에피 형광 현미경 아래에 놓습니다. 타임 랩스 실험의 경우 단일 이미지부터 여러 연속 이미지까지 세포 이미지를 획득합니다.

여기에 표시된 것은 보정 포토레지스트 스트라이프와 뉴런의 대표적인 관찰 결과입니다. 더 높은 배율 이미지와 이러한 물체의 단면이 오른쪽에 표시됩니다. 대표적인 신경돌기와 3마이크로미터 높이의 중앙 챔버가 여기에 나와 있습니다.

신경돌기 슬라이스의 부피는 신경돌기 너비의 함수로 계산할 수 있습니다. 그리고 여기 대표적인 성장 원뿔과 3마이크로미터 높이의 중앙 챔버가 있습니다. 그들의 하부 구조는 약 20나노미터의 광학 배경 잡음에서 명확하게 나타납니다.

12마이크로미터 높이의 챔버에 파종된 생명 행위 뉴런의 타임 랩스 관찰은 수십 분의 시간 척도 내에서 성장 원뿔의 수축 및 재활성화 주기를 따릅니다. 이 절차를 시도하는 동안 실리콘 진흙을 제조하기 위해 심층 이온 에칭 장비에 액세스하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 구조화된 유리 커버슬립을 PDMS 칩과 정렬하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 마스터하면 3D로 신경학을 정량화하는 데 재현 가능하게 적용할 수 있습니다. 이 기술은 약리학 분야의 연구자들이 실제 구경의 다양한 약물의 효과를 모두 닫힌 원뿔 모양으로 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 1차 뉴런을 다루기 위해서는 오염과 산산조각이 나지 않도록 많은 주의가 필요하다는 것을 잊지 말자.

인큐베이터 밖에서 보내는 시간을 줄이기 위해 미디어를 변경할 때 항상 부드럽고 빠르게 행동하십시오.