Name: 고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 학습하세요 형광 배제법을 이용한 고해상도 뉴런 볼륨 측정 기술로 PDMS 미세유동 칩에서 배양된 신경세포의 신경돌기 동태를 정밀 분석하는 방법을. 이 기법은 세포 신경과학 연구에 필수적입니다.

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저자는 프로세스 개발 및 장치 제작에 그들의 귀중 한 지원을 위해 하는 ChiLab, 재료 및 마이크로 실험실-Politecnico 디 토리노-교수 C F Pirri, 닥터 M Cocuzza와 박사 S L Marasso의에서 DISAT 인정 하... 우리는 토론 및 이미지 처리에서 지원에 대 한 Quantacell에서 빅터 라신 감사합니다. 우리는 GFP LifeAct 마우스를 제공에 대 한 마우스에 대 한 그들의 지원에 대 한 인 퀴리와 파블로 바 가스와 아나 마리아 레논 (인 퀴리)의 동물 시설에서 이자벨 Grandjean를 마 농 샤 감사. 우리는 형광 배제 방법의 이해에 그들의 도움 인 Langevin 및 Clotilde Cadart, 라 리사 Venkova, Matthieu Piel 인 퀴리-UMR 144에서에서 올리비에 Thouvenin에 감사. 마지막으로, 우리 소에 그들의 지원 위한 인 피에르-질 드 Gennes (CNRS UMS 3750)의 기술 플랫폼을 감사합니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 고급 부여 번호 321107 "첼로,"에 의해 부분적으로 지원 되었다 PSL 대학교 (SwithNeuroTrails 프로젝트), ANR Investissement d'Avenir, IPGG Labex 및 Equipex.

<ol><li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-size+maintenance%3A+universal+strategy+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li>
<li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li>
<li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li>
<li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li>
<li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li>
<li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li>
<li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li>
<li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li>
<li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li>
<li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li>
<li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li>
<li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2053-1591/3/6/065001/pdf">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001(2016).</li>
<li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931706000670">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li>
<li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Götz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li>
<li>abcam. Counting cells using a hemocytometer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2017).</li>
<li>ImageJ. Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017).</li>
<li>ImageJ. 19. Tools. ImageJ User Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html ">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html </a> (2017).</li>
</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

뉴런의 볼륨 이미지 구성 때문에이 세포의 길고 얇은 확장 FXm 기술에 대 한 도전. 이 프로토콜 신경 영상 전용 미세 장치의 동일한 종류의 변종을 설명 합니다.
미세 디자인의 측면, 옆에 목표의 형광 제외 이미징에 대 한 기본 이며 절충 한 측면 해상도 이미지 선명도 의미 합니다. 그것은에 게재 되었습니다 13 챔버 높이 보다 작은 초점의 깊이를 선도 높은 NA 없음을 볼륨 측정의 정밀도 대 한 해로운 영상 초점에서 수행한 및 충분 한 마진의 개체의 윤곽선 사이 남아 있는 경우 nterest 그리고 통합의 경계입니다. 그러나, 초점의 깊이 보다 훨씬 더 높은 상공의 사용 때문에 광자 확산는 부드럽게 이미지 선명도 관심사의 목표의 가장자리를 손상 한다. 3 µ m 높은 챔버의 제조 측면 흐리게이 감소 하 고 매우 잘 정의 된 형광 제외 이미지도 높은 NA를 사용 하 여 제공 (0.8) 40 X 목표 측면 고해상도 신경 분 지를 시각화.
3 µ m 높은 챔버의 경우 칩 조립은 중요 한 단계, 특히 하지만 주의 조작 4.1.2에 설명 된 대로 방지 지붕 붕괴. 이러한 얇은 실에 관련 된 볼륨 비율 높은 표면 또한 시간이 지남에 Dextran 농도의 안정성의 문제를 제기. 우리 보육의 1 박 후는 Dextran의 표면 흡수 했다 무시할 수 확인: PBS에서 Dextran을 교체 후 기둥와 배경 사이의 강도 차이 사이 초기 강도 대비 1000 당 약 1 Dextran의 면 전에 서이 두 영역입니다. 참고 아래쪽 coverslip에 및 PDMS 지붕에 신경 준수 수 있습니다. 이 효과 코팅으로 꽃무늬 coverslips (즉, 우리가 하지 PDMS 챔버 내 접착 분자를 품 어 할 때)를 사용 하 여 따라서 엄격 하 게 지역화 챔버의 바닥에 때 사라집니다.
그렇다 하 고 그들의 도전적인 형태 뉴런 FXm 오히려 적합 한 방법, 즉 dextran endocytosis의 주요 한계 중 하나는 매우 제한 된는 사실 때문에이 셀. 우리 선택 10 kDa 정립에에서 억제 범위 (시간) 어떤 보이는 endocytosis 현상.
결론적으로에 FXm의 개념적 단순 일련의 실험적인 문제는 현재 프로토콜, nanometric PDMS 거칠기 및 미세 챔버 높이, 또는 배경 교정의 흘 수에 대 한 수정에 의해 해결 되었습니다에 의해 균형 PDMS 기둥 사이의 천장입니다. 그러나, 형광 매체 제한에 가까운 미세 챔버를 사용 하 여 효과적인 표면 세포 접착, 또는 중앙에서 소마를 제외 하는 필요성을 절감 하 지원 기둥의 필요성 같은 몇 가지 특정 제약 조건 생성 높은 해상도 관측에 액세스할 수 있는 셀의 영역을 제한 하는 높은 선명도와 신경 확장 관찰 하 약 실. 이 방법의 한 가지 가능한 진화 한 광학 교체 물리적 감 금이를 제거 하는 것입니다. 빛 시트 현미경의 새로운 개발 있습니다 결합 될 advantageously FXm 미래에.

세포질 볼륨의 정확한 지식은 셀 크기 항상성 단 세포 미생물 1 그리고 더 일반적으로 mitotic 세포 2의 문제에 의해 구동 지난 몇 년 동안에서 증가 주목을 받고 있다. 그러나, 셀 볼륨의 질문은 또한 포스트 mitotic 세포는 뉴런 전형적인 예제 구성에 대 한 관련.
볼륨은 참으로 다양 한 스케일과 시간 지점에서 생리 및 병리학 사건의 중요 한 서명 전기 활동 (밀리초 단위) 3 에 돌이킬 수 없는 관련 된 과도 axonal 변형에서 신경 삶에 신경 붓기가 발생 하는 신경 퇴행 성 질병 (인간에서 년간) 4의 무 증상 단계. 그러나, 가장 큰 볼륨의 변화 신경 성장 동안 (고려 유기 체)에 따라 주 또는 일의 중간 시간 규모에서 발생합니다. 뉴런의 확장 하 고 복잡 한 형태는 배수 문제를 제기 셀 크기의 규칙. Axonal 길이 직경 실제로 단단히 규제 vivo에서, 각 신경 유형 5,6값 특정 있습니다.
이러한 문제 vivo에서, 해결 하기 위해 복잡 한 또한 단순화 된 방법으로 해결할 수 있습니다 생체 외에서. 그 목표에 빨리 볼륨 측정 전용 메서드 충분히 성장 역학 (즉 분의 시간 규모에서) 및 호환 관찰 시간 또는 일이 필요 합니다. 여러 가지 방법은 세포 볼륨 시험관에 직접 또는 간접적으로 액세스할 수 년 동안 개발 되었습니다. Confocal 영상에서 셀 재건, 그들 중 하나 이지만이 방법은 약 500 nm 7의 제한 된 축 해상도 표시 하는 동안 빛에 라벨 부착 및 반복 노출 의미. Note 격자 빛 시트 현미경 8라는 더 정교 하 고 최근 방법으로 부분적으로이 두 마지막 단점을 극복할 수 있다는. 원자 힘 현미경 검사 법 사용된 9 되었지만이 검색 방법은 느리고 지루한 본질에 의해. 또한, 육체적 인 접촉을 셀 필요 고려 신경 10의 극단적인 부드러움 측정 방해할 수 있습니다. 다른 세포 유형 11, 하지만 대 한 부적 절 한 확장 뉴런 처럼 접착제 셀 임피던스 또는 공명을 사용 하 여 간접 방법 고용 있다.
가장 유망한 방법 중 하나는 형광 염료로 가득 가까운 챔버에 세포의 제외 된 볼륨의 측정을 기반으로 합니다. 형광 제외 방법 (FXm) 라벨, 필요로 그것의 원리에서 간단 하 고 빠르고, 긴 기간 세포 인구 잠재적으로 하위 광학 축 해상도 광학 이미징 적합 하다. 더 정확 하 게, z에서 해상도 있지만이 궁극적인 해결책을 제한 하는 잡음의 여러 소스 (즉, 세포가 없는 지역에서), 카메라의 동적 범위를 나눈 문화 챔버에 최대 형광 강도에 따라 다릅니다. 이 방법은 매우 강력한 마이그레이션 부착 셀 12 의 볼륨에 따라 또는 철저 하 게 13에 설명 된 대로 포유류 세포의 유사 분열 동안 볼륨 변화 연구 되었습니다. 그러나, 뉴런 FXm 하위 미세 프로세스에 광범위 한 그들의 분파를 고려에 대 한 방법론 문제를 구성 합니다.
선물이 여기 신경 가지와 동적 구조 성장 콘 같은 신경 성장에 관여의 높이와 고정밀 볼륨 액세스를 부드러운 FXm 챔버의 제조를 선도 하는 방법.
실 축 해상도 최적화 하기 위해 측정 하는 개체 보다 비슷한 높이 있어야 합니다. 따라서, 우리는 세 가지 서로 다른 높이의 중앙 측정 챔버 특징 다른 FXm 장치 설계. Neurite 측정에 전념 하는 가장 얇은 (3 µ m 높이):이 낮은 높이 제외 소마는 근처 15 µ m 높은 중간 챔버에 남아. 두꺼운 중앙 챔버 (10과 12 µ m) 전체 세포 성장에 따라 충분히 높다. 장치는 또한 중앙 챔버의 양쪽에 위치한 두 개의 저수지를 포함 한다. 4 개의 주입 구멍 (IH)은 이렇게 구현 하 고 다음과 같이 지정 된다: 입구와 출구 역할 칩, 휴대폰 정지를 반면 다른 두 저수지를 피드.
우리는 알려진된 기하학의 포토 레지스트 구조를 사용 하 여 높이 측정에 대 한 첫 번째 조립된 교정 coverslips가 있다. 우리는 다음 몇 군데 무료 성장 신경, 하지만 또한 형태학 상으로 제한 된 뉴런 접착의 micropatterns에.

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>To perform DRIE</td></tr><tr><td>MJB4 mask aligner</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 photolithography</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Mask aligner</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Photolithography associated to DRIE</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 후드</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 37 &deg; C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 인큐베이터</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence 현미경</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 오븐 65 및 80 &deg; C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>기계적인 조면계</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M 첨필러스 프로파일러</td><td></td></tr><tr><td>광학적인 조면계</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>진공 desiccator</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>직경 200 mm</td></tr><tr><td>초음파 초음파 검사기</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>목욕의 양: 0.8 리터</td></tr><tr><td>핫플레이트</td><td>: Stuart SD162</td>, <td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>Masks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>추가 데이터</td></tr><tr><td>Su8 마스크 1</td><td></td><td></td><td>추가 데이터</td></tr><tr><td>Su8 마스크 2</td><td></td><td></td><td>추가 데이터</td></tr><tr><td>Su8 마스크 3</td><td></td><td></td><td>추가 데이터</td></tr><tr><td>S1805 보정 줄무늬</td><td></td><td></td><td>추가 데이터</td></tr><tr><td><강한>소형 실험실 장비</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mm 구멍 펀처</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519(미국 참조)</td><td></td></tr><tr><td>메스 또는 면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9인치 스테인리스 스틸 플랫 주걱(스푼 포함</td>) <td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>PDMS</td></tr> <tr><td>탈형상단 립 웨이퍼 처리</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>곡선 핀셋</td><td>FST</td><td>Dumont # 7 집게 - 표준 / Dumoxel</td><td>유리 커버 슬립을 조작하기 위해</td></tr><tr><td>< 강력 > 기판 < / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm 유리 커버 슬립</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>Photoresists and developpers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 positive photoresist</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>DRIE 공정 전에 thicknes 1.8 &micro; m</td></tr><tr><td>AZ 351B 개발자</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>포지티브 AZ 1518 포토레지스트</td></tr><tr><td>SU-8 개발 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA 개발자</td><td>기술</td><td></td><td>SU-8 네거티브 포토레지</td></tr>스트 <tr><td>Microposit S1805 레지</td>스트 <td>Chimie 개발 기술 서비스</td><td></td><td>: 0.5&micro를 얻는 데 사용되는 포지티브 포토 레지스트; m 고층 구조</td></tr><tr><td>MF 26A 개발자</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>포지티브 S1805 포토레지스트</td></tr><tr><td><강>실험실 소모품</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 피펫 개발 3mL</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 페트리 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>20mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>투명 스카치 테이프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스퀘어 와이프</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>플라스틱 파라핀 필름</td></tr><tr><td><강한>화학</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-메타크릴옥시프로필)트리클로로실란</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 및 경화제 Sylgard 184</td><td>시그마 알드리치</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>폴리 오르니틴</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4957 - 50mL</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>시그마 알드리치</td><td>02865</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>3-메타크릴옥시프로필-트리메톡시실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6514-25ML</td><td>(C4H5O2)-(CH2)3-Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 10kW와 Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absoprtion, 488nm에서</td></tr><tr><td>Dextran 10kW와 Alexa647</td><td>LifeTechnologies와 결합 - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absoprtion at 647 nm</td></tr><tr><td>Culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산 GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드가 없는 Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Routine in Matlab for background normalization</td><td>Quantacell</td><td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>에 대한 특정 ROI를 선택하려면 이미지 분석</td></tr><tr><td>루틴</td><td>ImageJ</td><td></td><td>보충 데이터</td></tr><tr><td>루틴</td><td>Matlab</td><td></td><td>보충 데이터</td></tr></tbody></table>

고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

볼륨은 다른 시간의 척도에 신경 세포의 생리 및 병리학 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. 신경은 그들의 확장된 없는 형태학에 관한 매우 독특한 셀 고 따라서 볼륨 측정에 대 한 여러 방법론 도전을 모집. 신경 성장 체 외에서 의 특별 한 경우 선택한 방법론 하위 미세 축 해상도 전체 필드 관찰 시간 또는 일 분에서 시간의 척도에 함께 포함 되어야 합니다. 셀 모양 재건 confocal 영상, 전기 기반 측정 또는 원자 힘 현미경을 사용 하 여 같은 다른 방법과 달리 최근에 개발 된 형광 제외 방법 (FXm) 이러한 과제를 수행 하기 위해 잠재력이 있다. 그러나, 그것의 원리에서 간단한 되 고, 있지만 신경에 대 한 고해상도 FXm 구현의 여러 조정 및 전용된 방법론 필요 합니다. 선물이 여기 형광 제외, 낮은 거칠기 다중 구획 미세 장치, 그리고 마지막으로 로컬 신경 볼륨의 생체 외에서 측정을 달성 하기 위해 micropatterning의 조합에 따라 하는 방법. 장치에서 제공 하는 높은 해상도 사용 하 여 신경 프로세스 (neurites)의 로컬 볼륨 및 볼륨 성장 콘 (Gc) 같은 신경 성장에 관련 된 몇 가지 특정 구조의 측정 수 있었습니다.

섹션 1과 2에에서 설명 된 제조 과정의 결과 그림 1A의 이미지에 의해 설명 된다-1B 및 그림 1C의 곡선. 그림 1D 의 PDMS 칩, 즉 중앙에서과 20 µ m 높은 다음 중간 챔버의 2 개의 다른 대표 지역의 거칠기 값을 표시합니다. 약 7 배 거칠기 감소 수-8 포토 레지스트 대신 에칭된 Si 웨이퍼를 사용 하 여 얻은 되었습니다. 다음, FXm 10 µ m 높은 챔버 내에서 알려진된 형상 (그림 2A)의 감광 스트라이프에 적용 처음 했다. 이미지 처리 및 강도 높이 변환 후 ( 그림 2B의 그래프 참조),이 스트라이프 (그림 2C) 따라 횡단면에 FXm 프로필 원하는 높이 프로필 (그림 2D) 제공. 그림 2D 기계 profilometry 및 FXm 메서드를 사용 하 여 얻은 프로필 간의 비교를 보여 줍니다. 가장자리와 고원 값을 포함 하 여 이러한 프로필은 매우 유사 하 고, 메서드를 유효성 검사. FXm 데이터의 분산 더 그림 3 및 그림 4, 평가 방법의 궁극적인 해상도의 대표는 하지만 결과 낮은 강도에서 매우 약한의 가능한 효과 피하기 위해 고용 자동-감광 GFP 채널에서의 형광.
그런 다음, 3 µ m에 10 µ m 높은 챔버 (그림 3) neurites를 관찰합니다. 배경 잡음의 표준 편차는 약 18 nm 강도 높이 변환 및 배경 개정 후. 이 값은 실제 실리콘 표면에 casted PDMS 표면 거칠기 보다 약간 더 높은 (12 nm, 그림 1D의 표 참조) 수 8 금형에서 얻은 PDMS에 측정 하는 거칠기 보다 훨씬 낮은 하지만. 이러한 결과 기둥을 쓰-8 포토 레지스트로 구멍을 열고 보다는 실리콘 웨이퍼에 우물을 시추의 부가 가치를 강조 표시 합니다. 이러한 낮은 값 그림 3A에 표시 된 것 같은 볼륨에서 높은 신호를 잡음 비율과 매우 명확한 이미지를 수 있습니다. 그러한 이미지에서 검색할 수 있는 데이터의 예를 들어, 우리는 1.6 µ m (즉, 10 픽셀) 넓은 neurite 볼륨 계산 슬라이스 ( 그림 3B의 그래프 참조). 약 400의 평균 neurite 높이 가치를 제공를 사용 하 여 첫 번째 근사에서 이러한 데이터의 선형 적합 nm, 비교 예 10 일 신체 callosum 5내의 오래 된 새끼 있는 500 nm axonal 직경. 우리 또한 함께 FXm 접착 직렬 abutted 2 µ m와 6 µ m 길이에서 30 µ m의 넓은 줄무늬의 구성의 micropatterns. 우리의 목표는 3D 모양에 neurite 폭의 영향을 연구 했다. 그림 3C 3D 표현 10 µ m 높은 상공에서 얻은 이미지를 전체 신경의 잘못 된 색상 표시 합니다. Soma는 큰 줄무늬의 말단에 위치 하 고 있습니다 반면 Neurites 2 µ m와 6 µ m 넓은 줄무늬에 퍼지고 있다. 높이 프로 파일은 세 가지 다른 횡단면에 당겨 졌다. 그림 3A에 표시 하는 그래프와 일관성, 표면 (그림 3D) neurite 폭 횡단면 증가 이상의 통합.
우리는 또한 성장 콘 (GC) 3D 구조에 집중 했다. 그림 4 A B 두 가지 GC 프로필 3 µ m 높은 상공에는 그들의 분기 하위 구조를 강조 표시 합니다. 또한, 우리는 12 µ m 높은 상공에서 Gc의 볼륨의 역학에 따라 시간 경과 실험을 수행. 그림 4C 축소의 주기 및 몇 분의 시간 규모에서 주어진된 GC의 재 활성화를 표시합니다. GFP lifeact 마우스를 사용 하 여, 덕분에 성장 콘 GFP 방출 파장에 현지 했다 (510 nm) 그들의 높은 걸 집중에서. 파장에서 식별 하는 표면 647에서 dextran 방출 파장에 통합 하는 데 사용 되었다 GC 볼륨을 계산 하는 nm. 그림 4D 마침내 약 6 µ m3의 값을 중심으로 3 개의 다른 뉴런에 다른 시간 지점 및 위치에서 GC 볼륨의 분포가 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> 그림 1: FXm PDMS 챔버. (A)는 4 개의 다른 단계 최종 금형에 지도 제작의의 음모. 입구, 출구 및 저수지의 위치 표시 됩니다. 스케일 바: 1 mm. (B) 광 profilometer를 사용 하 여 얻은 PDMS FXm 챔버의 이미지. 이 이미지는 10 µ m 높은 기둥의 3 행과 20, 50, 90 µ m 높이 중간 챔버를 포함 하는 중앙 챔버를 보여줍니다. 눈금 막대: 500 µ m. (C) (B)에 그려진 두 개의 점선 따라 칩의 횡단면 뷰. 옐로우/골드: 기둥, 블루 따라 횡단면: 기둥 사이의 횡단면. (D) PDMS 거칠기의 값 측정 50 × 50 µ m2 지역에 실리콘 성형 20 µ m 높은 수-8 중간 챔버에 의미 (이 분야의 위치에 대 한 화살표 참조). 평균 값은 세 가지 영역 측정에서 얻은 했다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> 그림 2: 감광 제 스트라이프를 사용 하 여 관심의 대상으로 FXm 방법의 교정. (A)는 10 µ m 높은 상공에서 찍은 GFP 형광 이미지 가득한 10000 MW dextran 488에서 흡수 1 mg/mL에서 nm. (B: 배경, p: 기둥)입니다. 건조 40 X 나 0.8 목표 관찰. 눈금 막대: 50 µ m. (B) 선형 보정 법칙은 두 색된 사각형 (A)에 표시 된 파란색 파선의 수준에서 얻은 대답 (C) 형광 강도 프로필에 표시는 포토 레지스트 교차의 평균 강도에서 얻은 스트라이프 (0.45 μ m 높은 긍정적인 감광 제)입니다. (D) (B) (파란색 점)의 데이터의 높이 변환 강도 후 기계 profilometer (검은 점) 및 FXm에서 얻어진 프로 파일의 비교. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> 그림 3: Neurite 볼륨 이미징. (A) Neurite 다음 15 µ m 중간 챔버에 위치한 소마에서 중앙 3 µ m 높은 챔버로 확장. 488에서 10000 MW dextran 흡수를 사용 하 여 수행 하는 이미징 및 40 X, 나 0.8 건조 목표. 인세트 두 neurites와 오른쪽에 그래프를 선택한 배경 감소 일상적인 하이라이트의 사용 후 얻은. 스케일 바: 30 µ m. (B) Neurite 슬라이스 볼륨 neurite 폭의 기능으로 (A)에 표시 된 22 프로필 (평균 10 픽셀, 즉 1.6 µ m "neurite 조각"에)에서 얻은. 실선은 슬로프 0.4 µ m 원점 통과의 선형 적합을 나타냅니다. (C) 접착 부분에 꽃무늬 신경의 거짓 컬러 이미지 연속 2 µ m와 6 µ m 넓은 젊고 아름 다운 여자 (흰색에서 표현) 했다. 647에서 흡수 10000 MW dextran 가득 10 µ m 높은 상공에서 측정 되었다 및 40 x 나를 사용 하 여 0.8 건조 목표. ((D)) 높이 프로 파일에 해당 하는 색된 점선된 라인 (C)에 표시 된 동일한 색상 코드를 유지. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> 그림 4: 정적 및 동적 성장 콘 영상. (A-B) 성장 원뿔 높이 프로 파일 관련된 이미지에 표시 된 노란색 라인을 따라 높이 변환 강도 후 3 µ m 높은 상공에서 얻은. 10000 MW dextran 488에서 흡수와 채우기를 사용 하 여 수행 하는 관측 및 40 X, 나 0.8 건조 목표. (C) 전체 신경 영상 12 µ m 높은 상공에 가득 10000 MW dextran 647에서 흡수 nm. 관찰 두 가지 형광 채널 변경: 성장 콘 지역화 (노란 점선), 및 형광 제외에서 GC 볼륨 계산 CY5 GFP. 파선 노란색으로 포함 하는 표면 GC 볼륨을 계산 하기 위해 사용 되었다. 그래프는 두 대표 다른 시간 지점에서 GFP와 CY5 채널에 시간, 및 관련 된 형태학 GC 볼륨의 변화를 보여줍니다. 모든 데이터는 40 x 나를 사용 하 여 인수 했다 0.8 건조 목적은 모든 3 분 스케일 바: 10 µ m. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>1:8 µ m 레이어 마스크</td>
			<td>마스크 2시 30분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 rpm</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 6 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 에너지</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 6 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>2 분 30 초</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 사진 평판 단계 12 μ m 높이 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 20, 50, 90 µ m.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>마스크 1시 10분 µ m 층</td>
			<td>마스크 2시 30분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s 1500 rpm @</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 6 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 에너지</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 6 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>2 분 30 초</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 사진 평판 단계 높이에서 10 μ m의 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 20, 50, 90 µ m.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>마스크 1시 12분 µ m 층</td>
			<td>마스크 2시 32분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
			<td>30 s 2500 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 5 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 시간</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 5 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>3 분</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 사진 평판 단계 높이에서 3 μ m의 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 18, 50, 90 µ m.
추가 데이터 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. PDMS 장치 (DRIE 마스크와 마스크 1-3)를 조작 하는 데 사용 하는 마스크의 개요 보기. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 2: 파일 "masks_neuron_volume_chips.dxf". 전자 파일 조작 DRIE 마스크와 마스크 1-3 하 수 있도록 합니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 3: "Mask_Photoresist stripes.dxf". 전자 파일 레지스트 줄무늬의 포토 리소 그래피에 사용 되는 마스크를 조작 수 있도록 합니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 4: 파일: conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 5: 파일: importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

볼륨은 세포의 생리 및 병리학 적 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. Neurites 및 신경 성장에 동적 구조 분석에 필요한 하위 미세 축 분해능으로 생체 외에서 신경 볼륨의 전체 필드 측정을 허용 하는 형광 제외 방법을 설명 합니다.

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

이 절차의 전반적인 목표는 신경 세포 성장에 내포된 동적 구조의 신경돌기를 분석하는 데 필요한 서브마이크로미터 축 분해능으로 체외 신경 세포 부피의 전체 필드 측정을 허용하는 것입니다. 이 방법은 비성장 또는 축삭 변성 동안 보조 규모에서 부피 변화의 역학에 관한 세포 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 완전 맞춤 관찰 및 시간 척도와 결합된 서브마이크로미터 축 분해능을 제공한다는 것입니다.절차를 시작하려면 화학 후드 아래에 있는 PDMS 블록에 이소프로판올을 부어 분해합니다. 다음으로 후드의 스테인리스 스틸 벤치에 놓습니다. 실리콘 웨이퍼 주위를 절단하고 PDMS 복제본을 탈형합니다.그런 다음 칩 주위를 자르고 메스나 면도날을 사용하여 2mm의 여백을 남겨 둡니다. 직경 1.5mm의 펀처를 단단히 눌러 흡입구를 펀칭하고 작동시켜 흡입구의 구멍을 자르고 조각합니다. 액체가 주입될 칩의 4개 전용 영역에서도 동일한 작업을 수행합니다.그런 다음 미세 구조 면에 접착 테이프를 붙이고 벗겨내어 칩을 청소합니다. 양쪽에 이소프로판올을 뿌립니다. 그런 다음 에어 블로우 건을 사용하여 가압 질소로 칩을 건조시킵니다.이 절차에서는 클린룸 환경에 있는 스핀 코팅기에 각 커버슬립을 놓습니다. 포지티브 포토레지스트 한 방울을 떨어뜨려 커버슬립의 약 75%를 덮고 4000rpm에서 30초 동안 스핀 코팅하여 최종 두께 0.45마이크로미터에 도달합니다. 표면 온도가 섭씨 115도인 핫플레이트에 커버슬립을 1분 동안 놓습니다.마스크 얼라이너를 사용하여 제작 매개변수에 따라 전용 마스크를 통해 435나노미터 파장의 각 커버슬립을 노출시킵니다. 다음으로, 두 개의 유리 결정화 접시를 준비하는데, 하나는 희석되지 않고 현상액을 포함하고 다른 하나는 탈 이온수를 포함합니다. 커버슬립을 현상액에 하나씩 1분 동안 담그면서 결정화 접시를 지속적이고 부드럽게 저어줍니다.그런 다음 웨이퍼를 약 5초 동안 탈이온수에 담그십시오. 웨이퍼를 흡수성 종이로 옮기고 에어 블로우 건을 사용하여 가압 질소로 건조시킵니다. PDMS 칩과 PDMS 칩이 결합될 유리 접시를 모두 플라즈마 챔버에 배치하여 표면 활성화를 수행합니다.다음으로, 직사각형 두께의 현미경 유리 슬라이드에 물 한 방울을 떨어뜨리고 모세관으로 유리 슬라이드에 커버슬립을 붙입니다. 현미경으로 유리 슬라이드 뒤쪽에 있는 포토레지스트 줄무늬의 위치를 표시합니다. 마스크 얼라이너의 마스크 홀더에 패턴 유리 커버슬립을 놓습니다.포토레지스트 참조 물체를 중앙에 배치하기 위해 만들어진 표시에 의존합니다. 광학 대비를 높이려면 PDMS 칩 아래에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. 실리콘 웨이퍼는 정렬 과정에서 척에 단단히 부착된 상태로 유지되어야 합니다.그런 다음 PDMS 칩을 마스크 얼라이너의 모바일 기판 홀더에 놓습니다. 그런 다음 기계적 접점 뒤에 있는 동안 커버슬립에 있는 칩과 포토레지스트 스트라이프 배열을 모두 시각화할 수 있을 만큼 척을 들어 올립니다. PDMS 필러의 표면이 유리 커버슬립에 닿을 때까지 척을 들어 올려 정렬을 수행하고 칩과 커버슬립 사이에 기계적 접촉을 달성합니다.그런 다음 척을 내립니다. 마스크 홀더에서 칩에 결합된 커버슬립을 제거합니다. 그런 다음 장치를 35mm 페트리 접시에 넣고 접착 강도를 높이기 위해 5-10분 동안 모든 것을 오븐에 옮깁니다.접착 후 30분 후에 PLO 용액으로 채워진 10마이크로리터 피펫 팁을 주입구에 놓습니다. 그런 다음 위에 물방울이 형성될 때까지 액체를 로드합니다. 배출구와 저장소에서 동일한 작업을 반복합니다.그런 다음 칩 주변의 페트리 접시에 PBS를 추가합니다. 페트리 접시를 파라핀 필름으로 밀봉하고 최소 5시간 동안 실온에서 배양합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터 팁 콘을 각 주입 구멍에 가볍게 누르고 여분의 액체를 빨아 들입니다.다음으로, PLO와 칩을 둘러싼 PBS를 배양 배지로 교체합니다. 그 후, 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 조절되는 인큐베이터에 칩을 넣고 뉴런이 최소 5시간의 배양 시간으로 시드될 때까지 칩을 놓습니다. 이 절차에서는 칩에서 배양 배지를 추출합니다.2-3 마이크로리터의 갓 재현탁한 세포 용액을 모아 주입구에 주입합니다. 즉시 콘센트에서 동일한 작업을 반복하십시오. 각 저장소에 거의 동일한 부피의 배양 배지를 주입합니다.현미경으로 칩을 빠르게 관찰하여 세포의 밀도를 확인하십시오. 최적 셀 밀도의 크기 순서는 4개의 기둥으로 구분된 정사각형 표면 내에서 약 5-10개의 셀에 해당합니다. 목표 세포 밀도에 도달하기 위해 0.5-1 μl의 세포 현탁액을 주입하는 절차를 반복합니다.이미징을 위해 배양 배지를 이미징 배지로 교체하십시오. 그런 다음 칩을 에피 형광 현미경 아래에 놓습니다. 타임 랩스 실험의 경우 단일 이미지부터 여러 연속 이미지까지 세포 이미지를 획득합니다.여기에 표시된 것은 보정 포토레지스트 스트라이프와 뉴런의 대표적인 관찰 결과입니다. 더 높은 배율 이미지와 이러한 물체의 단면이 오른쪽에 표시됩니다. 대표적인 신경돌기와 3마이크로미터 높이의 중앙 챔버가 여기에 나와 있습니다.신경돌기 슬라이스의 부피는 신경돌기 너비의 함수로 계산할 수 있습니다. 그리고 여기 대표적인 성장 원뿔과 3마이크로미터 높이의 중앙 챔버가 있습니다. 그들의 하부 구조는 약 20나노미터의 광학 배경 잡음에서 명확하게 나타납니다.12마이크로미터 높이의 챔버에 파종된 생명 행위 뉴런의 타임 랩스 관찰은 수십 분의 시간 척도 내에서 성장 원뿔의 수축 및 재활성화 주기를 따릅니다. 이 절차를 시도하는 동안 실리콘 진흙을 제조하기 위해 심층 이온 에칭 장비에 액세스하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 구조화된 유리 커버슬립을 PDMS 칩과 정렬하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술을 마스터하면 3D로 신경학을 정량화하는 데 재현 가능하게 적용할 수 있습니다. 이 기술은 약리학 분야의 연구자들이 실제 구경의 다양한 약물의 효과를 모두 닫힌 원뿔 모양으로 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 1차 뉴런을 다루기 위해서는 오염과 산산조각이 나지 않도록 많은 주의가 필요하다는 것을 잊지 말자.인큐베이터 밖에서 보내는 시간을 줄이기 위해 미디어를 변경할 때 항상 부드럽고 빠르게 행동하십시오.

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

형광 염료의 역행 전송 해부학 적 투사에 따라 신경 세포의 하위 인구 레이블. 레이블 축삭은 시각적 대상이 될 수...

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 - 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리​​ photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다.

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

이 프로토콜 문화 분류 기본 murine 뉴런을 플라스틱 칩의 사용을 설명 합니다. 이 칩은 소, 사용자 친화적인, 고해상도와 호환, 라이브, 그리고 형광 영상. 이 프로토콜에서는 이러한 칩 내 쥐 hippocampal 신경 격판덮개 유체 절연, axotomy 및 immunostaining을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

Compartmentalizing 기본 Murine 뉴런에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

학습하세요 형광 배제법을 이용한 고해상도 뉴런 볼륨 측정 기술로 PDMS 미세유동 칩에서 배양된 신경세포의 신경돌기 동태를 정밀 분석하는 방법을. 이 기법은 세포 신경과학 연구에 필수적입니다.

고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

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