Name: 종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 학습하세요 종양 유래 세포 외 소포체와 중간 엽 줄기 세포 간의 상호작용을 전임상 마우스 모델로 연구하는 방법을. 이 기법은 암 진행 및 전이 형성에서 줄기 세포 적응의 역할을 생체 내에서 분석하는 데 활용됩니다.

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S.R. 발리는 유럽 연합에 의해 Cancro (AIRC) 공동 투자 라 검색 술 당 예술 우승에 의해 친교에 의해 지원 되었다. 또한,이 프로젝트 자금 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램에서 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 아무 660200 (S.R. 발리) 받았습니다.

중간 엽 줄기 세포 분리에 대 한 인간의 지방 조직 기관 윤리 위원회에 의해 승인 후 Tergooi 병원 (쉼, 네덜란드)의 성형 수술의 부서에서 얻은 고 서 면 통지 해준 동의. GFP-긍정적인 많은 MSCs는 어린이 성인 (모 데 나 대학와 레지오 에밀리 아)에 대 한 부의 의료 및 외과 과학에서 얻은 했다.
동물 실험, 동물 실험에 네덜란드 법률에 따라 수행 하 고 프로토콜 VU 대학 의료 센터, 암스테르담, 네덜란드의 동물 실험에 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 세포 외 소포 종양 분 비의 격리.
<ol><li>FBS 70000 x g 하룻밤 사이에 (16 시간), 초 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에서 아무 브레이크 centrifuging EV 고갈 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 준비 (기대 감속에 대 한 1 시간). 신중 하 게는 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 (EV 고갈 FBS)를 수집 합니다. 0.22 μ m 필터 EV 고갈 FBS를 필터링 합니다.</li>
	<li>Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 2mm 글루타민을 보완 하 여 EV 고갈 문화 매체를 준비 (1 x P/S/G) 및 5% FBS EV 고갈.</li>
	<li>175 cm2 플라스 크에 3 x 106 143B 셀 씨 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 EV 고갈 문화 매체에 문화. 셀 (일반적으로 48 h 36 h) 후 80-90% 합칠 때, EV 격리는 상쾌한 8 x 175 cm2 플라스 크 (28 mL/플라스 크)에서 수집 합니다.</li>
	<li>미리 다음 프로토콜에 따라 차등 원심 (말합니다 때마다 상쾌한 centrifuging)에 의해 세포 및 세포 잔해를 제거 하려면 셀 상쾌한 취소:<ol>
<li>10 분 동안 500 x g에서 두번 상쾌한 원심</li>
		<li>2000 x g 15 분에 두 번 상쾌한 원심</li>
		<li>10000 x g 30 분에 두 번 상쾌한 원심</li>
		<li>최대 가속 및 감속 속도 설정으로 4 ° C에서 모든 centrifugations를 수행 합니다. 각 단계 후 신중 하 게 포함 하는 EV 상쾌한, 약 1 mL를 남겨두고 수집 합니다. 1.5 또는 상점을 사전 허가 조건-80 ° C에서 매체 EV 절연까지 바로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사전 허가 조건된 매체 한번 70000 x g 1 h에서 centrifuging 여 EVs를 격리, 천천히 브레이크, 울트라 진동 물통 회전자를 사용 하 여 울트라 원심 분리기 튜브 (최종 볼륨 38.5 mL/튜브)에 4 ° C에서.</li>
	<li>신중 하 게 나머지 볼륨에 뒤에, resuspend 약 1 mL EV 포함 된 펠 릿을 떠나 상쾌한 제거, 1 개의 ultracentrifuge 관에 모두 수영장 및 완벽 한 튜브 작성까지 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 추가 (최종 볼륨 38.5 mL).</li>
	<li>브레이크 없이 4 ° C에서 1 시간에 대 한 70000 x g에서 다시 한번 원심 분리기 (기대 감속에 대 한 1 시간). 조심 스럽게는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 100-200 µ L을 남겨두고.</li>
	<li>Resuspend EV-펠 릿을 PBS (모든 EV-격리에 대 한 표준화)와 200 µ L 최종 볼륨을 조정 합니다. 즉시 EV 준비를 사용 하거나 사용22까지-80 ° C에 저장 합니다. 참고: EVs 저장 될 수 있다-80 ° c.에 6 개월</li>
</ol>2. EV의 특성화
순화 EVs는 전송 전자 현미경 (TEM)23에 의해 구상 될 수 있다.
<ol><li>인산 염 버퍼에서 4 %paraformaldehyde 동등한 양으로 혼합 EV preps.</li>
	<li>코트 200 EV 정지 실 온에서 20 분의 5 µ L로 니켈 가장 격자 Formvar 카본 코팅 메쉬.</li>
	<li>0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.0), uranyl oxalate (pH 7.0) 대비 1%도 함께 가장 격자에 EV 샘플 흥분 하 고 4 %uranyl 아세테이트 및 2% 메 틸 셀 룰 로스 얼음에 1:9 비율에서의 혼합물에 포함.</li>
	<li>스테인레스 스틸 루프와 격자를 제거 하 고 필터 종이 메 틸 셀 룰 로스 필름의 적절 한 두께 보장 하기 위해 초과 하는 액체를 되 리.</li>
	<li>건조 후, 그리드 전송 전자 현미경으로 검사 하 고 해당 이미지를 소프트웨어를 결합 하 여 디지털 카메라 캡처 이미지.</li>
</ol>3. 종양에서 파생 된 EVs에 의해 MSCs의 교육.
<ol><li>4 %EV 고갈 인간 혈소판 Lysate (hPL)24, 헤 파 린 (10 U/mL)와 1 알파-최소 필수 매체 (알파-MEM)을 보완 하 여 MSC 문화 매체를 준비 P/S/G. x 참고: EV 고갈 hPL 1.1 섹션에 설명 된 절차에 따라 얻을 수 있다.</li>
	<li>시드 1.4 x 106 75 cm2 플라스 크 당 MSCs 지방이 많은 파생 하 고 37 ° C에서 5 %CO2 인큐베이터에서 EV 고갈 MSC 문화 매체에 문화.</li>
	<li>때 셀 70% 합류에 도달, 추가 143B 다리-또는 인간의 섬유 아 세포 (hf) 제어-EVs, 10 µ L EV 준비/cm2 문화 플라스 크의. 24 시간 동안 incubate 고 추가 6 시간에 대 한 EVs의 동일한 금액을 추가 합니다. 참고: 인간의 섬유 아 세포에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 교양 10 %FBS EVs 섹션 1에서에서 설명한 대로 격리 됩니다.</li>
	<li>MSC 상쾌한 수집, 1 x 4 ° C (최대 가속 및 감속 속도 설정)에서 5 분 동안 500 x g에서 원심, 새로운 튜브에 전송 및 저장 미래의 cytokine 분석 (섹션 5)을-80 ° C에서 지운된 상쾌한.</li>
	<li>비보에 대 한 실험 (단원 6), 섹션 3.1을 3.3에에서 설명 된 대로 GFP-긍정적인 MSCs25 교육, 수집 셀 하 고 주입까지 얼음에 100 µ L. 계속 셀 당 106 셀의 최종 농도에 PBS에 그들을 resuspend.</li>
</ol>4. EV 국제화의 시험
MSCs에서 EV 글귀를 시각화 하려면 제조 업체의 프로토콜에 따라 녹색 형광 링커 염료 (GFLD) (상용)와 EVs 레이블:
<ol><li>간단히, 200 µ L EV 준비에 희석제의 180 µ L를 추가 합니다. 희석제의 50 µ L에서 GFLD 염료의 1 µ L를 희석 하 고 추가 20 µ L 희석된 염료의 희석된 EV 준비.</li>
	<li>부드럽게 pipetting으로 혼합 하 고 어둠 속에서 실 온에서 3 분 동안 품 어.</li>
	<li>PBS에서 0.1 %BSA 5 mL을 추가 하 고 울트라-원심 분리기 관에 전송 PBS (최종 볼륨 38.5 mL/튜브) 튜브를 채울.</li>
	<li>원심 브레이크 없이 4 ° C에서 1 시간에 대 한 70000 x g에서 1 x (기대 감속에 대 한 1 시간). 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 200 µ L의 최종 볼륨에서 레이블이 EV-펠 릿 resuspend (PBS 가진 볼륨 조절).</li>
	<li>MSC 문화를 레이블이 EVs를 추가 하거나-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 야간 보육, 후 형광 현미경 검사 법에 의해 소포 국제화를 평가 하 고 flow cytometry7.</li>
</ol>5입니다. MSC Cytokine 식 프로필의 평가입니다.
<ol><li>인터 루 킨-8 (IL-8)의 다중 정량화, 인터 루 킨-1β (IL 1β), 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 인터 루 킨-10 (IL-10), 종양 괴 사 인자 (TNF) 및 MSC에서 인터 루 킨-12 p 70 (IL-12 p 70) 단백질 수준 조절 매체 (단계 3.4 참조) 사용 하는 상업적으로 사용할 수 있는 cytometric 구슬 배열 (CBA) 제조업체의 지침에 따라 인간의 염증 성 cytokines에 대 한.</li>
	<li>간단히, 항 체 활용 된 캡처 구슬 혼합을 모든 분석 결과 튜브를 추가 합니다. Cytokine 표준 희석 또는 조건된 중간 샘플 튜브를 추가 합니다.</li>
	<li>검출 시 약을 추가 하 고 실시간에 3 시간을 품 어</li>
	<li>워시 제공 된 세척 솔루션 비즈. 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 측정 하 고 제조업체의 지침에 따라 데이터를 분석.</li>
</ol>6. 다리의이 종이 식 Orthotopic 마우스 모델의 세대.
<ol><li>6 주 오래 된, 여성, Athymic 누드-Foxn1nu 쥐 실험 절차를 시작 하기 전에 적어도 1 주일에 대 한 순응을 허용 합니다.</li>
	<li>1 일 peri 요원으로 수술 전과 진통 식용 수에 해 열을 추가 합니다. "아이 들을 위한 해 열 솔루션" 희석 ( 재료의 표참조) 2 mg/mL의 최종 농도를 물으로. 150 mL/kg의 평균 물 섭취 량에 따라/일, 20 g의 평균 몸 무게,이 복용량은 6 밀리 그램의 복용량에 도달 / 마우스 충분 한 일 (300 m g/k g/일).</li>
	<li>수술 후, 또는 동물 고통의 흔적을 표시 하는 경우 더 이상 24 시간까지 진통 치료를 계속 합니다.</li>
	<li>수술 당일 10 분에 대 한 300 x g에서 centrifuging 여 교양된 luciferase 양성 (Fluc) 143B 셀 (이전 lentiviral 변환에 의해 생성 된)를 수집 하 고 PBS에서 2 x 105 셀 / µ L의 농도에서 세포를 resuspend. 6 시간 얼음에 세포 현 탁 액을 유지.</li>
	<li>압력솥 수술 장비입니다. 준비 및 작업 영역을 청소 하 고 소독된가 위 핀셋 살 균 시트에 배치. 20 분 전에 수술 (6.8), 단계 주입 동물 피하 buprenorphine (0.05 mg/kg, 0.9% 식 염 수에 희석) 0.5 mL 인슐린 주사기 (29 게이지 바늘)을 사용 하 여 진통제로.</li>
	<li>각 동물을 마비 직전 채워 10 µ L 주사기 집중된 (Fluc) 143B 셀 서 스 펜 션의 1 µ L (단계 6.4 참조).</li>
	<li>Isoflurane 흡입 마 취 (산소에 2-3%)와 함께 동물 anesthetize 발가락 꼬 집는 동물에 의해 마 취의 수준을 확인 합니다. 동물을 곤란 하 게, 즉, 그것은 깊은 마 취에 반응 하지 않는 연 고 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용.</li>
	<li>동물 마 취 마스크에 머리와 운영자 쪽으로 다리의 뒷면에 위치. 왼쪽된 무릎을 플렉스. 70% 에탄올으로 피부를 닦 고 3 번 로컬 진통제로 목화 팁 lidocaine (2%)을 적용.</li>
	<li>무 균 수술 칼을 사용 하 여 노출 경골을 무릎 바로 아래 피부에 작은 절 개 (약 5 m m)를 확인. 약 2 m m 0.8 m m 마이크로 트위스트 드릴을 사용 하 여 무릎 아래 경골에 작은 구멍을 드릴 합니다. 두 경골 외피가 드릴스루할 수 없습니다 주의 해야 합니다.</li>
	<li>26-게이지 바늘을 사용 하 여 구멍에 천천히 (약 5 초)에서 1 µ L 세포 현 탁 액 (약 2 × 105 셀)를 주사. 현 탁 액의 역류를 방지 하기 위해 조직 접착제의 작은 물방울으로 구멍을 닫습니다.</li>
	<li>Monofilament 봉합 및 조직 접착제 한 방울 피부를 닫습니다. 잘가 열된 환경 (열 램프 사용)에서 동물 복구 하자. 두지 마십시오 동물 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지. 동물 마 취에서 완전히 복구는, 후에 그들의 자신의 감 금 소에 그들을 반환 합니다.</li>
	<li>종양 접종 후 2 일 교육 EV 또는 순진한 GFP-긍정적인 MSCs를 주입 (100 µ L PBS에 106 세포 단계 3.5 참조) 쥐의 꼬리 정 맥에 0.5 mL 인슐린 주사기와 정 맥.</li>
	<li>생물 발광 영상26 일주일에 두 번 여 종양의 성장에 따라. 이 위해, 150 µ L 마우스 i.p. 주입 D-인슐린 주사기 (30 mg/mL)를 소. 주입 후 10 분 이미징 시스템 생물 발광에 동물을 종양 세포에 의해 생성 된 광자 유량을 측정.</li>
	<li>또한, 캘리퍼스 기본 뼈 종양의 직경을 측정 합니다. (M m3)에 종양 볼륨 x 0.5 x 길이2 폭으로 추정 된다.</li>
	<li>참고: 인간적 끝점 종양 직경으로 정의 된다 > 15 m m 또는 체중 감소 > 15%.</li>
</ol>7입니다. 폐 결 절 수의 평가
<ol><li>동물 중 하나에 정의 된 단계 6.14 (약 3-4 주) 인간적 끝점에 도달 하면, 실험을 종료 하 고 수집 하 고 분석 하는 모든 관련 조직.</li>
	<li>Euthanization, 전에 10 분 주사 150 µ L D-소 (30 mg/mL) 0.5 mL 인슐린 주사기.</li>
	<li>Anesthetize isoflurane 흡입 마 취와 함께 동물 (단계 6.7 참조). 발가락을 꼬 집는 마우스의 반응의 부재에 의해 마 취의 깊이 확인 합니다. 자 궁 경부 전위27여 쥐를 안락사.</li>
	<li>폐, 간, 비장, 신장 소독된가 위 핀셋을 사용 하 여 수집 합니다. 혈액 자취를 제거 하 고 배양 접시에 그들을 넣어 PBS에 장기를 씻어.</li>
	<li>이미징 시스템 생물 발광에 장기와 배양 접시를 놓습니다. 장기의 양쪽에 생물 발광 신호를 측정 합니다. 측정, 직후 미래 조직학 분석을 위해 그들에 게 (24-72 시간, RT) 흥분을 4% 포 르 말린에 장기 급락.</li>
	<li>수동 임계 처리 하 여 적절 한 이미징 소프트웨어 얻은 그림을 처리 합니다. 각 사진에 폐 작은 혹의 수를 계산 합니다. 양쪽 폐에 폐 작은 혹의 총 수를 계산 합니다.</li>
</ol>8. 조직학 분석
<ol><li>폐 조직의 조직학 분석:<ol>
<li>파라핀에 포 르 말린 고정 장기를 포함 하 고 6 µ m 조직 슬라이드를 준비.</li>
		<li>Deparaffinate 폐 조직 슬라이드 하 고 0.01 M 구 연산 염 버퍼 (pH 6)에서 15 분 동안 그들을 비등 하 여 항 원 복구를 수행 합니다.</li>
		<li>반대로 인간의 vimentin 항 체 (200 µ g/mL) 희석 1:150 항 체 희석 액 (상용)에 그 후 보조, HRP 표시 된 항 체 (0.5 mg/mL, 희석 1: 500) 실 온에서 가로로 슬라이드를 품 어. 조직 diaminobenzidine (DAB)-3'와 hematoxylin 카운터 얼룩 얼룩.</li>
		<li>해당 카메라 및 이미지 소프트웨어를 결합 하는 광학 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 조직 슬라이드를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 tibias에 GFP-긍정적인 MSCs의 존재를 평가:<ol>
<li>Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 0.24 M, pH 7.2-7.4 tibias 알려줍니다 뼈 유연 하 게 (약 1 주일)까지 매일 EDTA 버퍼를 새로 고칩니다.</li>
		<li>Tibias 탈수 하 고 파라핀을 침투. 파라핀 블록에 tibias (osteosarcoma 조직 포함)를 포함 합니다.</li>
		<li>6 µ m 파라핀 섹션을 준비 하는 톰을 사용 합니다. 유리 슬라이드에 파라핀 섹션을 놓습니다. 건조 후, 실 온에서 하룻밤 슬라이드를 저장 합니다.</li>
		<li>구 연산 염 버퍼를 사용 하 여 열 중재 항 원 검색 수행 (8.1.2 참조)와 1:900 항 체 희석 액에 희석에 안티-GFP 항 체 (전체 원으로)로 조직 얼룩. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 조직 counterstain</li>
		<li>조직 슬라이드 해당 이미징 소프트웨어를 결합 하는 형광 현미경으로 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

종양-분 비 세포 외 소포 (EVs) 종양 지원 환경 생성 하 현지와 먼 중간 엽 세포의 생리학을 변경할 수 있습니다. 여기 우리가 종양 세포 간의 EV 중재 한 상호 작용의 해 부를 수 있는 다리의 전 임상 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) vivo에서. 우리는 인간의 종양 마우스 다리 xenografts 강하게 베어링의 EV 교육 MSCs의 조직의 주입7일-6/STAT3 신호 통로 활성화 하 여 암 성장과 전이 형성 촉진을 보여줍니다.
최근 연구 결과 암 EVs 로컬 또는 골 수 유래 기질 세포16,,2829의 동작을 변경 하 여 미리 전이성 틈새의 형성에 도움이 될 수 있습니다 나타났습니다. 이러한 연구 결과 암 파생 ...

종양 microenvironment tumorigenesis 및 암 진행, 전이 형성 등의 치료제1저항 개발의 대부분, 그렇지 않으면 모두, 측면에서 적극적으로 참여 합니다. 이 종양 틈새에서 발생 하는 복잡 한 종양-기질 상호 작용의 해 부를 수 있는 전 임상 orthotopic 암 마우스 모델에 대 한 필요성을 강조 하고있다.
종양 microenvironment의 많은 세포 구성 성분 중에서 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 강하게 유방암, 전립선 암, 뇌종양, 다 발성 골 수 종, 및 다리2 등 여러 암 종류의 암 진행에 기여 ,3,,45,,67. MSCs는8,9골 수, 지방 조직, 태 반, 탯 줄 혈액, 등을 포함 하 여 다양 한 성인 그리고 태아 조직에 있는 multipotent 줄기 세포 이다. 염증 신호 암 생성에 대 한 응답, MSCs 종양 사이트 쪽으로 마이그레이션할 종양 microenvironment에 통합 고 궁극적으로 암 지원 셀10으로 차별화 합니다. 이러한 암 관련 된 MSCs 종양 진행 행동 종양 세포에 및 주변 기질2, 에 대 한 필수적인 요인 (즉, 성장 요인, 발산, cytokines, 면역 중재자) 제공 3 , 11 , 12 , 13. 동안 종양 증진 효과 암 관련 된 MSCs의 수많은 암 모델에서 조사 되어, 종양 세포는 암 홍보 틈새를 형성 하는 MSCs 재 설 정할 메커니즘 제대로 이해 하는. 여기는 orthotopic이 종이 식 모델을 구체적으로 extracellular 소포 (EVs) 통해 뼈 암 세포와 MSCs의 프로 tumorigenic 상호작용 연구의 생성에 설명 합니다.
EVs는 종양과 stromal 세포14사이 세포 커뮤니케이션의 중요 한 중개자. EVs의 원산지, 단백질, 지질, 및 규제 RNAs를 포함 하 여 세포의 기능 생체 나. 일단 세포 외 공간에서 발표,이 소포 주변 세포에 의해 채택 될 수 있다 또는 혈액 이나 림프 순환 통해 먼 사이트에 고 뿌리깊은 대상 셀 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 15 , 16 , 17 예를 들어, stromal 섬유 아 세포에 의해 암 EVs의 신생을 지원 하 고 종양 성장 을 vivo에서18,19, 내 피에 의해 국제화 가속 myofibroblast 차별화에 발생할 수 있습니다. 셀 수 있는 종양 혈관 신생을 자극 하 고 증가 혈관 침투성16,20, 그리고 면역 세포와의 상호 작용21antitumor 면역 반응 억제로 이어질 수도 있습니다.
우리는 최근 시연, 종양 세포 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형 얻으려고 MSCs 프롬프트 EVs의 높은 금액을 출시, 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델을 사용 하 여. 이 효과 MSC cytokine 식 프로 파일 ("MSC 교육" 라고도 함)에 있는 극적인 변화 때문 이며 치료 인터 루 킨-6 수용 체 (IL-6R) 항 체7의 행정에 의해 방지 될 수 있다. 우리의 일 암 EVs 다리 진행 중단 microenvironment 대상 접근에 대 한 근거를 제공 하는 MSC 행동의 중요 한 변조기는 설명 했다. 여기, 우리는 EV 중재 종양-MSC 상호 작용에서 vivo에서조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 모델을 것입니다: 1) 특히 종양 microenvironment 암 EV 유도 변경 MSC 행동의 정의 2) 어떻게이 상호 작용에 기여 뼈 종양 성장 및 전이 형성, 그리고 연구 3) 방해 하는 여부를 평가 vivo에서 EV 중재 누화 암 진행을 방지합니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW32Ti</td><td>Beckman</td><td>369650</td><td>원고에서 울트라 스윙 버킷 로터</td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Zeiss</td><td>EM109</td><td>또는 이와 유사한 TEM</td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Nikon</td><td>DMX 1200F</td>로 언급됨<td>또는 유사한 카메라</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어 TEM&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>ACT-1</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D2</td><td>또는 이와 유사한 형광 현미경</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어 FM</td><td>Zeiss</td><td>ZEN Blue</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Nuaire</td><td>4750E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettick</td><td>ROTANTA 460R-80</td><td></td></tr> <tr><td>Freezer</td><td>Thermo electro corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>BD FACScalibur</td><td>또는 유사한 유세포 분석기</td></tr><tr><td>드릴</td><td>Ferm</td><td>FCT-300</td><td>0.8mm 드릴</td></tr><tr><td>HSS 마이크로 트위스트 드릴, 0.8mm</td><td>Proxxon</td><td>28 852</td><td>0.8mm 드릴</td></tr><tr><td>IVIS 카메라</td><td>Xenogen</td><td>Ivis Lumina</td><td>원고에서 생물 발광 카메라라고 합니다. Xenogen은 이제 Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Living image software2.60</td><td>Xenogen / Igor Por</td><td>n.a</td><td>Xenogen은 이제 Perkin Elmer</td></tr><tr><td>10 &micro의 일부입니다. L 주사기</td><td>Hamilton</td><td>Neuros 모델 1701 RN</td><td></td></tr><tr><td>바늘 : 주사기, 26 게이지, Pointstyle AS, 사용자 정의 길이 2cm</td><td>Hamilton</td><td>n.a.Caliper</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Mitutoyo</td><td>G08004463</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Astell</td><td>n.a.Heat</td><td></td></tr> <tr><td>Lamp</td><td>Philips</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Culture media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>Hyclone</td><td>RYG35912</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 용해물</td> <td>n.a.n.a.IMDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>배지</td><td>Lonza</td><td>BE12-722F</td><td></td></tr><tr><td>알파-MEM 배지</td><td>Lonza</td><td>BE02-002F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 배지</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>펜/스트렙/글루타민</td><td>GIBCO</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA (10x)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td><강>세포</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>지방 탈리버 MSC</td><td>n.a.n.a.GFP</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>양성 MSC</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td>인간 섬유아세포 n.a.n.a.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>143B 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>FLUC-143B 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>형질도입</td></tr><tr><td><강력>일회용</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>배양 플라스크 175 cm2</td><td>CELLSTAR</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>Freeze 튜브</td><td>Thermoscientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 튜브</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>원고에서 ultra-centrifuge tubes</td></tr><tr><td>0,22 &micro로 언급되었습니다. m 필터</td><td>Millex</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>200 메시 Formvar-carbon-coated nickel grids</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 인슐린 주사기와 29G 바늘</td><td>Terumo</td><td>U-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>P7612</td><td></td></tr><tr><td>여과지&nbsp;</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>50363215</td><td></td></tr><tr><td>시약/키트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Alfa Aeser</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Braun</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>16300</td><td></td></tr><tr><td>uranyl oxalate</td><td>EMS (Electron Microscopy 과학)</td><td>22510</td><td></td></tr><tr><td>urany acetate</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>methyl cellulose</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>mini67-1kt</td><td>원고에서 GFLD</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CBA - human inflammatory cytokine kit</td><td>BD</td><td>551811로 지칭</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드 37 %</td> <td>VWR</td><td>104003100</td><td></td></tr><tr><td>탄소강 수술 용 블레이드</td><td>Swann-Morton</td><td>206</td><td>원고에서 수술 칼</td></tr><tr><td>항 인간 vimentin 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>클론 V9</td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>DAKO</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>HRP 표지 안티 마우스 IgG 항체</td><td>Life Technologies</td><td>32230</td><td></td></tr><tr><td>DAB-kit</td><td>DAKO</td><td>K500711</td><td></td></tr><tr><td>hematoxyllin</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 버퍼</td><td>n.a.n.a.Citrate</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>버퍼</td><td>n.a.n.a.rabbit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>polyclonal anti-GFP 항체</td><td>Abcam</td><td>n.a.Ab290</td><td></td></tr> <tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>파라세타몰, 120mg/5ml 시럽</td><td>Bayer</td><td>n.a.Sinaspril</td><td>, 어린이용 파라세타몰 용액</td></tr><tr><td>Isoflurane 1000mg/g</td><td>Vumc 약국</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>부프레노핀 염산염, 0.3mg/ml</td><td>Indivior UK Limited</td> n.a.lidocaine-HCL <td></td><td></td></tr><tr><td>2%</td><td>Vumc 약국</td><td>n.a.70</td><td></td></tr><tr><td>% 에탄올</td><td>VWR</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>조직 접착제</td><td>Derma+Flex, 공식화된 의료용 시아노아크릴레이트</td><td>Vygon</td><td></td></tr><tr><td>LB604060 안약: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml</td><td>Bausch+Lomb</td><td>n.a.D-luciferin</td><td></td></tr><tr><td>, 칼륨 염</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Thermo scientific</td><td>630-0954</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 루프&nbsp;</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>Mice experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,&nbsp; female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA</td><td>ENVIGO</td><td>n.a.Paper-pulp</td><td></td></tr> <tr><td>smart home (cage enrichment)</td><td>Bio Services</td><td>n.a.Alpha-dri</td><td></td></tr> <tr><td>bedding material</td><td>Shepperd Speciality Papers</td><td>n.a. </td><td></td></tr><tr><td>마우스 사료 : Teklad 글로벌 18 % 단백질 설치류 다이어트</td><td>ENVIGO</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>봉합사</td><td>Ethicon</td><td>V926H</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td> <td>(또는 유사)</td></tr> <tr><td>핀셋</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td> <td>(또는 유사)</td></tr></tbody></table>

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

종양 microenvironment 내 거주 또는 모집 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 여러 암 종류에 악성 진행에 기여 한다. 특정 환경 신호 영향이 성인 줄기 세포 paracrine 중재자 가속된 종양 성장 및 전이 해제할 수 있습니다. 종양 및 MSCs 사이 누화를 정의 암 진행을 기본 메커니즘을 이해 하 고 치료 적 개입에 대 한 새로운 목표를 식별 하려면 기본 중요성 이다.
암 세포 생성 높은 양의 extracellular 소포 (EVs), 뿌리깊은 대상 세포 종양 microenvironment에 또는 먼 사이트에서의 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 종양 EVs 염증 성 RNAs 등 (onco) 단백질, 암 세포의 전이 행동을 강화 하거나 미리 전이성 틈새 시장 형성에 참여 stromal 세포 교육 수 기능 생체를 묶습니다. 이 문서에서는, 우리는 EV 중재 누화 종양 사이의 중간 엽 줄기 세포의 특정 평가 가능 하 게 하는 전 임상 암 마우스 모델의 개발을 설명 합니다. 첫째, 우리는 정화 및 종양 분 비 EVs의 특성화 및 MSCs에서 EV 국제화 평가 설명합니다. 우리 다음 게 암 EVs에 의해 유도 된 다중 구슬 기반 immunoassay MSC cytokine 식 프로필 변경을 평가 하의 사용. 마지막으로, 우리이 종양-msc와 상호 작용 하는 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 기여를 표시.
우리의 모델 암 EVs 종양 지원 환경 형성 하는 방법을 정의 하 고 종양 및 MSCs 간의 EV 중재 통신의 봉쇄 암 진행을 방지 하는 여부를 평가 기회를 제공 한다.

이 연구에서 우리는 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형으로 MSCs 교육 다리 분 비 EVs 수 탐험. 우리 다리 셀 MSCs에 의해 내 면화는 exosome 같은 EVs 릴리스 보여줍니다. 우리 암 EVs에 의해 유도 된 MSC cytokine 식 프로필의 변경을 측정 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 효과 평가. 연구 디자인의 일반적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.
EVs 발표 143B 다리 셀 또는 컨트롤 인간의 섬유 아 세포 차등 원심 분리에 의해 순화 되었다. EV 순도 계시는 준비는 주로 40-100 nm (그림 2A) 사이 배열 하는 직경을 가진 소포를 포함 하는 전자 현미경으로 ...

골 종양 진행; 지원의 프로그래밍 이끌어 낸다 암 파생 extracellular 소포 (EVs)의 직접 분사 그러나, 셀 중재이 효과가 명확 하지 않습니다. 여기, 우리 EV 교육 MSCs 전이에 대 한 중요 한 역할을 드러내는 EV 중재 종양 mesenchymal 줄기 세포 (MSC) 상호 작용에서 vivo에서, 조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 종양과 중간엽 줄기세포 사이의 세포외 소포 매개 통신의 역할을 연구하기 위해 전임상 마우스 모델을 개발하는 것입니다. 이 방법은 종양과 중간엽 줄기세포가 세포외 소포체를 통해 어떻게 소통하는지, 그리고 이것이 암 진행을 지원하는지 여부에 대한 암 생물학 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 진행 및 전이 형성에 대한 암 EV에 의한 중간엽 줄기세포 적응의 역할을 연구할 수 있다는 것입니다.이 절차의 의미는 암 치료로 확장되는데, GSA를 사용하여 EV 통신을 방해하고 안드로겐 신호를 보내 암 진행을 억제할 수 있기 때문입니다. 골육종에서 EV를 통한 의사소통에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도, 이 방법은 다른 많은 암 유형에도 적용될 수 있습니다. 실제로, 중간엽 줄기 세포에서 유래한 골수는 암을 지원하는 세포로 분화할 수 있는 더 많은 부위로 쉽게 모집됩니다.먼저 175제곱센티미터 플라스크 8개에 각각 300만 개의 143B 세포를 파종합니다. EV가 고갈된 배지를 사용하여 36-48시간 동안 세포를 배양합니다. 세포가 80-90% confluent일 때 EV 분리를 위해 8개의 플라스크에서 상등액을 수집합니다.다음으로, 차등 원심분리를 사용하여 상층액에서 모든 세포와 세포 파편을 제거합니다. 이것은 섭씨 4도에서 최대 가속 및 감속과 함께 반복적인 원심분리로 구성됩니다. 각 원심분리 단계 후에 상층액을 수집하고 원심분리 튜브에 상층액 1ml를 남깁니다.이제 미리 세척된 상층액을 튜브당 38.5ml의 초원심분리기 튜브에 로드합니다. 그런 다음 70, 000g에서 1시간 동안 초원심분리기를 사용하여 EV를 분리하고 천천히 휴식을 취하고 섭씨 4도에서 가열합니다. 초원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 약 1ml를 남깁니다.그런 다음 나머지 부피에 EV 함유 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 모든 서스펜션을 풀링합니다. 그리고 풀링된 현탁액을 PBS로 세척하십시오.튜브를 38.5ml까지 채웁니다. 그런 다음 초원심분리 주기를 반복하되 휴식은 사용하지 마십시오. 로터는 약 한 시간 후에 회전을 멈춰야 합니다.다음으로, 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하고 100-200 마이크로 리터의 용액을 남겨 둡니다. 마지막으로 EV 펠릿을 다시 현탁시키고 PBS로 최종 부피를 200마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 EV는

a-preclinical-mouse-model-osteosarcoma-to-define-extracellular

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수...

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

이 비디오는 종양 괴사 인자 관련 세포자멸사 유도 리간드 또는 TRAIL을 발현하는 유전자 조작 중간엽 줄기 세포 또는 MSC가 파종된 바이오 골격의 이미지 유도 종양 절제 및 이식을 위한 수술 절차를 보여줍니다. 이러한 치료용 MSC는 뇌종양 치료에 잠재력이 있습니다.

쥐 모델에서 형광 유도 종양 절제 및 MSC 시드 골격 이식: 마우스 모델에서 뇌 종양 절제강에 치료용 중간엽 줄기세포를 전달하는 수술 절차

이 원고는 종양 저산소증이 전이에 미치는 영향을 직접 테스트하고 그 작용 메커니즘을 해독할 수 있는 동물 모델의 개발을 설명합니다. 여기에 설명된 실험은 유잉 육종에 초점을 맞추고 있지만, 다른 종양 유형에도 유사한 접근법을 적용할 수 있습니다.

종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

여기, 우리 제시 프로토콜 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대에 대 한 Li Fraumeni 증후군 (LFS) 환자 파생된 섬유 아 세포, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)를 통해 Ipsc의 차별화에서에서 osteoblasts, 및 모델링 비보 tumorigenesis LFS 환자 파생 osteoblasts를 사용 하 여입니다.

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

다리 (OS)의 뼈 기질 (괜 찮) 모델은 잘 설립 하 고 그림 여기. 그것은 기본 종양 성장에서 생체 외에서 흉내 낸 및 OS의 조직학 및 cytogenic이 공부에 대 한 이상적인 모델을 제공 하는 적당 한 발판으로 사용할 수 있습니다.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

여기서 설명된 메틸화 특이적 프로브 증폭 방법은 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포에서 LINE-1 원소의 메틸화 수준을 분석하는 방법이다. 태아 소 혈청에서 세포 외 소포를 분리하는 인기있는 절차인 초원심분리도 입증되었습니다.

골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석

여기서, 전이 생물학의 전임상 조사에 사용될 수 있는 자발적인 폐 전이와 함께 골육종의 절단 절차를 따르는 회제 성 직소 이식이 기술되고 새로운 치료법의 개발이 설명된다.

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델

본 프로토콜은 동위원소 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하기 위해 경막내 골육종 세포 주사를 기술한다.

경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성

이 프로토콜은 골육종 마우스 모델의 Yiqi Jiedu 달인을 예로 들어 달인 공식 및 gavage 기술의 자세한 표준화 프로세스를 제공합니다. 동물 보호에 대해 설명하고 연구 데이터의 신뢰성을 개선하여 생체 내 달인 공식의 치료 효능 및 분자 메커니즘을 조사하기 위한 효과적인 전략을 제공합니다.

골육종 모델 마우스에서 중국 전통 의학의 달인 공식에 대한 Gavage 전략

본 프로토콜은 인간 골육종 조직을 이용하여 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명한다.

인간 골육종 조직을 이용한 환자 유래 이종이식 마우스 모델 구축

학습하세요 종양 유래 세포 외 소포체와 중간 엽 줄기 세포 간의 상호작용을 전임상 마우스 모델로 연구하는 방법을. 이 기법은 암 진행 및 전이 형성에서 줄기 세포 적응의 역할을 생체 내에서 분석하는 데 활용됩니다.

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

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