종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

이 실험 절차의 전반적인 목표는 종양과 중간엽 줄기세포 사이의 세포외 소포 매개 통신의 역할을 연구하기 위해 전임상 마우스 모델을 개발하는 것입니다. 이 방법은 종양과 중간엽 줄기세포가 세포외 소포체를 통해 어떻게 소통하는지, 그리고 이것이 암 진행을 지원하는지 여부에 대한 암 생물학 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 진행 및 전이 형성에 대한 암 EV에 의한 중간엽 줄기세포 적응의 역할을 연구할 수 있다는 것입니다.

이 절차의 의미는 암 치료로 확장되는데, GSA를 사용하여 EV 통신을 방해하고 안드로겐 신호를 보내 암 진행을 억제할 수 있기 때문입니다. 골육종에서 EV를 통한 의사소통에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도, 이 방법은 다른 많은 암 유형에도 적용될 수 있습니다. 실제로, 중간엽 줄기 세포에서 유래한 골수는 암을 지원하는 세포로 분화할 수 있는 더 많은 부위로 쉽게 모집됩니다.

먼저 175제곱센티미터 플라스크 8개에 각각 300만 개의 143B 세포를 파종합니다. EV가 고갈된 배지를 사용하여 36-48시간 동안 세포를 배양합니다. 세포가 80-90% confluent일 때 EV 분리를 위해 8개의 플라스크에서 상등액을 수집합니다.

다음으로, 차등 원심분리를 사용하여 상층액에서 모든 세포와 세포 파편을 제거합니다. 이것은 섭씨 4도에서 최대 가속 및 감속과 함께 반복적인 원심분리로 구성됩니다. 각 원심분리 단계 후에 상층액을 수집하고 원심분리 튜브에 상층액 1ml를 남깁니다.

이제 미리 세척된 상층액을 튜브당 38.5ml의 초원심분리기 튜브에 로드합니다. 그런 다음 70, 000g에서 1시간 동안 초원심분리기를 사용하여 EV를 분리하고 천천히 휴식을 취하고 섭씨 4도에서 가열합니다. 초원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 약 1ml를 남깁니다.

그런 다음 나머지 부피에 EV 함유 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 모든 서스펜션을 풀링합니다. 그리고 풀링된 현탁액을 PBS로 세척하십시오.

튜브를 38.5ml까지 채웁니다. 그런 다음 초원심분리 주기를 반복하되 휴식은 사용하지 마십시오. 로터는 약 한 시간 후에 회전을 멈춰야 합니다.

다음으로, 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하고 100-200 마이크로 리터의 용액을 남겨 둡니다. 마지막으로 EV 펠릿을 다시 현탁시키고 PBS로 최종 부피를 200마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 EV는 TEM으로 특성화하거나, 흡수 실험을 위해 염료로 라벨링하거나, 생체 내 실험을 위해 중간엽 줄기 세포를 교육하는 데 사용할 수 있습니다.

원발성 MSC가 암 EV에 노출되기 전에 적절한 세포 밀도를 유지하는 것이 중요합니다. 세포는 최적의 세포 EV 비율을 달성하고 교육 기간 동안 과잉 성장을 방지하기 위해 약 70% 융합되어야 합니다. 이 실험은 순응된 성인 Athymic Nude-Foxn1nu 마우스를 사용합니다.

수술 하루 전에 식수를 통해 파라세타몰을 제공하십시오. 수술 당일, PBS에서 200, 000 마이크로 리터로 143B 세포를 준비합니다. 수술 20분 전에 동물에게 부프레노핀을 투여합니다.

마취 직전에 10마이크로리터 주사기에 농축된 143B 세포를 로드합니다. 적절한 마취를 확인하고 안연고를 바른 후 뒷다리가 시술자를 향하도록 동물을 등을 눕힙니다. 다음으로, 마취 마스크를 동물에게 고정합니다.

그런 다음 왼쪽 무릎을 구부리고 70% 에탄올과 포비돈-요오드를 번갈아 가며 3회 스크럽하여 피부를 닦은 다음 2% 리도카인을 국소 진통제로 바릅니다. 이제 무릎 바로 아래 피부를 작게 절개하여 경골을 노출시킵니다. 그런 다음 0.8 millimiter microtwist 드릴을 사용하여 무릎 아래 약 2mm의 경골에 핀홀을 만듭니다.

양쪽 경골 피질을 뚫지 마십시오. 약 5초에 걸쳐 1마이크로리터의 세포를 구멍에 천천히 주입하여 진행합니다. 그런 다음 현탁액의 역류를 방지하기 위해 조직 접착제 한 방울로 구멍을 막습니다.

봉합사와 조직 접착제 한 방울로 피부를 봉합하여 수술을 마칩니다. 동물이 가열로 회복할 때까지 하고 24시간 동안 파라세타몰로 치료하십시오. 이틀 후, 0.5mm 인슐린 주사기를 사용하여 MSC를 꼬리 정맥에 주입합니다.

꼬리 정맥 주입 중 올바른 투여를 육안으로 확인할 수 있습니다. 흰색 영역이 나타나거나 저항이 발생하면 이전 주입 부위보다 높은 영역에 다시 주입하십시오. 그런 다음 일주일에 두 번 생물 발광을 사용하여 종양 성장을 추적합니다.

인슐린 주사기를 통해 마우스에 D-루시페린을 주입하고 10분 후 이미징 시스템을 사용하여 종양 세포에서 생성된 광자 플럭스를 측정합니다. 동물의 종양 직경이 15mm 이상이 되거나 체중 감소가 15%를 초과하면 동물을 안락사시키고 모든 관련 조직을 채취합니다. 안락사 10분 전에 이미징 전과 같이 D-루시페린을 주입합니다.

안락사 후에는 살균된 가위와 핀셋을 사용하여 폐, 간, 비장, 신장을 채취합니다. PBS를 사용하여 장기에서 혈액을 씻어내고 이미징을 위해 페트리 접시에 배열합니다. 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 장기의 양쪽을 문서화합니다.

이미지를 촬영하면 향후 조직학적 분석을 위해 장기를 즉시 고정합니다. 사진 문서를 처리하려면 수동 임계값을 적용하고 각 사진의 결절 수를 계산하기만 하면 됩니다. 각 사진에 대해 동일한 임계값을 사용하고 모든 방향, 특히 폐에서 조직을 문서화해야 합니다.

마우스 경골을 석회질화한 후 탈수 및 파라핀 포매를 진행합니다. 그런 다음 마이크로톰을 사용하여 6미크론 파라핀 절편을 준비하고 유리 슬라이드에 절편을 수집합니다. 슬라이드가 건조되면 실온에서 밤새 보관하십시오.

다음 날, 구연산염 완충액을 사용하여 열 매개 항원 회수를 수행합니다. 그런 다음 1에서 900까지 항-GFP 항체로 조직을 염색하고 DAPI 카운터 스테인으로 이어갑니다. 마지막으로, 형광 현미경을 사용하여 염색된 조직 단면을 문서화합니다.

분리된 EV의 순도는 전자 현미경으로 확인되었습니다. 제제에는 직경이 40나노미터에서 100나노미터 사이의 소포가 포함되어 있었습니다. 암 EV가 MSC와 상호 작용하는지 여부를 평가하기 위해 EV를 녹색 형광 친유성 링커 염료로 라벨링하고 MSC로 밤새 배양했습니다.

따라서 MSC의 효율적인 EV 활용이 확인되었습니다. MSC에 대한 EV의 면역조절 특성은 멀티플렉스 B 기반 사이토카인 면역분석을 사용하여 확인되었습니다. 종양 EV는 인간 섬유아세포 대조군 EV에 비해 MSC에서 IL-8 및 IL-6 생성을 증가시켰습니다.

다음으로, 골육종의 orthotopic xenograft 마우스 모델에서, EV educated MSCs로 처리된 마우스는 종양 성장을 가속화하는 것으로 나타났습니다. GFP 발현 MSC의 전신 주입 4일 후, GFP 발현 세포가 골수와 종양 조직에서 검출되어 MSC가 종양 부위로 귀환하는 것을 입증했습니다. 다양한 장기의 생체 외 영상은 폐 결절 형성을 강조했습니다.

궁극적으로, EV 교육을 받은 MSC를 투여받은 마우스는 폐 전이가 더 많았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생체 외 암 EV로 기질 세포를 교육하는 방법과 전임상 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 교육된 기질 세포의 효과를 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 이 절차는 충분한 암 EV를 사용할 수 있는 경우 4주 이내에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 미리 계획을 세우고 암 세포외 소포체를 재현 가능하게 정제하는 것과 저계대 증식 중간엽 줄기세포를 사용하는 것이 중요합니다.