터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법
March 21st, 2018
종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 임상 샘플에서 고품질 종양 DNA를 얻는 것입니다. 이 방법은 암 연구, 진단 및 치료 결정과 같은 기초 및 임상 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전 방법보다 더 간단하고 빠르게 종양 DNA를 얻을 수 있다는 것입니다.
프로토콜을 시작하려면 장갑을 낀 손으로 미리 준비되고 절제된 조직의 종양 표면을 일반 유리 슬라이드에 여러 번 만집니다. 만진 영역이 유리 슬라이드의 80% 이상을 덮고 있는지 육안으로 확인합니다. 일반 유리 슬라이드를 폴리에틸렌 나프탈레이트 또는 PEN 멤브레인 슬라이드에 가볍게 누르고 장갑을 낀 손으로 두세 번 부드럽게 문지릅니다.
세포가 일반 유리 슬라이드에서 PEN 멤브레인 슬라이드로 옮겨졌는지 육안으로 확인합니다. 유리와 PEN 멤브레인 슬라이드를 모두 실온에서 5분 동안 자연 건조합니다. 건조 후 직접 세포학적 검사를 위해 일반 유리 슬라이드를 염색합니다.
유리 슬라이드를 고착 용액에 5초 동안 담근 다음 Giemsa 염색 용액으로 15초 동안 염색합니다. 빠른 평가를 위해 현미경으로 일반 유리 슬라이드의 종양 내용물과 세포를 완전히 평가하고 스크리닝합니다. 여러 기준에 따라 종양 세포를 평가합니다.
이전 섹션의 빠른 현미경 평가로 샘플에서 종양 세포도가 60% 이상으로 나타나면 칼과 장갑을 낀 손으로 DNA 추출을 위해 PEN 멤브레인 슬라이드의 종양이 닿은 필름을 절단합니다. 절단된 필름을 핀 세트와 장갑을 낀 손으로 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. DNA가 추출될 때까지 필름이 포함된 미세 원심분리 튜브를 섭씨 4도에서 보관하십시오.
소프트웨어를 열고 실행 조건을 계획하고 소프트웨어 내에서 실행 매개변수를 설정합니다. 계획 탭을 클릭하고 템플릿을 선택한 다음 적절한 실행 방법을 선택합니다. 응용 프로그램 및 기술 유형을 선택하고 다음을 클릭합니다.
기기, 시료 준비 키트, 라이브러리 키트 유형, 템플릿 키트, 염기서열분석 키트, 기본 보정 모드, 칩 유형, 제어 시퀀스 및 바코드 세트를 선택하고 다음을 클릭합니다. 플러그인을 선택하고 다음을 클릭합니다. 프로젝트를 선택하고 다음을 클릭합니다.
그런 다음 대상 영역의 기본 참조 및 BED 파일을 선택합니다. 샘플 이름을 입력하고 바코드를 선택한 다음 실행 계획을 클릭합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 자동화된 기기에서 템플릿 준비 및 칩 로딩을 수행합니다.
사용하기 전에 시약 카트리지를 실온에서 45분 동안 해동하십시오. 6.8단계에서 계산한 라이브러리 농도에 따라 희석되지 않은 라이브러리를 뉴클레아제가 없는 물로 희석하고 20개의 피코몰라 라이브러리를 만듭니다. 염기서열분석을 위해 풀링된 라이브러리를 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
100마이크로리터 피펫이 있는 풀링된 라이브러리 25마이크로리터를 샘플 튜브 바닥에 추가합니다. 전원을 켜고 자동화 기기의 덮개를 엽니다. 염기서열분석 칩, 칩 어댑터, 농축 카트리지, 팁 카트리지, PCR 플레이트, PCR 프레임 씰, 회수 튜브, 용액 카트리지 및 시약 카트리지를 자동화 기기의 적절한 위치에 놓습니다.
설정을 터치하고, 실행을 실행하고, 화면을 단계별로 실행합니다. 커버를 닫고 화면에서 시작 확인을 터치합니다. 데크 스캔 프로세스가 끝나면 다음을 터치합니다.
디스플레이 내용물, 키트 유형, 칩 ID, 샘플 ID, 칩 유형, 계획을 확인하십시오. 시간을 설정하고 확인을 터치합니다. 칩 로딩이 끝나면 다음을 터치하고 덮개를 엽니다. 장갑을 낀 손으로 칩 어댑터에서 시퀀싱 칩을 내립니다.
칩을 칩 용기에 넣고 파라필름으로 감싼 다음 염기서열분석 반응이 일어날 때까지 칩을 섭씨 4도에서 보관합니다. 그런 다음 장갑을 낀 손으로 농축 카트리지, PCR 플레이트, PCR 프레임 씰, 회수 튜브, 용액 카트리지 및 시약 카트리지를 자동화 기기의 적절한 위치에서 제거합니다. 빈 팁 카트리지를 장갑을 낀 손으로 자동화 기기의 폐기 팁 위치로 옮깁니다.
다음을 터치하고 덮개를 닫습니다. 그런 다음 시작을 터치하고 4분 동안 자외선으로 자동 기기를 청소합니다. 아염소산나트륨 정제를 초순수 1, 000밀리리터에 녹이고 0.22미크론 필터로 용액을 여과합니다.
염기서열분석 기기가 예열되면 염기서열분석 기기의 화면에서 청소와 다음을 터치합니다. 250ml의 필터 멸균 아염소산나트륨 용액으로 염기서열분석 기기를 세척한 다음 250ml의 초순수로 세척합니다. 그런 다음 초기화를 터치하고 화면에서 적절한 시퀀싱 키트를 선택합니다.
장갑을 낀 손으로 회색 배송업체를 설치하십시오. 염기서열분석 기기를 세척 용액, pH 조정 용액 및 pH 표준물질 용액으로 초기화합니다. 다음으로, 100마이크로리터 피펫을 사용하여 50ml 튜브에 20마이크로리터의 DATP, DGTP, DCTP 및 DTTP 뉴클레오티드를 추가합니다.
장갑을 낀 손으로 적절한 위치에 회색 배송업체를 설치하십시오. 50ml 튜브를 로드하고 염기서열분석 기기에 나사로 고정합니다. 화면에서 다음을 선택하여 초기화 단계를 시작합니다.
초기화 단계를 완료한 후 화면에서 실행을 터치하고 적절한 라이브러리 준비 기기를 선택합니다. 칩의 2차원 바코드를 스캔합니다. 시퀀싱 칩을 적절한 위치에 삽입합니다.
칩 cl을 닫습니다.amp 및 기기 도어를 누르고 화면에서 칩 확인을 터치한 다음 OK를 눌러 시퀀싱 실행을 시작합니다. 염기서열분석 반응 후 데이터를 전송하고 염기서열분석 서버에서 데이터 분석 파이프라인을 수행합니다. 게놈 DNA의 분해 수준을 나타내는 지표인 절대 DNA 수량과 RQ 값은 FFPE 검체에 비해 TIC 검체를 사용하여 더 높은 DNA 수율을 달성했음을 보여줍니다.
또한, TIC DNA의 RQ 값은 다양한 종양 유형에서 FFPE DNA의 RQ 값에 비해 유의하게 높았습니다. APC Q1367*은 1번 부위에서 추출한 FFPE 및 TIC DNA에서 확인되었으며, APC S1356*KRAS G12D 및 TP53 M237i는 2, 3, 4번 부위에서 추출한 FFPE 및 TIC DNA 모두에서 검출되었으며, 이는 동일한 종양 부위에서 준비된 쌍을 이룬 FFPE 및 TIC DNA 샘플에서 동일한 체세포 돌연변이가 확인되었음을 시사합니다. 특히, 원발성 결장직장암과 2개의 전이성 간암 샘플 사이에서 동일한 체세포 돌연변이가 검출되었는데, 이는 2번 부위의 종양 클론이 간으로 전이되었음을 시사한다.
개발 후 이 기술은 분자 및 의학 연구 분야의 연구자들이 유전적 암을 식별할 수 있는 길을 열었습니다.
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개요
이 기사는 접촉 찍기 세포학 시료를 사용하여 종양 조직에서 고품질 유전체 DNA를 얻는 신속한 방법을 제시합니다. 이 기술은 종양 세포를 농축하는 과정을 단순화하여 차세대 시퀀싱을 통한 유전자 분석을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 유전체 DNA 추출
- 암 연구
- 차세대 시퀀싱
배경
- 고품질 DNA는 유전자 변이를 분석하는 데 중요합니다.
- 전통적인 DNA 추출 방법은 복잡하고 시간이 많이 소요될 수 있습니다.
- 접촉 찍기 세포학은 과정을 단순화할 수 있는 기술입니다.
- 이 방법은 종양 DNA를 빠르고 효율적으로 수집할 수 있습니다.
연구 목적
- 종양 DNA를 얻는 간단한 방법을 개발하기 위함입니다.
- 암 연구에서 유전자 분석의 효율성을 향상시키기 위함입니다.
- 임상 응용을 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 종양 표면을 유리 슬라이드에 닿기시키기.
- 슬라이드의 80% 이상을 덮도록 하기.
- 찍힌 영상을 PEN 멤브레인 슬라이드로 옮기기.
- 슬라이드를 부드럽게 문질러 세포를 수집하기.
주요 결과
- 이 방법은 종양 세포를 성공적으로 농축합니다.
- 고품질 DNA를 빠르게 얻을 수 있습니다.
- 이 기술은 이전 방법보다 간단합니다.
- 암 진단 및 치료에 잠재적인 응용이 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 DNA 추출에 대한 신속한 접근법을 제공합니다.
- 암 유전학에 중요한 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
- 이 방법은 종양학에서의 임상 결정 과정을 개선할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Obtaining high-quality tumor DNA is a critical inflection point for molecular profiling and targeted therapy selection in oncology drug development. The touch imprint cytology (TIC) method enables rapid, reliable extraction of intact genomic DNA from clinical specimens, overcoming the limitations of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples. This capability enhances predictive confidence in downstream genetic analyses and accelerates decision-making across discovery and translational pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of tumor mutational status for target validation.
- Reduces biological ambiguity by providing higher-quality DNA than FFPE samples.
- Supports confident identification of actionable genetic alterations for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tumor DNA for next generation sequencing and PCR-based assays.
- Improves assay reproducibility and standardization by ensuring DNA integrity and quantity.
- Enables rapid turnaround for genetic testing, supporting high-throughput screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant biomarker discovery by preserving tumor-specific genetic signatures.
- Ensures continuity from clinical sample acquisition to preclinical model validation.
- De-risks translational research by minimizing sample degradation and data loss.
Pipeline & Workflow Integration
The TIC method integrates at the interface of clinical sample acquisition and molecular analysis, supporting workflows from early discovery through translational research.
- Discovery Biology: Provides high-integrity DNA for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative DNA inputs for sequencing and PCR assays.
- Analytics: Enables accurate measurement of mutational status and DNA quality metrics (e.g., RQ value).
- Translational Research: Maintains genetic fidelity for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, rapid protocol adaptable across tumor types and research sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic analyses.
- Operational Value: Streamlines DNA extraction with rapid, reproducible workflows and minimal sample loss.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and reduces late-stage risk by improving data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of molecular targets and candidate therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cytological assessment and DNA extraction protocols.
- Needs access to microscopy, PEN membrane slides, and sequencing instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample handling and quality assessment.
- Adaptable to various tumor types but dependent on sufficient tumor cellularity.
- Limited by the need for resected tissue and initial cytological evaluation.
