Name: 패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 효소 캐스케이드 반응을 이용한 L-라이신에서 키랄 아미노 알콜 합성 및 정제 방법. 이 효율적인 프로토콜은 유기 합성과 제약 치료에 활용될 수 있습니다.

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저자는 유익한 토론에 대 한 베로 니 크 드 Berardinis와 알랭 Perret, 크리스틴 Pellé, 및 기술 지원에 대 한 페 기 Sirvain 감사합니다.

1. 효소 준비
<ol><li>표현 하 고 앞에서 설명한26으로 단백질 정화. 참고: 재조합 단백질 다음 최종 농도와 가져온: αKAO에서 Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1.35 mg/mL; C. pinensis, UniProtKB ID에서에서 αKAO: C7PLM6 (KDO2), 2.29 mg/mL; PLP-Dc에서 S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), 셀 무료 12.44 mg/mL;에서 총 효소 추출 PLP-DC에서 C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2.62 mg/mL.</li>
</ol>2입니다. 솔루션의 준비
참고: 아래의 모든 솔루션 이온된 수에 준비가 되어 있습니다.
<ol><li>HEPES 버퍼, pH 7.5;의 1 M를 준비 5 m NaOH의 조정. 참고: pH 조정 단계 동안 얼굴 보호 (P280), 눈 보호, 보호복, 보호 장갑 착용. 눈 (P338 P305, P351,)와 접촉, 여러 분 제거 콘택트 렌즈 가능 하면 물으로 조심 스럽게 씻어. 세 정을 계속 하 고 즉시 독극물 센터나 의사 (P310) 전화. P 코드 예방 문 참조 (위험 클래스 및 카테고리; 참조, 예를 들어, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>100 m m L-리 신, 100 mM (5S) 준비-hydroxy-L-리 신, 150 m m α-ketoglutaric 산, 100mm 나트륨 하는데, 10mm 암모늄 iron(II) 황산 염 hexahydrate (모어 소금), 100mm pyridoxal 5-인산 염 (PLP), 및 100 m m dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>1 M, 2 M, 그리고 37 %HCl 솔루션 (approximatively 12 M 솔루션), 염 산 (HCl)의 6 분 2.1에 설명 된 대로 동일한 안전 지침에 따라 준비 합니다. 참고: α-ketoglutaric 산, 나트륨 하는데, 및 암모늄 iron(II) 황산 염 hexahydrate의 솔루션 이루어져야 합니다 신선한 사용 당일. 실 온에서 몇 달 동안 리 솔루션을 저장할 수 있습니다. PLP 솔루션 4 ° c.에 한 달 동안 저장 될 수 있다 DTT 솔루션-20 ° c.에 한 달 동안 저장 될 수 있다</li>
</ol>3. 분석 규모 반응
<ol><li>5 (R)의 decarboxylation 반응에 대 한 방법 개발-hydroxy-L-리 신<ol>
<li>11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M 솔루션의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, 100 mM (5S)의 22 µ L을 추가-hydroxy-L-리 신 (최종 농도 10 m m), 2.2 100mm PLP의 µ L (최종 농도 1 m m), 및 2.2 µ L 100 mM DTT의 (최종 농도 1 m m). 참고: 경우 LDCSrum와 반응, DTT의 추가 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>순화 PLP DC를 추가 (최종 농도 0.1 mg/mL). H2O 220 µ L의 최종 볼륨에 대 한 완전 한.</li>
		<li>3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어. 참고: 반응 매체의 좋은 산소를 하면 야외에서 열린 뚜껑으로 반응 혼합물을 떨고. 따라서 반응 미디어에 산소 거품 필요가 있다.</li>
		<li>6 단계에 설명 된 반응 모니터링 절차에 따라 분석 반응 혼합물의 10 µ L를 수집 합니다. 샘플은 가급적 derivatized 및 샘플링 후 직접 분석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결합 한 hydroxylation 단계 PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation와 αKAO에 의해 촉매 작용을 미치는 효소 캐스케이드 반응 위한 방법 개발<ol>
<li>11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, α-ketoglutaric 산의 150 m m의 22 µ L을 추가 (최종 농도 15 m m), 5.5 µ L의 나트륨 하는데 100 m m의 (최종 농도 2.5 m m), 22 모어의 10 m m의 µ L의 소금 (최종 농도 1 m m), 그리고 L-리 신의 100 m m의 22 µ L (최종 농도 10 m m).</li>
		<li>H2O 단계 3.2.3에서에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려해 220 µ L의 최종 볼륨에 대 한 완전 한.</li>
		<li>대상된 regioselectivity에 따라 필요한 정화 αKAO 효소 추가: 위치 C-4 L-리 신에 대 한 위치 C-3 또는 KDO2에에서 hydroxylation에 대 한 KDO1. 정제 효소의 최종 농도 (0.05-0.5 mg/mL) 3 h approximatively에 완전 한 변환 수 있도록 결정 했다.</li>
		<li>3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.</li>
		<li>2.2 µ L PLP의 100 mM의 추가 (최종 농도 ~ 1 m m) 및 DTT의 100 mM의 2.2 µ L (최종 농도 ~ 1 m m). 참고: 경우 LDCSrum와 반응, DTT의 추가 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>18 h LDC: 완전 한 변환 사용 농도에 순화 된 PLP DC를 추가Srum 0.1 mg/ml KDO1, 및 DCCpin 0.5 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서 캐스케이드 반응에 대 한 대략적인 최종 농도 KDO2와 캐스케이드 반응입니다.</li>
		<li>18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.</li>
		<li>3.1.4 단계와 모니터링 절차를 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation와 αKAOs에 의해 촉매 두 hydroxylation 단계를 결합 하 여 효소 캐스케이드 반응 위한 방법 개발<ol>
<li>단계 3.2.1-3.2.2를 실행 합니다.</li>
		<li>0.05 mg/mL의 최종 농도에 KDO1를 추가 합니다. 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.</li>
		<li>0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에 KDO2를 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.</li>
		<li>3.2.5 단계를 실행 합니다.</li>
		<li>0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에서 순화 PLP DC DCCpin 을 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.</li>
		<li>3.1.4 단계와 모니터링 절차를 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 반 대리점 한 냄비 Biocatalytic 반응
참고: 효소 반응 노천 250 mL 유리 10 ml 전체 볼륨에 대 한 삼각 플라스 크에에서 0.1 mmol의 L-리 신에 수행 됩니다.
<ol><li>Monohydroxylated 유도체의 합성<ol>
<li>1 M HEPES 버퍼, pH 7.5의 0.5 mL을 추가 (최종 농도 50 m m) 플라스 크에. 다음, 100 m L-리 신 m 1 개 mL를 추가 (최종 농도 10 m m), 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m), 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도 1 m m).</li>
		<li>H2O 10 mL, 4.1.3 단계에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려의 마지막 볼륨에 대 한 완전 한.</li>
		<li>대상된 regioselectivity에 따라 필요한 정화 αKAO 효소 추가: 0.075 m g/l L-리 신의 위치 C-4 0.5 mg/mL의 최종 농도에서 C-3 또는 KDO2 위치에 hydroxylation의 최종 농도에 KDO1. 정제 효소의 최종 농도 3 h approximatively에 완전 한 변환 수 있도록 결정 했다.</li>
		<li>적절 한 기간 동안 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어. 때 완료 된 hydroxylation 반응 (반응 프로토콜 모니터링에 대 한 6 단계에 자세히 설명 하는 모든 단계를 실행 하는)를 나타냅니다 반응 모니터링, 4.1.5 단계로 진행 합니다. 전형적인 반응 시간은 3 h 이다.</li>
		<li>ΑKAO 반응 혼합물에 100mm PLP의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m). 그런 다음, 100 mM DTT의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m), LDCSrum사용 하는 경우를 제외 하 고.</li>
		<li>순화 PLP-DC 추가: LDCSrum KDO1 또는 KDO2와 캐스케이드 반응에 대 한 0.5 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서 DCCpin 캐스케이드 반응에 대 한 0.05 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서.</li>
		<li>실내 온도에, 18 h 300 rpm, 반응 혼합물을 흔들어 고 직접 단계 4.3에에서 대 한 자세한 단계를 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dihydroxylated 유도체의 합성<ol>
<li>1 M HEPES 버퍼, pH 7.5의 0.5 mL을 추가 (최종 농도 50 m m), 100 m L-리 신 m의 1 mL (최종 농도 10 m m), 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m) 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도가 1 m m). H2O 10 mL, 4.2.2 단계에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려의 마지막 볼륨에 대 한 완전 한.</li>
		<li>0.075 mg/mL의 최종 농도에 KDO1를 추가 합니다. 적절 한 기간 동안 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.</li>
		<li>때 완료 된 hydroxylation 반응 나타냅니다 반응 모니터링 (프로토콜을 모니터링 하는 반응에 대 한 6 단계 참조), 4.2.5 단계로 진행. 전형적인 반응 시간은 3 h 이다.</li>
		<li>150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL를 추가 (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m), 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도 1 m m).</li>
		<li>0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에 KDO2를 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.</li>
		<li>때 완료 된 dihydroxylation 반응 나타냅니다 반응 모니터링 (프로토콜을 모니터링 하는 반응에 대 한 6 단계 참조), 4.2.7 단계로 진행. 전형적인 반응 시간은 18 h 이다.</li>
		<li>DTT의 100 m m의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m), LDCSrum사용 하는 경우를 제외 하 고.</li>
		<li>0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에서 순화 된 DCCpin 을 추가 합니다.</li>
		<li>18 h 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉각<ol>
<li>얼음 목욕에서 250 mL 유리 삼각 플라스 크를 배치 하 여 반응 혼합물을 식혀.</li>
		<li>신중 하 게, approximatively 1 분, 0.25 mL 6 M HCl 수동으로 부드럽게 흔들어 냉각된 반응 혼합물의 이상 추가 합니다. 2.1 단계에서 설명한 대로 동일한 안전 지침을 따르십시오.</li>
		<li>50 mL 원뿔 바닥 원심 분리기로 산 성 혼합물 튜브 전구, 파스퇴르 피 펫 장비는 유리를 사용 하 여 전송 다음 1680 x g와 15 분 동안 4 ° C에서 원심.</li>
		<li>철회는 상쾌한 고 250 mL 둥근 바닥 플라스 크에 옆으로 계속.</li>
		<li>펠 릿을 포함 하는 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브에 이온을 제거 된 물 10 mL를 추가 합니다. 다시는 펠 릿을 일시 중단 하는 소용돌이.</li>
		<li>1680 x g에서 원심 분리기, 4 ° C, 15 분.</li>
		<li>철회는 상쾌한 고 첫 번째 상쾌한 (4.3.4 단계)를 포함 하 250 mL 둥근 바닥 플라스 크에 추가 합니다.</li>
		<li>소용돌이, 지속적인 손으로 수집된 supernatants 액체 질소에는 플라스 크의 침수로 고정 하 고 벤치탑 매니폴드 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 동결 건조 기에 플라스 크를 즉시 전송.</li>
		<li>완료 된 후 동결 과정 (야간), 동결 건조 기에서 플라스 크를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 정화 조 효소 반응 혼합물에서 아미노 알콜의
<ol><li>이온 교환 수 지<ol>
<li>수성 0.1 m HCl (approximatively 4 mL)의 최소 금액에 동결된 제품을 용 해 고체 입자는 더 이상 벌 거 벗은 눈을 볼 수 때까지.</li>
		<li>방출 대기압에서 1 M HCl (4 열 볼륨) 0.1 뒤 여는 술 폰 산 기능 그룹 양이온 교환 수 지, 유리 열 (20 x 250 m m)에 200-400 메쉬 조건 M HCl (4 열 볼륨; 열 볼륨 10 mL =).</li>
		<li>신중 하 게 사용 하 여 1000 µ L micropipette 유리 열 벽에 수 지의 상단에 샘플을 로드 합니다. 다음, 린스 조 제품을 포함 하는 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브 세 번 1 mL 0.1 M HCl 용액 당의 세척와 같은 방법으로 열에 결과 린스 볼륨을 로드.</li>
		<li>비-선형으로 elute 그라데이션: 4 열 양의 0.1 M HCl, 4 열 양의 물, 4 열 양의 5% NH4오, 4 열 양의 10% NH4오, 4 열 양의 15% NH4오, 4 열 양의 20% NH4오 4 열 양의 25% NH4오 및 마지막으로 4 열 28% NH4오의.</li>
		<li>HPLC에 의해 정화 모니터링 (6 단계 참조).</li>
		<li>수영장 분수 화합물 (NH4오 20-28%)를 포함 하 고 단계 4.3.8-4.3.9에 설명 된 대로 freeze-dry. 참고: 이온 교환 열 이온 물 차입 물 (approximatively 50 mL) 1 m HCl의 50 mL와 함께 방출 하 여 가공 뒤의 중립화로 차입 후 다시 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>H3포4/water (20 µ L/mL)의 2 ml approximatively 동결된 화합물 solubilize</li>
		<li>장소는 혼합된 모드 양이온 교환 SPE 6 mL-카트리지 추출 매니폴드에 물 펌프에 연결. 매니폴드에서 제공 하는 감압에서 메탄올의 조건 4 mL를 통해 여 카트리지. H3의 4 mL를 통해 포4/water (20 µ L/mL) 여 카트리지를 equilibrate.</li>
		<li>유리 열 벽에 수 지의 상단에 1000 µ L micropipette를 사용 하 여 카트리지에 샘플을 로드 하 고 세 번 세척 당 H3포4/water (20 µ L/mL)의 0.75 mL와 함께 제품을 포함 하는 유리병을 씻어. 같은 방법으로 열에 결과 린스 볼륨을 로드 합니다.</li>
		<li>매니폴드, 2%의 4 mL를 제공한 감소 압력 방출 하 여 카트리지를 씻어 HCOOH 물, 그리고 물 4 mL와 함께. NH4물에서 오의 그라데이션으로 elute (4% NH4오에서에서 시작 각 차입에 대 한 4 mL: 10%, 15%, 15%, 20%, 및 28%).</li>
		<li>6 단계에 설명 된 프로토콜을 모니터링 하는 반응에 따라 각 분수를 분석 하 여 HPLC에 의해 정화를 모니터링 합니다. 자외선 (UV) 크로마에 따르면 순수 원하는 파생 상품을 포함 하는 모든 분수를 유지 하 고 5.2.6 단계로 진행.</li>
		<li>수영장 원하는 포함 된 분수 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 복합, 물으로 분수를 포함 하는 튜브를 헹 구 고 린스 볼륨 100 mL을 추가 둥근 바닥 플라스 크.</li>
		<li>40 ° C에서 온도 물 목욕 주전자를 장착 하 고 10 mbar에서 진공 펌프에 연결 된 회전 증발 기를 사용 하 여 감소 압력에서 용 매를 제거 합니다.</li>
		<li>물의 최소 볼륨에서 솔리드를 solubilize 고 무게 25 mL 둥근 바닥 플라스 크에 솔루션을 전송. 린스 물 최소 볼륨으로 플라스 크 25 mL 플라스 크에 린스 볼륨을 추가 하 고 5.2.9 단계로 진행.</li>
		<li>정화 제품 무게 하 고 수익률을 계산 합니다.</li>
		<li>고체 입자는 더 이상 벌 거 벗은 눈을 볼 수 때까지 2 m HCl의 최소 볼륨에서 정화 제품을 녹이 고 단계 4.3.8-4.3.9에 설명 된 대로 freeze-dry. 참고: 아미노 알콜 민감한 화합물 및 그들의 염 산 염 소금으로 유지 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 반응 모니터링 및 제품 분석
<ol><li>기판 및 HPLC 분석에 앞서 제품의 derivatization 참고: 기판 및 제품 증가 그들의 UV 컬럼에 detectivity 방향족 유도체로 derivatized를 해야 합니다. 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene (DNFB) 사용 했습니다. 각 샘플은 derivatization 직후는 HPLC에 주입 했다.<ol>
<li>효소 반응 및 전송의 10 µ L 1.5 mL microtube 가져가 라. 에탄올에 0.25 m NaHCO3 수성 해결책의 10 µ L, 에탄올, 100 µ L 및 DNFB 솔루션의 2.5 mg/mL의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>microtube 닫고 1000 rpm에서 65 ° C에서 1 시간에 대 한 결과 솔루션을 흔들어. 10 µ L로 끄다 1 M HCl의.</li>
		<li>0.22 μ m 기 공 크기 친수성 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막 1 mL 루어 주사기를 사용 하 여 4 m m 직경 비 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Derivatized 아미노산 분리의 모든 시스템을 사용 하 여 dioxygenase 반응의 모니터링을 수행 합니다. 이 프로토콜 dinitrobenzene (DNB) 발 색 단 그룹27여 derivatized 아미노산의 자외선 탐지를 포함 한다.<ol>
<li>유통 silyl endcapping 반전된 단계 열 (5 µ m, 3 x 150 m m)와 C18와 HPLC를 맞습니다.</li>
		<li>(과) eluent B C18 열 equilibrate (MeCN + 0.1 %TFA) eluent A (H2O + 0.1 %TFA) (approximatively 20 열 볼륨에 해당) 15 분 동안 35 ° C의 1 mL/min 흐름 속도로.</li>
		<li>10 µ L derivatized 반응 혼합물의 주입 (단계 6.1 참조) HPLC C18 열에. MeCN, 0.1 %TFA / H2O와 0.1%의 혼합물을 사용 하 여 선형 그라데이션으로 eluent로 TFA (9 분, 온도 35 ° C에에서과 하 비과 흐름 1 mL/min).</li>
		<li>UV 탐지 400 설정을 사용 하 여 크로마 열에 eluted 제품 분석 nm. DNB lysine은 일반적으로 약 6.5 분, hydroxylated DNB-신 약 5.5 분, DNB-신 약 4.2 분, dihydroxylated 및 DNB-aminodiol 약 5.3 분을 elutes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. NMR 분석의 정화 아미노 알콜
<ol><li>D2O 정화 아미노 알콜 분해 (700 µ L) 핵 자기 공명 (NMR) 튜브를 솔루션을 전송.</li>
	<li>1H 및 13C NMR 스펙트럼에 따라 적절 한 NMR 시설 프로토콜28습득.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

카이 랄 아미노 알콜 및 파생 상품 유기 합성 제약 치료에 대 한 카이 랄 조력자에서 응용 프로그램의 넓은 범위가 있다. 아미노 알콜 기존의 유기 합성에 의해 생산을 위한 다단계 합성 수많은, 하지만 않을 수 있습니다 항상 효율적인 입체 화학16의 민감한 컨트롤과 함께 지루한 보호/deprotection 단계. Biocatalytic 접근 보호/deprotection 단계 dispenses 이며 일반적으로 매우 stereoselective 좋은 대안을 나타냅니다.
이전 작업 동적 운동 비대칭 변환 (DYKAT)에 의해 2-phenylethan-1-아민의 백본와 다양 한 β-아미노 알콜의 합성을 보고. 이 경로에서 hydroxy 대체 stereogenic 센터 aldolisation benzaldehyde와 파생 상품, 트레오닌 aldolase에 의해 촉매에 의해 소개 되었다. 낮은 diastereoselectivity 및 적당 한 수익률...

Biocatalysis 제공 하는 혜택에도 불구 하 고 합성 경로 또는 총 biocatalytic 노선 biocatalytic 단계의 통합 주로 효소 키네틱 해상도 제한 남아 있습니다. 이러한 노선 비대칭 화학 효소 합성의 첫 번째 단계로 널리 사용 되었습니다 하지만 높은 stereoselectivity,12,3 기능 그룹 interconversions에 더 많은 가능성을 제공 하는 biocatalysis . 또한, biocatalytic 반응 비슷한 조건에서 실시 하 고로 그것은 가능한 한 냄비 패션4,5에서 캐스케이드 반응을 수행 하 따라서.
카이 랄 아미노 알콜은 보조 또는 유기 합성6공중 발판으로 사용 하기 위해 다양 한 분자. 아미노 알콜 moiety 이차 대사 산물 및 활성 제약 성분 (API)에 자주 발견 된다. 기본 β-아미노 알콜 랄 γ-아미노 알콜에는 기존의 화학 합성, 하지만 액세스 하 여 해당 α 아미노 산에서 쉽게 사용할 수 또는 보조 아미노 알콜은 종종 민감한 함께 지루한 합성 경로 필요 입체 화학7,8,,910의 제어 합니다. 그것의 높은 stereoselectivity 때문에 biocatalysis이 카이 랄 빌딩 블록11,12,,1314우수한 합성 경로 제공할 수 있습니다.
우리는 이전 diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines를 보고 / α-ketoacid-종속 oxygenase 가족 (αKAO) (그림 1)15. 특히, KDO1 dioxygenase-hydroxy 파생 (4R) 하면서 (1)-(3S)의 형성을 catalyzes L-리 신에서 시작, 파생 (2) KDO2 dioxygenase 가진 반응에 의해 형성 된다. KDO1와 KDO2에 의해 연속 regiodivergent hydroxylations-dihydroxy-L (3R, 4R)의 형성으로 이어질-광학적으로 순수한 형태로 lysine (3). 그러나,이 효소의 제한 된 기판 범위 α-아미노 그룹의 위치에 carboxylic 산 moiety 활동16를 위해 근본적으로 간단한 아민의 hydroxylation에 특히 화학 합성에 큰 사용률을 방해 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> 그림 1: L-리 신 Biocatalytic 변환. (3S)으로 변환-hydroxy-L-리 신 (1) KDO1 dioxygenase;에 의해 촉매 (4R)-hydroxy-L-리 신 (2) KDO2 dioxygenase;에 의해 촉매 그리고 (3R, 4R)-dihydroxy-L-리 신 (3) 캐스케이드 반응 KDO1 및 KDO2 dioxygenases에 의해 연속적으로 촉매에 의해. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Decarboxylation 신진 대사17에 일반적인 반응입니다. 특히, 아미노산 Dc (EC 4.1.1) 공동 인자 없는 (pyruvoyl) 또는 PLP 의존 효소 이며 박테리아와 더 높은 유기 체18,19 에 해당 polyamines로 아미노산의 decarboxylation 촉매 , 20 , 21 , 22. hydroxylated cadaverine, L-리 신의 decarboxylation에 의해 얻은 diamine에 해당 하는 모노-및 dihydroxy 화합물 (그림 3) 4-7, 10,-11 . Cadaverine 화학 산업에 대 한 주요 빌딩 블록, 특히 폴 리아 미드와 폴리우레탄 중합체의 구성 요소입니다. 따라서,이 diamine 재생 가능 자원에서의 바이오 기반 생산 석유 기반 경로 대신 관심을 모으고 있다 그리고 다양 한 미생물이이 목적을 위해 설계 되어 있다. 이러한 대사 경로에서 lysine DC (LDC) 주요 효소 이다. LDC는 알라닌 racemase (AR) 구조 가족23에 속하는 PLP 의존 효소 이다. PLP 의존 Dc (PLP-DCs) 높은 기판 특정 알려져 있습니다. 그러나 몇 가지 효소 예를 들면 Selenomonas rumirantium (LDCSrum)에서 LDC로 L ornithine 및 L-리 신 아미노산으로 활성화 되 고 약간의 성행위의 기능을 소유 하는, 유사한 운동 상수에 대 한가 lysine과 ornithine decarboxylation24,25. 이 확장된 기질 특이성은이 효소 decarboxylation의 모노-및 디-hydroxy-L-리 신에 대 한 좋은 후보. 또한, Dc 찾을 신의 수 파생 상품으로 활성, 우리 인코딩 αKAO 효소 유전자의 genomic 컨텍스트를 검사 합니다. 실제로, prokaryotic 유전자에서 인코딩 효소 같은 생 합성 경로에 관여 하는 유전자는 일반적으로 공동 지역화 유전자 클러스터에. 공동 유전자 인코딩 putative PLP-DC (그림 2)와 지역화 ( Chitinophaga pinensis)에서 KDO2 유전자 발견. 반면, DC에 대 한 인코딩 없이 유전자 발견 되었습니다 KDO1 dioxygenase의 게놈 컨텍스트를 분석할 때. C. pinensis (DCCpin)에서 PLP DC 단백질 따라서 캐스케이드 반응의 decarboxylation 단계를 촉매를 유망한 후보자로 선정 되었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> 그림 2: C. pinensis에 KDO2 유전자의 Genomic 맥락. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
따라서, 우리는 dioxygenases 및 아미노산 (그림 3)에서 지방 족 랄 β-및 γ-아미노 알콜의 합성을 달성 하기 위해 Dc 효소 캐스케이드 반응 설계. 이전 보고는 αKAO에 의해 촉매 C H 산화 총 diastereoselectivity;와 hydroxy 대체 stereogenic 센터 소개 Cβ/γ 카이랄성 아미노산 moiety16의 Cα 탄소에만 영향을 줍니다 decarboxylative 단계에서 유지 됩니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> 그림 3: Retrosynthetic 분석. (R5) (4) β-및 γ-아미노 알콜 (R)-1, 5-diaminopentan-2-ol의 (A) Retrosynthesis-hydroxy-L-라이 신, 그리고 (S)-1, 5-diaminopentan-2-ol (5) 및 1, 5-diaminopentan-3-ol (6)에서 패-리 신입니다. (B) Retrosynthesis의 β, γ-β, δ-아미노 diols (2S, 3S)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (10) 및 (R,S4 2)-1, 5-diaminopentane-2, 4-diol (11) 5 (R)에서 시작- hydroxy-L-라이 신, 및 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (7) L-리 신에서 시작. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
패-리 신 (5R)에서 시작-hydroxy 파생, 우리 여기는 2/3 단계, 한 냄비, dioxygenases와 PLP-Dc를 대상 아미노 알콜 효소 절차 보고. 사전 종합 대상 분자의 실험실 규모에서 메서드는 반응 조건, 예를 들면, 원자재;의 전체 변환 수 있도록 하는 데 필요한 효소 농도 조정 분석 규모에서 개발 되었다 우리는 또한이 절차를 제시.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>시그마 알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신 염산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5S)-하이드록시-L-라이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>GPS NONH</td><td>아웃 소싱</td></tr>&<tr><td>알파;-케토글루타르산</td><td>시그마 알드리치</td><td>75892</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>나트륨 시그마 알드리치</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 철(II) 황산염 육수화물</td><td>아크로스</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>피리독살 포스페이트(PLP)</td><td>시그마 알드리치</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-디머캅토부탄-1,2-디올(DTT)</td><td>시그마 알드리치</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(DNFB)</td><td>시그마 알드리치</td><td>D1529</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 탄산수소</td><td>시그마 Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2,2-trifluoroacetic acid</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>암모니아 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>아크로스</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>인산 85 %</td> <td>아크로스</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>중수소 산화물</td><td>아크로스</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC 컬럼</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>Accela UHPLC 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accela PDA 검출기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mm 주사기 필터 - 0,22&micro; m - PVDF</td><td>Merck</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>ml 눈금이 있는 일회용 투베르쿨린 주사기, Luer 팁</td><td>VWR</td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>양이온 교환 수지 100-200&nbsp; mesh</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>혼합 모드 양이온 교환 고체상 추출 카트리지 6 mL</td><td>Waters</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>추출 매니폴드</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>B&uuml; chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기 알파 1-2 LDplus</td><td>그리스도</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 20 &마이크로; L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 500 &마이크로; L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &마이크로; L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz 분광계</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL 마이크로튜브</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 바닥 원심분리기 튜브</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 둥근 바닥 플라스크 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 둥근 바닥 플라스크 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 둥근 바닥 플라스크 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 삼각 플라스크</td><td>Fischerbrand</td><td>15496143</td><td></td></tr></tbody></table>

패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

아미노 알콜은 다양 한 응용 프로그램으로 다양 한 화합물. 예를 들어, 그들은 유기 합성에서 랄 공중 발판으로 사용 되었습니다. 기존의 유기 화학에 의해 그들의 합성은 종종 stereochemical 결과의 어려운 제어와 지루한 여러 단계의 합성 과정을 필요합니다. 선물이 효소 synthetize 아미노 알콜 48 h에 쉽게 사용할 수 있는 L 리 진에서 시작 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 매우 전통적인 유기 합성 하 여 수행 하기 어려운 두 화학 반응 결합 합니다. 신의 unactivated C H 본드의 첫 번째 단계, regio-와 diastereoselective 산화에 사이드 체인 dioxygenase;에 의해 촉매는 두 번째 regio-와 diastereoselective regiodivergent dioxygenase에 의해 촉매 산화는 1, 2-diols의 형성으로 이어질 수 있습니다. 마지막 단계에서 carboxylic 그룹의 알파 아미노산은 pyridoxal 인산 염 (PLP) decarboxylase (DC)에 의해 죽 습. 이 decarboxylative 단계 베타/감마 위치에 대체 hydroxy stereogenic 센터 유지 아미노산의 알파 탄소를만 영향을 줍니다. 결과 아미노 알콜은 광학 농축 따라서. 프로토콜의 4 개의 아미노 알콜 semipreparative 규모 합성에 성공적으로 적용 되었습니다. 반응의 모니터링 실시 했다 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 derivatization 후 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene에 의해. 고체 상 추출 (SPE)에 의해 간단 정화 받으면 우수한 수익률 아미노 알콜 (93% > 95%).

우리가 이전에 보고 된 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 / αKAO 가족 (그림 1)16. PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation 단계 뒤는 αKAO에 의해 촉매는 하나 또는 두 개의 hydroxylation 단계를 결합 하는 여기, 전체 폭포의 프로토콜 최적화 반응 조건 모두의 요구 사항을 충족 조정 되었다 효소 반응입니다. 우리는 두 개의 Dc, LDCSrum 및 DCCpin, 상용 (5R)으로 활동을 조사 하 여 시작-hydroxy-L-리 신. 다음 우리는 적절 한 αKAO에 의해 촉매 산화 단계 캐스케이드에서 모노 파생 상품, 3-hydroxy-L-라이 신 (<...

카이 랄 아미노 알콜 건설 기계 유기 합성에 사용 하기 위해 다양 한 분자입니다. 패-리 신에서 시작, 우리 diastereoselective C H 산화 촉매 dioxygenase에 의해 해당 수 아미노산의 carboxylic 산 moiety의 분열에 의해 다음에 의해 결합 하는 효소 캐스케이드 반응에 의해 아미노 알콜을 합성 한 decarboxylase입니다.

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

이 절차의 전반적인 목표는 유기 합성을 위한 키랄 보조제에서 제약 요법에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 가진 화합물인 키랄 아미노산 알코올을 합성하고 정제하는 것입니다. 이것은 천연 아미노산에서 파생된 키랄 아미노 알코올, 라이신을 한 부분으로 구성된 절차에서 2단계 또는 3단계로 접근할 수 있는 모든 수율 측정기입니다. 이 절차의 주요 장점은 프로토콜의 단순성과 정제 단계의 효율성입니다.이 과정을 시연할 사람은 제 연구실의 기술자인 오렐리 포시-주엔(Aurelie Fossey-Jouenne)입니다. 디하이드록실레이티드 라이신 유도체를 합성하려면 250ml 삼각 플라스크에 헤페스 완충액, l-라이신, 알파키타 글루타르산, 아스코르브산나트륨 및 더 많은 소금을 첨가합니다. 그런 다음 추가 할 효소 용액의 부피를 고려하여 최종 부피 10ml에 물을 첨가합니다.디옥시게나제 KD-01을 ml당 0.075mg의 최종 농도로 첨가합니다. 반응 혼합물을 실온에서 300rpm으로 적절한 시간 동안 흔듭니다. 혼합 후 반응 혼합물 10mcl를 1.5ml 에펜도르프 튜브에 옮깁니다.그런 다음 아퀴아스 중탄산나트륨 용액, 에탄올, ml당 2.5mg의 DNFB 용액을 에탄올에 추가합니다. 마이크로튜브를 닫고 용액을 1000rpm, 섭씨 65도에서 1시간 동안 흔듭니다. 완료되면 미니 원심분리기를 사용하여 용액을 가라앉힙니다.반응 혼합물을 10mcl의 1M 히드로클로산으로 담금질합니다. 용액을 소용돌이친 다음 미니 원심 분리기를 사용하여 용액을 가라앉힙니다. 1ml 루어 주사기를 사용하여 0.22mcm 붓기 크기의 친수성 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인으로 직경 4mm 무멸균 주사기 필터 위에 혼합물을 여과합니다.그런 다음 유도체화된 반응 혼합물 샘플을 HPLC 기기에 넣습니다. UV 검출을 사용하여 400나노미터에서 C-18 컬럼에 10mcl를 주입하여 제품을 분석합니다. 반응 모니터링에서 반응이 완료된 것으로 나타나면 알파키타 글루타르산, 아스코르브산나트륨 및 더 많은 소금을 플라스크에 추가합니다.ml당 0.5mg의 아포록시메이트 최종 농도에 deoxygenase KD-02를 추가합니다.초기 반응 부피를 사용하여 계산되었습니다. 반응 혼합물을 실온에서 300rpm으로 18시간 동안 흔듭니다.반응 모니터링에서 완료된 반응이 나타나면 100mcl의 100milimolar DTT를 반응 혼합물에 추가합니다. 플러스 100mcl의 1

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

펩타이드 차 아미드 (학부모 교사 협의회)를 포함하지만, 펩티드, peptoids 및 N-메틸화 펩티드에 국한되지 않습니다 펩티 도미 메틱의 슈퍼 패밀리입니다. 여기에서 우리는 학부모 교사 협의회의 한 구슬 한 화합물 라이브러리를 합성하는 분할과 풀과 하위 단량체 전략을 결합 합성 방법을 설명합니다.

분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

SPOT 방법으로 합성된 펩타이드 어레이는 단백질 라이신 메틸전이효소(PKMT)의 기질 특이성을 분석하고 PKMT의 기질 스펙트럼을 정의하여 생물학적 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 펩타이드 어레이를 합성하고, PKMT로 메틸화하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

이온 액체(IL)는 높은 부분입체선택율과 우수한 수율로 1,6-케토에스테르에 대한 빠르고 간단하며 저렴한 접근을 매개합니다. 반응 프로토콜은 견고하며 1,6-케토에스테르는 간단한 여과 프로토콜 후에 그램 규모로 얻을 수 있습니다. 또한, 1,6-케토에스테르는 탄화수소 용매의 강력한 겔화제입니다.

이온 성 액체에 의해 매개 1,6- Ketoesters의 높은 입체 선택적 합성 : 저 분자량 젤 레이터의 새로운 클래스에 빠른 액세스를 가능하게하는 3 요소 반응

특이성이 높고 부작용이 적은 암 약물을 종양 부위에 전달하려면 나노 입자를 기반으로 하는 새로운 방법이 필요합니다. 여기에서는 과산화수소 매개 산화에 의해 쉽게 준비될 수 있고 종양이 감소하는 환경에서 효율적으로 해리되어 페이로드를 방출할 수 있는 이황화 가교 미셀에 대해 설명합니다.

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

여기서, 우리는 효율적인 가수 분해 및 니켈 쉬프 염기 착체로부터 분리 아미노산 후속 FMOC 보호를 제시한다. 산해리 측쇄 보호기의 유지가 요구되는 경우 여기 제시된 가수 분해 조건을 사용하기에 적합하다. 이 기술은 천연 아미노산의 다양한 기판에 적용 할 수있다.

보호 그룹 산 - 불안정의 보존에 적합한 니켈 쉬프 - 자료의 가수 분해 복잡한 사용 조건

선물이 thioether/비닐의 건설에 대 한 프로토콜 황화 닿는 헬리컬 펩 티 드 사진 유도 thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여.

헬리컬 펩 티 드를 통해 사진 유도 Thiol-ene 또는 yne Hydrothiolation Thioether/비닐 황 화물-곁에 건설

Enolonium 종 케 톤 enolates의 umpolung와 α-위치에 nucleophile의 추가 대 한 2 단계 한 냄비 프로토콜 설명 되어 있습니다. Nucleophiles 염화 물, 아 지 드, azoles, 알릴-실, 그리고 향기로운 화합물 포함.

Enolonium 종 통해 Ketones의 Umpolung 기능화에 대 한 2 단계 프로토콜

Enantiomerically 농축된 bispiro [γ-butyrolactone-pyrrolidin-4, 4'-pyrazolone] 해골 비대칭으로 간단한 organocatalytic 1, 3 배위 cycloaddition 반응을 통해 합성 됩니다.

Α-Imino γ-Lactones의 Organocatalytic Cycloadditions 및 Alkylidene Pyrazolones 통해 마약 같은 Bispirocyclic 장비의 효율적인 건설

전자 레인지를 이용한 분자 dehydrogenative Diels-앨더 (DA) 반응 작용 cyclopenta에 간결한 액세스를 제공...

작용 Naphthalenes / Solvatochromic의 염료의 합성을위한 전자 레인지를 이용한 분자 Dehydrogenative Diels-앨더 반응

배우세요 효소 캐스케이드 반응을 이용한 L-라이신에서 키랄 아미노 알콜 합성 및 정제 방법. 이 효율적인 프로토콜은 유기 합성과 제약 치료에 활용될 수 있습니다.

패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응

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