Name: 시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 태아와 성인 심장 조직의 3D 디셀룰라라이제이션 방법을 통해 세포외기질(ECM) 특성을 비교 분석하는 기술입니다. 이 방법은 심혈관 질환 연구와 조직 공학에 활용됩니다.

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저자는 관련 중요 한 토론에 대 한 핀 토-마-Ó 연구소의 모든 구성원에 게 빚을. 이 작품 프로젝트 "CARDIOSTEM 설계 심장 조직 및 심장 혈관 응용 프로그램에 대 한 줄기 세포 기반 요법" 아래 프로그램이 MIT Fundação 파라 과학 전자 기술 (FCT)에 의해 지원 되었다 (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. [SFRH/BD/88780/2012] FCT 화목의 받는 사람 이며 M.J.O.은 FCT 동료 (FCT 탐정 2012).

I3S 동물 윤리 위원회 및 Direção Geral 드에 의해 설명 하는 모든 방법론 승인 했다 Veterinária (DGAV)와 따라 유럽 의회 지침 2010/63/유럽 연합.
1입니다. decellularization 솔루션의 준비
참고: 모든 decellularization 솔루션 0.22 μ m 멤브레인 필터를 통해 필터링 해야 하 고 제외 하 고 3 개월의 최대 저장 지정 그렇지 않으면.
<ol><li>1 x pbs: NaCl, 나2HPO4 KCl, 200 밀리 그램의 1.01 g 8 g을 혼합 및 이온된 물 (디)의 900 mL와 함께 KH2포4 의 200 밀리 그램. 1 나 필터, 압력솥, 그리고 게 실 온 (RT)에서 솔루션에 최대 해결책 pH 7.5 및 최종 솔루션 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>소형 버퍼 (10 mM Tris, 0.1 %EDTA)에 대 한: 1.21 g의 TrisBASE와 이온된 물 900 mL에 EDTA의 1 g을 분해. 솔루션에 pH 7.8 NaOH/HCl와를 및 1 나 필터를 최종 솔루션 볼륨 조정, 압력솥에 의해 소독 하 고 실시간 저장</li>
	<li>0.2 %SDS 솔루션 (0.2 %SDS, 10 mM Tris): 디 물 400 mL에 0.6 g의 TrisBASE와 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 1 g을 추가 하 고 60 ° C에서 완전 한 용 질 해산 때까지 저 어. 솔루션 실시간 조정 솔루션 pH 7.8 하 고 최종 솔루션 볼륨 500 mL을 진정 하자. 여과 하 여 솔루션을 소독. 참고: SDS 솔루션 사용 하기 전에 준비 되어야 한다. 필터 솔루션만 후 SDS 해산 완료, 그렇지 않으면 SDS 불용 성 입자 필터, 최종 SDS 농도 변경 하 고 따라서 조직 decellularization 효율성에 영향을 미치는 포화 됩니다.</li>
	<li>침투성 워시 버퍼 (10 mM Tris): 믹스 디 900 mL에 TrisBASE의 1.21 g 물. 솔루션에 pH 7.8 및 1 나 필터를 최종 볼륨 조정, 오토 클레이 브에서 소독 하 고 실시간 저장</li>
	<li>DNase 치료 (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): 2.42 g TrisBASE의와 디 물 900 mL에 1 M MgCl2 의 2 개 mL를 분해. 7.8 pH와 최종 솔루션 볼륨 1 나 필터를 조정 하 고 압력솥에 의해 솔루션을 소독. 실시간 추가 DNase에서 솔루션을 저장 나 (50 U/mL)을 사용 하기 전에.</li>
	<li>DNase 대 나 재고 솔루션: 50% 글리세롤, 20 mM Tris HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2를 포함 하는 DNase 버퍼를 준비 하 고 디 물 10 mL의 최종 솔루션 볼륨 조정. 층 류 두건에서 DNase 버퍼에 파우더와 섞어 부드럽게 완전 한 해체까지 DNase를 추가 합니다. 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 소독. 1 mL aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장</li>
</ol>2. 조직의 채취 및 cryopreservation
<ol><li>CO2 질을 통해 임신 (E18 태아)의 18 일 성인 임신 여성을 안락사. 수술 시저와 함께 여성에 제왕 섹션을 수행 하 고 곡선된 팁 (경적 양끝을 한 트위터)와 두 개의 톱니 모양의 핀셋을 사용 하 여 차가운 1 x PBS와 페 트리 접시에 태아 쥐 베어링 자 궁 뿔을 수집 합니다.<ol>
<li>자 궁 뿔 및 분리는 태아를 양수 sac를 엽니다. 그들을 anesthetize 하는 시저와 함께 목을 벨 얼음 1 x PBS 가진 새로운 배양 접시에는 태아를 전송.</li>
		<li>7-8 주 오래 된 남성 C57BL/6 마우스 사용 하 여 CO2 질 안락사 각 마우스 가슴에 절 개를 수행 하 고 마음을 수집 합니다.</li>
		<li>짧게 씻어 얼음 감기 1 x PBS 가진 태아 및 성인 마음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>메스의 도움으로 성인 심장의 심 방 제거 합니다. 우 심 실에 절 개를 수행 하 고 바로 작은 위를 사용 하 여 그것을 제거. 심장 제거 하 여 좌 심 실 내부 벽을 노출 합니다. 새로운 페 트리 접시에 2 m m 두께와 좌 심 실 무료-벽에 경도 스트립을 분할 하 고 젖꼭지 근육 곡선 팁 메스와 톱니 모양의 핀셋을 사용 하 여 제거.<ol>
<li>소비 세 작은 조직 explants 2mm x 2mm 눈금 (자세한 설명 보충 그림 15에)를 사용 하 여 메스의 도움으로. 간단히 1 x PBS 가진 조직 explants 린스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>압력가 1.5 mL microcentrifuge 튜브 복합 최적의 절삭 온도 (10 월)의 ~ 250 µ L를 추가 합니다. 10 월의 250 µ L 튜브를 전체 태아 심 혼 그리고 성인 심장 explants 전송 및 드라이 아이스 냉각 isopentane 그리고-80 ° C (최대 6 개월)에 게 그들을 동결. 참고: 심장 조직 explants 6 개월 이상 cryopreserved를 사용 하 여 decellularization 효율성, 특히 성인 심장 조직 explants 줄일 것 이다.</li>
</ol>3. 조직 decellularization
참고: 심장 조직 decellularization 잘 당 하나의 샘플 24-잘 조직 배양 접시에서 수행 됩니다. 각 decellularization 솔루션의 1 mL는 잘 각 개인에 추가 됩니다. 그렇지 않으면 지정 하지 않으면 모든 decellularization 단계 165 rpm (20 m m의 궤도 직경 인큐베이터 통)와 25 ° C에서 동요와 함께 수행 되어야 한다. 자세한 내용은 그림 1A에 구성표를 참조 하십시오. 암포 B (예: fungizone) 및 gentamicin은 갓에 추가 2.5 μ g/mL, 0.01 μ g/mL의 최종 농도를 사용 하기 전에 모든 decellularization 솔루션 각각. Decellularized 조직, decellularization 프로토콜을 시작 하기 전에 결정 될 샘플 대량 요구 내에서 유지 하는 DNA의 양을 계량 하. DNA 정량화 프로토콜 추가에 대 한 자세한 섹션 5.1입니다.
<ol><li>
제 1 일
	<ol>
<li>-80 ° C 냉장고에서 조직 샘플을 제거 합니다. 유지 1.5 mL 튜브 microcentrifuge RT 10 월 되 면 부분적으로 녹을 때까지 합니다. 1 x PBS와 페 트리 접시에 여전히 냉동의 심장 조직 블록을 전송 합니다.</li>
		<li>OCT 녹아 심장 조직 1 x PBS 가진 새로운 배양 접시에 이동. 워시 샘플 60 rpm 10-15 분에 대 한 셰이 커와에서 PBS x 1에 두 번 이상 반복합니다.</li>
		<li>살 균 24-잘 조직 배양 플레이트의 당 소형 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 집게의 도움으로 잘 당 하나의 샘플을 전송 합니다.</li>
		<li>25 ° C에서 인큐베이터 셰이 커를 예제와 함께 24-잘 조직 배양 플레이트를 이동 하 고 소형 버퍼 18 h 부 화를 시작.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제 2 일
	<ol>
<li>1.3 섹션에 설명 된 대로 0.2 %SDS 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>소형 버퍼를 발음 하 고 1 x PBS와 샘플 1 h. 반복 3 번 세척. 참고: 일시 중지 포인트: decellularization에서 조직 18 h 정적 조건에서 4 ° C에서 1 x PBS에 보관 하실 수 있습니다.</li>
		<li>1 x PBS를 제거, 잘 당 갓 만든된 SDS 솔루션 (1.3 단계)의 1 mL을 추가 하 고 24 시간에 대 한 샘플을 품 어. 참고: (체크 포인트) 게시물 SDS 인큐베이션 샘플 반투명 외관 백색 전시를 확인. 이 단계에서 SDS 처리 샘플 젤라틴 모양의 일관성을 보여주는 DNA에 젖어 있다. 피 펫 팁을 샘플 접착 하지 않으려면 천천히 SDS 솔루션을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제 3 일
	<ol>
<li>20 분 반복 3 번 소형 워시 버퍼 (우물 당 1 mL) 샘플을 씻으십시오. 참고:이 단계에서 그것은 정상 세포 잔재의 제거로 인해 샘플 크기 감소를 관찰 하는 것. 일시 중지 포인트: 조직 decellularization에서 보관할 수 있습니다 소형 워시 버퍼에 18 h 정적 조건에서 4 ° C에서.</li>
		<li>잘 당 DNase 치료 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 품 어</li>
		<li>DNase 치료 솔루션을 발음 하 고 20 분 반복 3 번에 대 한 샘플 1 x PBS (우물 당 1 mL)을 씻어. RT와 60 rpm에서 떨고 하룻밤 1 x PBS (우물 당 1 mL)으로 최종 세척을 수행 합니다.</li>
		<li>(체크 포인트) DNase 치료 후 decellularized 샘플 젤라틴 모양의 일관성을 잃 었 확인 합니다. 참고: DNase 치료 후 제거 하 고 추가 1 x PBS 부드럽게 샘플을 쉽게 침투 하 고 피 펫 팁에 연결 된 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. decellularized 조직 세포 제거의 평가
<ol><li>실시간에 2.5-3 h에 대 한 0.03% 수성 오신와 갓 만든된 10% 포 르 말린 중립 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 24-잘 조직 문화 접시, 잘, 당 1 샘플에에서는 샘플 수정 참고: 오신 decellularized 조직 얼룩을 단면화 및 조직학 얼룩 동안 샘플 시각화를 쉽게 정착 액에 추가 됩니다. 어느 방해 조직학 얼룩도 면역 형광 검사 기술로 오신의 추가. 또는, 고정에서 수행할 수 있습니다 하룻밤 4 ° c.</li>
	<li>통 솔루션을 제거 하 고 씻어 샘플 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 일회용 비닐 견본 몰드를 사용 하 여 조직학 처리 젤에 고정 된 bioscaffolds를 캡슐화 합니다.</li>
	<li>뚜껑 생 처리/포함 카세트 형 및 전송에서 포함 된 샘플 조직학 젤을 제거 합니다. 참고: 조직 조직학에서 포함 및 젤 처리 대신 작은 구멍으로 두 생 스폰지에 각 샘플을 처리 하는. 샘플 검색 사용 하려면 생 스폰지의 중심을 지역화 해야 합니다. 메모의 일부 샘플이이 접근을 사용 하 여 지역화 하려면 어려울 수 있습니다.</li>
	<li>Isoparaffinic 지방 족 탄화수소 솔루션 (2 화 역) (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), 알코올 농도의 시리즈에 연속 외피 솔루션 마다 (30 분)를 통해 포함 하는 파라핀 파라핀 (2 부 화에 대 한 샘플 처리 56 ° c.에 역)</li>
	<li>파라핀 블록에 샘플을 탑재 합니다.</li>
	<li>톰에 3 μ m 두께 파라핀 섹션을 잘라 고 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 수집 합니다.</li>
	<li>건조 파라핀 섹션 37 ° c.에서 하룻밤 참고: (일시 중지 포인트) 파라핀 섹션 추가 사용 때까지 4 ° C에 저장 됩니다.</li>
	<li>프로토콜의 효율성을 확인 하려면 Hematoxilin 및 오신 (H & E) 및 decellularized 샘플 섹션 및 섹션 제조업체의 지침에 따라 조직의 비 조작 (MT) 얼룩 Masson의 Trichrome 수행 합니다. 참고: h 조 & 전자 얼룩 얼룩 세포 핵 파란색/보라색, 세포질 진한 핑크/레드 고 콜라겐 창백한 핑크와 MT 얼룩 핵 검은색, 빨간색, 세포질 및 콜라겐과 mucin 블루. 효율적인 decellularization 때 다공성 빛 핑크 (H & E, 몬태나) 달성 하 고 블루 (MT) 네트워크는 핵 얼룩의 부재에서 관찰.</li>
</ol>5. decellularized 조직 핵 재료 제거의 평가
참고: decellularized 조직에서 DNA 콘텐츠의 정량화는 각각 조작 되지 않은 조직에 비해 수행 되어야 합니다.
<ol><li>Decellularization, 전에 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 고정밀 디지털 규모에 무게. 튜브를 심장 조직 전송, 1 x PBS의 추가 금액을 제거 하 고 무게는 샘플 튜브. 샘플의 젖은 무게를 계산. 젖은 무게 샘플 무게 샘플 튜브 -무게 빈 관 =
</li>
	<li>3 단계에에서 설명 된 대로 샘플을 decellularize.</li>
	<li>후에 decellularization, decellularized 조직 microcentrifuge 튜브에 수집 합니다.<ol>
<li>작은 크기와 개별 심장 샘플 및 키트 사양의 질량, 수영장의 각 샘플 상태 decellularized 조직 (태아 심장: 5 전체 마음; 성인 LV explants: 15 explants). 조작 아닌 조직으로 동일한 절차를 수행 합니다. 참고: (일시 중지 포인트) 샘플 수 DNA 추출 및 정량화는 수행 될 때까지-20 ° C에 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>비 조작 잘라내어 깨끗 한 페 트리 접시에 메스의 도움으로 작은 explants에서 조직 decellularized. 참고: 각 샘플에 대 한 개별 메스와 페 트리 접시를 사용 합니다. 메스와 샘플의 기계적 장애 그들의 후부 효소 소화 및 후속 DNA 추출 용이.</li>
	<li>DNA 추출에 대 한 제조업체의 지침에 따라 스핀-열 기반 DNA 추출 메서드를 사용 합니다.<ol>
<li>넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 마스터 소화 버퍼 (소화 버퍼 및 가수분해 K) 페 트리 접시에서 기계적으로 천연된 샘플을 수집 합니다. 참고: 조직 세포 성분을 K 소화는 빨리 decellularized 샘플 에입니다. 동시에 다른 샘플을 처리, 모든 샘플은 성능 저하를 최소화 하기 위해 lysed 때까지 얼음에 lysed 샘플을 유지 합니다. 완전 한 샘플 세포 4-6 h 사이 이루어집니다.</li>
		<li>제조업체 지침에 따라 프로토콜 진행.</li>
		<li>Decellularized 및 decellularized 비 조직 샘플의 추출 된 DNA의 수율을 높이기 위해 25-50 μ 및 차입 버퍼의 100 μ에 DNA를 각각 elute. Eluted DNA를 수집 하 고 스핀 열 로드. 실시간 원심 분리기에서 1 분에 대 한 제조업체의 지침에 따라 샘플을 품 어. 참고: (일시 중지 포인트)는 DNA 샘플에서 추출 된 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 성 dsDNA 탐지 키트 제조업체의 지침에 따라 샘플에서 추출 된 DNA를 계량.</li>
	<li>(Decellularization) 전에 초기 샘플 젖은 무게의 밀리 그램 당 nanograms의 DNA로 DNA 콘텐츠를 정상화.</li>
</ol>6. decellularized 건설 기계 셀 시드
참고: 모든 솔루션/시 약 수 살 균 하 고 메 마른 조건에서 수행 하는 전체 절차.
<ol><li>암포 B와 1%의 2.5 μ g/mL로 1 x DPBS 준비 P/S (페니실린, 100 I.U.; 스 100 µ g/mL).</li>
	<li>마지막 decellularization 세척 단계 (단계 3.3.3)에서 PBS 솔루션 x 1을 제거 하 고 암포 B/1% P/S 솔루션의 DPBS/2.5 μ g/mL x 갓된 1의 당 500 μ를 추가 합니다. 1-7 일에서 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 참고: 4 ° C에서 샘플 저장소는 불 임을 유지 해야 합니다.</li>
	<li>P/S (FBS 보충 없이) 기저 미디어 1%의 최종 농도를 셀에 추가 합니다.</li>
	<li>Decellularized 샘플에서 암포 B/1% P/S 솔루션의 DPBS/2.5 μ g/mL x 1 발음 세포 기저 media/1% P/S의 당 500 μ를 추가 하 고 1 시간 또는 1 시간 이상 4 ° C에서 37 ° C에서 equilibrate 샘플을 보자.</li>
	<li>관심의 셀 분할 및 원하는 셀 밀도에 셀의 작은 aliquots를 준비. 참고: decellularized 조직 시드 수행 되어야 합니다 입체 현미경 및 메 마른 조건에서. 세포 배양 1%를 포함 한다 P/s.</li>
	<li>3-4 μ DPBS 96 잘 접시의 우물의 센터의 플라스틱 얇고 직선 핀셋을 사용 하 여, decellularized 건설 기계 DPBS 드롭 전송, 포부, 여분의 DPBS 제거 및 샘플 접히거나 주름이 되지 있는지 확인. 그것은 잘 표면에 가장자리에 건조 될 하자. 참고: 분리 된 건설 기계 낮은 시드 효율이 있다.</li>
	<li>천천히 잘의 가장자리에 대 한 단일 셀 솔루션 pipetting으로 발판에 셀을 추가 합니다. 참고: 예를 들어 신생아 쥐 cardiomyocytes는 시드와 7500 셀/m m2 와 불멸 하 게 마우스의 밀도 60-1500 셀/m m2의 조밀도에 린− Sca-1+ 심장 조상 세포 (iCPCSca 1). 실험적 근거를 따라 셀 밀도 조정 합니다.</li>
	<li>빠른 미디어 증발을 피하기 위해 이웃 우물에 DPBS를 추가 합니다.</li>
	<li>24 시간 사용 하는 셀 형식을 새로운 잘 bioscaffolds 옮겨 조직 문화 폴리스 티 렌 플레이트 (TCPS)을 셀 시드, 게시할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 비 부착 한 세포를 제거 하는 매체를 교체 합니다.</li>
	<li>세포 종류의 특정 요구에 따라 미디어를 신중 하 게 변경 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

세포 외 기질 (ECM) 수많은 생리 활성 펩 티 드 및 성장 요인 내포의 저수지로 구성 된 섬유와 접착제 glycoproteins의 매우 역동적이 고 복잡 한 채널 이다. 세포 접착, 골격 역학, 운동 성/마이그레이션, 확산, 감 별 법, apoptosis의 주요 변조기로 ECM 적극적으로 세포 기능 및 행동을 통제 한다. 세포질 행동 2D와 3D 문화에서 차이가 알면, 있었다 정확 하 게 자연 조직 환경을 복제할 수 소설 organotypic 모델을 개발 하는 노력. 마지막 년에서 조직 decellularization 조직 공학 및 재생 의학에 대 한 대체 방법으로 떠오르고 있다. 따라서, 조직 및 기관 decellularization은 현재 더 나은 조직 관련 microenvironmental 매개 변수 (생화학, 구조 및 기계)을 해 부를 선택의 도구와 생물 학적 활동 생체 외에서 그리고 vivo에서.
우리는 음이온 계면 활성 제 속성 DNase 치료<sup class="...

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The fourth&#160;affiliation&#160;was corrected from:
Gladstone Institutes, University of California San Francisco
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Gladstone Institute&#160;of Cardiovascular Disease
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University of California San Francisco

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Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

세포 외 기질 (ECM) 중요 한 세포질 과정, 즉 운명 결정, 확산 및 감 별 법1,2를 조절 하는 분자의 동적 네트워크입니다. 세포-ECM 상호 작용의 조사는 비보에네이티브 ECM 속성의 단순화 구성 2 차원 (2D) ECM 구성 요소와 코팅 생체 외 문화에서에서 주로 수행 되었습니다. Decellularization 세포 외 건축과 네이티브 조직 및 장기3,4의 크게 보존 acellular 3D 같은 ECM bioscaffolds를 생성 합니다. 조직 공학에 대 한 생리 활성 공중 발판으로 봉사 이외에 decellularized 3D ECM 생체는 그 병렬 vivo에서 환경 생물학 세포-ECM을 평가 하기 위해 새로운 플랫폼으로 등장 하고있다.
뚜렷한 조직, 기관 및 나이의 ECM 구성 요소의 차동 역할의 평가 네이티브 bioscaffolds 생성의 유사한 프로토콜의 사용으로 도움이 됩니다. 마음에 우리 기관 microenvironment의 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 방식으로 태아와 성인 파생 된 샘플의 decellularization에 대 한 다양 한 프로토콜을 개발 했습니다. 이 방법론을 사용 하 여, 우리는 네이티브 심장 microenvironment를 점령 하 고 태아 ECM 심장 세포5의 더 높은 repopulation 수익률을 촉진 했다. Decellularization는 더 거주 구조와의 차이점 지하실 lamina 및 pericellular 매트릭스 메쉬 배열 수준에서 태아 및 성인 ECM 섬유 구성5식별 제공. 이 작품 전에 동일한 decellularization 접근을 사용 하 여 다른 ontogenic 단계에서 조직의 머리 비교만 붉은 털 원숭이 신장 및 설치류 마음 보고 되었습니다. 또한, 제한 된 수의 연구 보고서 태아 조직/기관 decellularization se 당5,,67. 이 독특한 decellularization 에이전트로; SDS를 사용 하 여 달성 되었습니다. 그러나, 뚜렷한 SDS 농도 태아와 성인 심장 조직7,8decellularization 위해 사용 되었다. SDS 세포질 및 핵 자료의 정리에 대 한 가장 효과적인 이온 세제 중 하나 이며 다른 조직 및 표본9,10decellularization에서 널리 이용 된다. 높은 SDS 농도 노출의 연장된 기간을 포함 하는 솔루션은 단백질 변성, glycosaminoglycan (개 그) 감소와 콜라겐 소10,11의 상관 되었다 있다 따라서는 ECM 보존 및 셀 제거 사이의 균형은 필요 합니다. 태아 및 성인 심장 조직에 동일한 절차를 적용 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 3 순차적 단계에서 나누어져: 삼투성 충격 (소형 버퍼); 세포를 세포 지질 단백질, DNA-단백질 및 단백질 단백질 상호 작용 (0.2 %SDS);의 가용 화 그리고 핵 재료 제거 (DNase 치료)입니다.
우리의 프로토콜 몇 가지 장점을 보여줍니다: 내가) 나이 특정 심장 조직의 동일한 decellularization 전략; 응용 프로그램에 의해 동등한 decellularization의 가능성 특수 방법이 나 장비에 대 한 ii) 요구 사항 iii)로 인간의 내장 biopsies12 와 마우스 폐13;에서 사소한 변경으로 성공적으로 적용 된 다른 조직 및 종 적응 준비 그리고, 중요 한 것은, iv) 더 밀접 하 게 기본 조직 microenvironment의 분자 기능을 모방 하는 3D와 같은 organotypic 문화의 어셈블리를 사용 하는 동안 ECM biomechanical 속성을 해결할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubated Benchtop Shaker</td><td>Orbital Shaker</td><td>IKA:3510001</td><td>추천된</td></tr><tr><td>형광측정기</td><td>-</td><td>-</td><td>사용 가능한 장비</td></tr><tr><td>디지털 체중계</td><td>-</td><td>-</td><td>사용 가능한 장비</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>-</td><td>-</td><td>사용 가능한 장비</td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>-</td><td>-</td><td>사용 가능한 장비</td></tr><tr><td>냉장고(4&ordm; C)</td><td>-</td><td>-</td><td>사용 가능한 장비</td></tr><tr><td>급속 냉동고 (-80°C; C)</td><td>-</td><td></td><td>-사용 가능한 장비</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>-</td><td>-</td><td>사용 가능한 장비</td></tr><tr><td>Cirurgical Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>5000-08</td><td>Recommended</td></tr><tr><td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Recommended</td></tr><tr><td>Dumont 7 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11272-30</td><td>추천</td></tr><tr><td>해부 가위, 직선</td><td>-</td><td>-</td><td>도구 사용 가능한</td></tr><tr><td>펜치, 톱니, 곡선</td><td>-</td><td>-</td><td>도구 사용 가능</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트, 개별 포장</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td>-</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트, 개별 포장</td><td>VWR</td><td>71000-078-Steriflip-GV</td><td></td></tr><tr><td>, 0.22&micro; m, PVDF, 방사선 멸균</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SE1M179M6-Eppendorff</td><td>-</td><td></td><td>-사용 가능한 재료</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 튜브</td><td>Fisher Scientific</td> <td>430791-50</td><td></td></tr> <tr><td>mL Falcon 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>430829-4-Compartment 생검 처리/임베딩 카세트(뚜껑 포함</td>) <td>전자 현미경 과학</td><td>70075-B</td><td>-</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>-</td></tr><tr><td>Tissue cryopreservation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>6769006-2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258-1L-Dry</td><td></td></tr> <tr><td>ice</td><td>- </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Decellularization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Prolabo</td><td>27810.364-Na</td><td></td></tr><tr><td>2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-31264-KH</td><td></td></tr><tr><td>2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100g-KCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td>P8041-1KG-TrisBASE</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td>T6066-500G</td><td>-</td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설페이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>L-4390-MgCl</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>MERCK</td><td>1.05833.1000-DNAse</td><td></td></tr> <tr><td>I</td><td>AplliChem</td><td>A3778,0050</td><td>-</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>-</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026-Deionized</td><td></td></tr> <tr><td>water (DI water)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % formalin neutral buffer</td><td>Prolabo</td><td>361387P-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td>Y AQUEOUS</td><td>Surgipath</td><td>01592E</td><td>알코올성 에오신</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific HistoGel로 대체 가능 검체 처리 젤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>-</td></tr><tr><td>에탄올 에틸릭 알코올 99,5% anydrous</td><td>Aga</td><td>4,006,02,02,00</td><td>-</td></tr><tr><td>탈이온수(DI water)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Clear Rite 3</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>6915-Shandon</td><td></td></tr> <tr><td>Histoplast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RAS.6774006</td><td>-</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureLink 게놈 DNA 미니 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>K182001-Quant-iT PicoGreen&nbsp; dsDNA 키트</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>-</td></tr><tr><td>세포 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>-</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 100X</td><td>Labclinics</td><td>L0022-100-Fungizone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026</td><td>-</td></tr><tr><td>관심 세포의 세포 배양 배지-</td><td></td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

시험관 연구에 대 한 3d 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 explants의 비교 decellularization

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

세포 외 기질 (ECM)의 현재 정보-셀 통신 변환 큰 2 차원 (2D) 생체 외에서 문화 연구 ECM 구성 요소 표면 코팅으로 표시 됩니다. 이러한 문화 시스템 구성 조직 구조, 생 화 확 적인 구성과 기계적 특성을 포함 하는 ECM의 복잡 한 자연의 단순화. 더 나은 심장 microenvironment를 형성 하는 ECM 셀 통신 에뮬레이션, 우리 전체 태아 심장의 decellularization에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 하 고 성인 좌 심 실 조직 explants 비교 연구에 대 한 동시에. 프로토콜 전문된 기술 이나 장비에 대 한 소형 버퍼, 음이온 계면 활성 제 속성, 그리고 어떤 요구 사항 없이 DNase 처리의 세제를 사용 하 여를 결합합니다. 다양 한 나이의 과목에서 조직 샘플에서 동일한 decellularization 전략의 응용 프로그램은 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 이다. 현재 의정서 태아 및 성인 심장 ECM 메쉬 및 생물 세포 응답에 걸쳐 독특한 구조 차이 식별을 허용 한다. 또한,는 여기 방법론 성공적으로 적용 되 다른 조직 및 사소한 조정 종에와 같은 인간의 내장 biopsies을 마우스 폐에 광범위 한 응용 프로그램을 보여 줍니다.

세 가지 주요 기술을 통해 decellularization 효율성을 평가 합니다: 거시적인 관찰, 조직학 및 DNA 정량화. 샘플 게시물 SDS 처리의 거시적인 모양 세포 제거의 효능 직접적으로 영향을. SDS 인큐베이션, 샘플에 약간 (그림 1C) 흰 반투명으로 표시 됩니다. 태아 (E18) 성인 explants는 반투명 흰색 외관을 하는 동안 decellularized 조직 높은 반투명 구조 특징 이다. 하얀 외관 ECM 네트워크 높은 섬유와 콜라겐 콘텐츠, 예를 들면 성인 심 실 및 혈관 혈관 ECM 메쉬 전시 (그림 1C)에 일반적으로 상관 된다. 되며 &amp; 오신 (H &amp; E) 또는 Masson의 Trichrome (MT) 얼룩 다공성 메쉬 (밝은 분홍색, H &amp; E; 빛 핑크와 블루, MT)의 관찰에 의해 효율적인 세포 ...

심장 세포 외 기질 (ECM) 생활 내내 개장 하는 생리 적 지속 하는 동안 조직 및 장기에서 핵심 프로세스를 조정 하는 분자의 복잡 한 네트워크입니다. 태아 및 성인 심 혼의 표준된 decellularization는 네이티브 아키텍처 및 biomechanical 속성을 포착 하 여 3D 컨텍스트에서 두 조직의 비교 실험 연구를 허용 합니다.

시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

이 방법은 세포외 매트릭스가 심장의 다른 생리적 및 발달 단계 동안 가지고있는 영향에 대한 심혈관 분야에서 중요한 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 유형의 조직에 유사한 탈세포화 방법을 적용하여 태아와 성인 세포 외 세포 행렬 사이의 비교 분석을 허용한다는 것입니다. 그래서 이 방법은 다른 맥락에서 세포외 매트릭스의 연구를 촉진하는 암 환자에서 외과 절제술과 같은 그밖 기관에 성공적으로 적용되었습니다.먼저 얼음이 차가운 PBS로 태아와 성인 마우스 하트를 잠시 헹구십시오. 그런 다음 조직을 해부 현미경 아래에 놓고 직선 작은 가위를 사용하여 심실, 성인 마우스 하트에서 아리아, 오른쪽 심실 및 셉타를 제거합니다. 왼쪽 심실을 새로운 페트리 접시로 옮기고 왼쪽 심실 없는 벽을 2mm 두께의 세로 스트립으로 나눕니다.상종 마우스 왼쪽 심실의 사용은 일관된 탈세포화 효율에 필수적입니다. 메스와 톱니 모양의 핀셋을 사용하여 구체 근육을 제거한 후 2mm 그리드를 사용하여 스트립을 더 작은 조직 조각으로 더 잘라낸다. 모든 조직이 다진 경우, 간략하게 이절을 커버하기에 충분한 PBS로 조각을 헹구는 다.그리고 태아 심장과 성인 심장 조직의 조각을 튜브 당 최적의 절삭 온도 또는 OCT 화합물 250 마이크로 리터를 포함하는 개별 1.5 밀리리터 미세 센심 분리 튜브로 옮킨다. 그런 다음, 냉각 된 드라이 아이스에서 심장 조직 샘플을 동결하면 음의 섭씨 80도에서 보관할 수 있습니다. 냉동 보존 조직을 탈세포화하기 위해 냉동 샘플을 페트리 접시에 놓고 충분한 PBS가 함유되어 이 기간을 완전히 덮습니다.OCT가 녹은 후, PBS의 새로운 페트리 접시에 샘플을 담그고 세척 당 60 RPM에서 10 ~ 15 분 동안 셰이커에 샘플을 세 번 세척하십시오. 마지막 세척 후, 멸균 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 작동 저혈압 버퍼의 1 밀리리터를 추가하고 각 우물에 하나의 조각을 전송하는 미세 한 집게를 사용합니다. 18시간 동안 섭씨 25도에서 플레이트를 배양하고, 165 RPM에서 플레이트를 165RPM에서 배양한 다음, 세차당 PBS 1밀리리터로 1밀리리터로 3시간 세척합니다.마지막 세척 후, 25섭씨24시간 배양시 신선하게 준비된 도데실 황산나트륨 또는 SDS 용액 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 다음 날, 세척당 저혈압 세척 버퍼 1밀리리터에 3개의 20분 세척으로 샘플을 헹구고 37°C의 배양시 각 웰에 DNase 처리 용액 1밀리리터를 첨가합니다. 잠복이 끝나면 셀룰러 화된 샘플은 젤라틴과 같은 일관성을 잃어야 합니다.그런 다음 세차당 PBS 1밀리리터로 조직 조각을 세 번 씻은 다음 실온과 60 RPM에서 1 밀리리터의 신선한 PBS로 하룻밤 세척합니다. 탈세포 조직에서 세포 잔해의 제거를 평가하기 위해, 다음 날 아침 은 실온에서 2.5 ~ 3 시간 동안 잘 당 0.03 %의 수성 에신으로 보충 된 신선하게 준비 된 10 %의 수제 중성 버퍼의 1 밀리리터로 샘플을 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 샘플을 PBS 의 1 밀리리터로 잘 세척하십시오.그리고 일회용 비닐 시편 몰드를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 조직학 처리 젤에서 탈세포화된 조각을 캡슐화합니다. 다음으로 캡슐화된 조각을 생검 처리 카세트로 옮기. 그리고 에탄올, 이소파라피닉 알리파틱 탄화수소 용액 및 섭씨 56도의 상승 농도에서 연속적으로 30분 배양을 통해 파라핀을 포함시키는 파라핀 샘플을 처리한다.두 번째 파라핀이 나타난 후, 파라핀 블록에 샘플을 장착하고 마이크로토메를 사용하여 3마이크로미터 두께의 단면을 얻습니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 haematoxylin 및 eosin 및 Masson의 삼색 얼룩으로 섹션을 염색하여 탈세포화 효율을 확인합니다. 하룻밤 PBS가 흔들리는 후, 새로 준비된 DPBS 500 마이크로리터를 첨가하고, 각 비계에 암포테리신 B 1%의 항생제 용액의 밀리리터 당 2.5 마이크로그램을 첨가합니다.그리고 샘플을 섭씨 4도에서 1~7일 동안 보관하십시오. 세포를 앉기 전에, DPBS 용액을 항생제로 보충된 세포 기저 배지500 마이크로리터로 대체하십시오. 그리고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 비계를 배양하십시오.인큐베이션의 끝에서 현미경을 사용하여 스캐폴드 당 96웰 플레이트의 한 우물의 중앙에 DPBS의 4개의 마이크로리터 드롭을 추가합니다. 얇은 직선 핀셋을 사용하여 탈세포 비계 1개를 각 낙하의 상단으로 옮기습니다. 포부로 추가 DPBS를 제거하고 스캐폴드가 접히거나 구겨지지 않은지 확인합니다.스캐폴드가 가장자리에서 건조되면 각 스캐폴드 의 상단에 관심 있는 셀의 단일 셀 현탁액을 천천히 앉히게 합니다. 배아일 18탈세포조직은 고반투명 구조가 특징이며, 성인 이질은 백색 외관에 반투명을 나타낸다. 헤마톡시린과 에오신과 마슨의 트리홈 얼룩은 존재 다공성 메쉬에 의해 효율적인 세포 제거를 확인합니다.핵 물질은 탈세포화 후 약 99.8%까지 감소하며, 이식 시 원치 않는 염증 반응을 유발하는 것을 피하는 데 필수적인 비조작 조직과 비교됩니다. 앉아있는 비계 내의 세포 생존능력은 칼신 염색에 의해 체외 내 배양 중에 모니터링될 수 있다. 스캐폴드에 걸친 세포 재인구 및 분포의 말단 분석은 중앙 바이오스캐폴드 섹션의 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이 파라핀 처리 후에도 수행될 수 있다.그래서이 기술은 태아와 성인 마우스 심혼 뿐 아니라 그밖 조직의 세포외 매트릭스의 생리활성 속성의 탐구에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

comparable-decellularization-fetal-adult-cardiac-tissue-explants-as

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 혈관 구조를 통해 세제의 사전 관류를 적용하여 탈세포화된 세포외 기질 또는 ECM 골격을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 구조적 ECM 스캐폴드를 사용하여 심폐 질환과 관련된 ECM 리모델링을 분석할 수 있습니다.

심폐 복합체 탈세포화: 쥐 모델에서 심장 및 폐를 탈세포화하는 기술

신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

이 메서드는 decellularization의 삼투성 충격 및 최소한의 기관 매트릭스 중단 이온 세제의 관류에 따라 간단한 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 단단한 기관 수 있습니다. 그것은 흐름 역학 및 세포질 파편 유출의 실시간 모니터링으로 가압된 주머니 안에 인간의 마음에 대 한 소설 decellularization 기법으로를 구성 됩니다.

거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

이 프로토콜 만족 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 3 차원 비 계 없는 심장 조직을 만들 순 형 기반 방법을 설명 합니다.

비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

이 작업에서, 태아 마우스 골격근의 탈세포화된 매트릭스를 얻기 위해 탈세포화 프로토콜이 최적화되었습니다. C2C12 근모세포는 이러한 매트릭스를 식민지화하고 증식하며 분화할 수 있습니다. 이 시험관 내 모델은 근이영양증과 같은 골격근 질환의 맥락에서 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 배양을 위한 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비

성인 인간의 심장에서 분리된 섬유아세포를 배양하여 젤라틴 코팅된 접시에 합류시켜 심근 특이적 세포외 기질을 생성했습니다. 탈세포화 후, 이 기질은 다른 심장 세포 및 세포-기질 상호 작용의 배양 및 연구에 사용할 수 있습니다.

Culture Dish Coating을 위한 성인 인간 섬유아세포의 심장 세포외 기질 생산

용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.

폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

배우세요 태아와 성인 심장 조직의 3D 디셀룰라라이제이션 방법을 통해 세포외기질(ECM) 특성을 비교 분석하는 기술입니다. 이 방법은 심혈관 질환 연구와 조직 공학에 활용됩니다.

시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization

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