Name: 터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 배우세요 터치 인쇄물 세포학을 사용하여 병리 임상 표본에서 고품질 종양 DNA를 간단하고 신속하게 추출하는 방법입니다. 이 기술은 차세대 염기서열분석을 위한 종양 세포 농축을 용이하게 하여 암 유전학 연구와 임상 진단에 활용됩니다.

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우리는 병원과 환자 들의 의료 및 보조 직원 참여 동의 감사. 우리는 가브리엘 화이트 울프,이 보고서의 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac)에서 박사 학위를 감사 합니다. 이 연구는 야마나시 현 (Y.H. 고 지)에서 게놈 연구 프로젝트와 부여에서는 야스다 의료 재단 (Y.H.)는 특정에 의해 지원 되었다.

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<li>Adhya, A. K., Mohanty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+touch+imprint+cytology+in+the+preoperative+diagnosis+of+malignancy+in+low+resource+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting.</a> Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).</li>
<li>Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+Imprint+Cytology+and+Frozen-section+Analysis+for+Intraoperative+Evaluation+of+Sentinel+Nodes+in+Early+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer.</a> Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).</li>
<li>Sumiyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+intraoperative+touch+smear+cytology+in+breast-conserving+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery.</a> Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).</li>
<li>Amemiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+imprint+cytology+with+massively+parallel+sequencing+%28TIC-seq%29%3A+a+simple+and+rapid+method+to+snapshot+genetic+alterations+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors.</a> Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).</li>
<li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+multiple+lung+cancers%3A+Discrimination+between+primary+and+metastatic+lung+cancers+by+genomic+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile.</a> Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).</li>
<li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+tumor-derived+DNA+dispersed+in+the+airway+improves+the+diagnostic+accuracy+of+bronchoscopy+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer.</a> Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+and+exome+sequencing+identified+somatic+mutations+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+two+amplicon-based+sequencing+panels+of+different+scales+in+the+detection+of+somatic+mutations+associated+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer.</a> BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+HER2+V777L+mutation+mediates+resistance+to+trastuzumab+in+a+breast+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient.</a> Med Oncol. 34 (1), 3(2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+BRCA1+and+BRCA2+germline+mutations+in+Japanese+population+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigene+panel+analysis+identified+germline+mutations+of+DNA+repair+genes+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).</li>
<li>Lièvre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+status+is+predictive+of+response+to+cetuximab+therapy+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).</li>
<li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+or+Platinum-Pemetrexed+in+EGFR+T790M-Positive+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci rep. 13 (3), 3493(2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 우리는 콩을 사용 하 여 임상 병리학 표본에서 종양 DNA를 얻기 위해 다른 방법을 제시. TIC 준비는 매우 간단 하 고 특별 한 악기10에 대 한 요구 사항 없이 FFPE 방법에 비해 더 적은 시간이 필요. (그림 1) 2 이내 TIC 준비에서 DNA 추출에 모든 절차를 완료할 수 있습니다. 이 메서드는 따라서 유전자 검사를 수행 하기 위한 처리 시간이 줄어듭니다. 특히, 분자 분석에 필요한 일 수 단축에 상당한 이점을 제공 합니다. 이 짧은 처리 시간 즉시 분자로 대상된 약물을 필요로 하는 진보적인 암 환자에 대 한 적절 한 치료를 제공할 수 있습니다. 따라서이 방법은 종양에서 유전 변경의 분석 및 암 치료에 대 한 분자로 대상된 약물의 관리에 대 한 혜택을 제공합니다.
TIC DNA 유전자 분석에 대 한 사용의 성공에 대 한 몇 가지 핵심 포인트 들이 있다. 종양 ...

차세대 시퀀싱 기술 제공 하고있다 연구팀은 유전자 변형, Mendelian 질병, 유전 경향, 및 암 1,2,3 게놈 정보 분석에 중요 한 발전 . 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 및 국제 암 게놈 컨소시엄 (ICGC) 유전 변경 일반적인 암4의 여러 종류의 식별을 추구 했습니다. 수백 개의 필수 암 드라이버 유전자 성공적으로 확인 되었습니다, 그리고 이러한 분자의 일부 약물 개발1,,56타겟이 되고있다.
임상 설정에서 FFPE 표본 병 적인 진단과 분자 암 등 각종 질병에 대 한 테스트를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 포 르 말린으로 고정 과정 DNA-단백질 또는 DNA-DNA cross-linking과 DNA 파편을 유도. 따라서, FFPE DNA 샘플 적합 하지 않습니다 항상 유전자 분석에 대 한 낮은 질 및 양의 DNA7,,89. 또한, 고 기술 섹션을 정확 하 게 준비 해야 하는 FFPE 표본 준비를 몇 일 걸립니다. 따라서, 그것은 높은-품질 그대로 DNA를 얻기 위한 간단 하 고 빠른 방법을 개발 하는 것이 좋습니다.
세포학 병 적인 진단 위한 대체 방법입니다. Cytological 샘플 준비는 간단 하 게, 덜 FFPE 준비10에 비해 비싸고 더 빠른 접근 이다. TIC 기술 센 티 넬 림프절과 몇 년11,12자가 빠른 진단을 위해 유방암 환자에서 한계 조직에 수행 되었습니다. 그러나, TIC 표본에서 높은-품질 게놈 DNA를 추출할 수 있습니다 여부를 조사 하 고 후속 유전자 분석에 사용 되는 몇 가지 보고 있다. Cytological 표본은 일반적으로 물 들일 Papanicolaou (Pap) 또는 Giemsa 얼룩, 그리고 우리 이전 TIC 표본 (특히 Giemsa 얼룩이 샘플)에서 추출한 DNA의 품질과 양을 FFPE에서 얻은 샘플을 우수 하다는 것을 보고 조직13. Pap 얼룩과 비교, Giemsa 얼룩 장점이 덜 착 절차 요구에 있습니다. Pap 얼룩에 샘플 수정 되 고 스테인드, 후 그들은 해야 합니다 탑재할 종양 세포, 정상 세포를 현미경으로 염증 세포 등 샘플 내용을 구별을 위한 매체 (예, Malinol)를 장착. Pap 견본 설치 단계 없이, 준비 하는 경우 거의 불가능 한 표본은 건조 하기 때문에 현미경으로 세포를 관찰 하는 것 아니다. 비교에서는, Giemsa 얼룩 말린된 상태에서 관찰 될 수 있다, 그러므로, 설치 단계 빠른 세포 평가 위해 필요 하지 않습니다. 서, 대 한 Giemsa 얼룩은 더 적당 한 건조 표본 필요 하기 때문 에입니다.
이 보고서에서 우리 TIC 표본을 Giemsa 얼룩과 준비에 대 한 간단 하 고 빠른 방법을 소개 하 고 TIC가 더 나은 FFPE 표본에 비해 DNA에 대 한 설명.

<table><tbody><tr><td>FINE FROST white20 마이크로 슬라이드 유리</td><td>Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN 멤브레인 유리 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick A 솔루션</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick B 솔루션</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald 솔루션</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa 용액</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNase P 검출 시약 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>FFPE DNA QC 어세이 v2</td><td>의 TaqMan 어세이Thermo Fisher Scientific</td><td>4324034</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well 반응 플레이트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>이온 라이브러리 TaqMan 정량 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4468802</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 암 핫스팟 패널 v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 라이브러리 키트 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4480442</td><td></td></tr><tr><td>Ion Xpress 바코드 어댑터 1-16 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4471250</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Hi-Q View 염기서열분석 키트(200 base)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chef System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-well Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>Ion 318 Chip Kit v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Wash 2 Bottle kit</td><td>Thermo 피셔 사이언티픽</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&trade; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>16-위치 자기 스탠드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; 광학 96웰 반응 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; 투명 접착 필름</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&trade; XP 키트</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(99.5)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(10M)</td><td>시그마</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-2XLS+</td><td>메틀러 토레도</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-10XLS+</td><td>메틀러 토레도</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-20XLS+</td><td>메틀러 토레도</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-100XLS+</td><td>메틀러 토레도</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-200XLS+</td><td>메틀러 토레도</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-1000XLS+</td><td>메틀러 토레도</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>쁘띠 체인지</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td><td>미니 원심분리기</td></tr><tr><td>쁘띠 인큐베이터</td><td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>에어 인큐베이터</td></tr><tr><td>SensiCare 무분유 니트릴 검사 장갑</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>멸균 거즈</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>냉장고 MediCool</td><td>SANYO</td><td>MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.130</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.260</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER S</td><td>FEATHER</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>Vortex mixer</td></tr><tr><td>Pincette</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 튜브</td><td>바이오빅</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table>

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 dna를 간단 하 고 빠른 방법

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

그것은 관리와 암 환자에 대 한 특정 분자 표적된 약의 치료 전에 암에서 mutational 상태를 결정 하는 중요 한입니다. 임상 설정에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 유전자 테스트를 위한 널리 사용 됩니다. 그러나, FFPE DNA는 일반적으로 손상 되 고 포 르 말린으로 고정 과정 조각. 따라서, FFPE DNA는 때로는 낮은 품질 및 수량 DNA의 유전자 검사에 적합 하지. 여기 우리가 터치 인쇄물 세포학 (TIC), 암 세포에서 게놈 DNA를 현미경으로 관찰 될 수 있는 방법 제시. 셀 형태 및 암 세포 숫자는 TIC 견본을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 또한, TIC 샘플에서 게놈 DNA 추출 2 이내에 완료할 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 얻은 TIC DNA의 품질과 총 FFPE DNA 보다 높았다. 이 신속 하 고 간단한 방법 연구를 결과 보고에 대 한 처리 시간을 단축 하 고 유전자 검사 (예를 들어, 다음 세대 시퀀싱 분석, 디지털 PCR 및 양적 실시간 PCR)에 대 한 높은-품질 DNA를 수 있습니다.

그림 1 에서 DNA 추출 TIC 표본을 준비 전체 프로세스를 보여 줍니다. 특히, 절차 TIC 샘플에서 게놈 DNA를만 2 일 걸립니다. 우리는 슬라이드 처리 하기 전에 종양 스토리지의 어떤 효과 평가합니다. 우리는 조직 표본을 즉시 슬라이드에 감동 했다 그리고 염 분 moistened 살 균-거 즈에 1 h (그림 2)에 대 한 조직을 유지 했다 종양 세포를 유리 슬라이드에 연결 된 발견. 그러나, 조직 실 온에서 보관 했다 때 종양 세포 했다 잘 연결 되지 슬라이드에. 준비 슬라이드 3 개월간 4 ° C에서 저장 될 수 있었다. 따라서, 그것은 건조 표본 수 있도록 중요 하지 않습니다.
우리는 우리의 방법의 유틸리티를 검사 하 고 표본 FFPE를 사용 ...

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 임상 샘플에서 고품질 종양 DNA를 얻는 것입니다. 이 방법은 암 연구, 진단 및 치료 결정과 같은 기초 및 임상 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전 방법보다 더 간단하고 빠르게 종양 DNA를 얻을 수 있다는 것입니다.프로토콜을 시작하려면 장갑을 낀 손으로 미리 준비되고 절제된 조직의 종양 표면을 일반 유리 슬라이드에 여러 번 만집니다. 만진 영역이 유리 슬라이드의 80% 이상을 덮고 있는지 육안으로 확인합니다. 일반 유리 슬라이드를 폴리에틸렌 나프탈레이트 또는 PEN 멤브레인 슬라이드에 가볍게 누르고 장갑을 낀 손으로 두세 번 부드럽게 문지릅니다.세포가 일반 유리 슬라이드에서 PEN 멤브레인 슬라이드로 옮겨졌는지 육안으로 확인합니다. 유리와 PEN 멤브레인 슬라이드를 모두 실온에서 5분 동안 자연 건조합니다. 건조 후 직접 세포학적 검사를 위해 일반 유리 슬라이드를 염색합니다.유리 슬라이드를 고착 용액에 5초 동안 담근 다음 Giemsa 염색 용액으로 15초 동안 염색합니다. 빠른 평가를 위해 현미경으로 일반 유리 슬라이드의 종양 내용물과 세포를 완전히 평가하고 스크리닝합니다. 여러 기준에 따라 종양 세포를 평가합니다.이전 섹션의 빠른 현미경 평가로 샘플에서 종양 세포도가 60% 이상으로 나타나면 칼과 장갑을 낀 손으로 DNA 추출을 위해 PEN 멤브레인 슬라이드의 종양이 닿은 필름을 절단합니다. 절단된 필름을 핀 세트와 장갑을 낀 손으로 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. DNA가 추출될 때까지 필름이 포함된 미세 원심분리 튜브를 섭씨 4도에서 보관하십시오.소프트웨어를 열고 실행 조건을 계획하고 소프트웨어 내에서 실행 매개변수를 설정합니다. 계획 탭을 클릭하고 템플릿을 선택한 다음 적절한 실행 방법을 선택합니다. 응용 프로그램 및 기술 유형을 선택하고 다음을 클릭합니다.기기, 시료 준비 키트, 라이브러리 키트 유형, 템플릿 키트, 염기서열분석 키트, 기본 보정 모드, 칩 유형, 제어 시퀀스 및 바코드 세트를 선택하고 다음을 클릭합니다. 플러그인을 선택하고 다음을 클릭합니다. 프로젝트를 선택하고 다음을 클릭합니다.그런 다음 대상 영역의 기본 참조 및 BED 파일을 선택합니다. 샘플 이름을 입력하고 바코드를 선택한 다음 실행 계획을 클릭합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 자동화된 기기에서 템플릿 준비 및 칩 로딩을 수행합니다.사용하기 전에 시약 카트리지를 실온에서 45분 동안 해동하십시오. 6.8단계에서 계산한 라이브러리 농도에 따라 희석되지 않은 라이브러리를 뉴클레아제가 없는 물로 희석하고 20개의 피코몰라 라이브러리를 만듭니다. 염기서열분석을 위해 풀링된 라이브러리를 준비하고 얼음 위에 보관합니다.100마이크로리터 피펫이 있는 풀링된 라이브러리 25마이크로리터를 샘플 튜브 바닥에 추가합니다. 전원을 켜고 자동화 기기의 덮개를 엽니다. 염기서열분석 칩, 칩 어댑터, 농축 카트리지, 팁 카트리지, PCR 플레이트, PCR 프레임 씰, 회수 튜브, 용액 카트리지 및 시약 카트리지를 자동화 기기의 적절한 위치에 놓습니다.설정을 터치하고, 실행을 실행하고, 화면을 단계별로 실행합니다. 커버를 닫고 화면에서 시작 확인을 터치합니다. 데크 스캔 프로세스가 끝나면 다음을 터치합니다.디스플레이 내용물, 키트 유형, 칩 ID, 샘플 ID, 칩 유형, 계획을 확인하십시오. 시간을 설정하고 확인을 터치합니다. 칩 로딩이 끝나면 다음을 터치하고 덮개를 엽니다. 장갑을 낀 손으로 칩 어댑터에서 시퀀싱 칩을 내립니다.칩을 칩 용기에 넣고 파라필름으로 감싼 다음 염기서열분석 반응이 일어날 때까지 칩을 섭씨 4도에서 보관합니다. 그런 다음 장갑을 낀 손으로 농축 카트리지, PCR 플레이트, PCR 프레임 씰, 회수 튜브, 용액 카트리지 및 시약 카트리지를 자동화 기기의 적절한 위치에서 제거합니다. 빈 팁 카트리지를 장갑을 낀 손으로 자동화 기기의 폐기 팁 위치로 옮깁니다.다음을 터치하고 덮개를 닫습니다. 그런 다음 시작을 터치하고 4분 동안 자외선으로 자동 기기를 청소합니다. 아염소산나트륨 정제를 초순수 1, 000밀리리터에 녹이고 0.22미크론 필터로 용액을 여과합니다.염기서열분석 기기가 예열되면 염기서열분석 기기의 화면에서 청소와 다음을 터치합니다. 250ml의 필터 멸균 아염소산나트륨 용액으로 염기서열분석 기기를 세척한 다음 250ml의 초순수로 세척합니다. 그런 다음 초기화를 터치하고 화면에서 적절한 시퀀싱 키트를 선택합니다.장갑을 낀 손으로 회색 배송업체를 설치하십시오. 염기서열분석 기기를 세척 용액, pH 조정 용액 및 pH 표준물질 용액으로 초기화합니다. 다음으로, 100마이크로리터 피펫을 사용하여 50ml 튜브에 20마이크로리터의 DATP, DGTP, DCTP 및 DTTP 뉴클레오티드를 추가합니다.장갑을 낀 손으로 적절한 위치에 회색 배송업체를 설치하십시오. 50ml 튜브를 로드하고 염기서열분석 기기에 나사로 고정합니다. 화면에서 다음을 선택하여 초기화 단계를 시작합니다.초기화 단계를 완료한 후 화면에서 실행을 터치하고 적절한 라이브러리 준비 기기를 선택합니다. 칩의 2차원 바코드를 스캔합니다. 시퀀싱 칩을 적절한 위치에 삽입합니다.칩 cl을 닫습니다.amp 및 기기 도어를 누르고 화면에서 칩 확인을 터치한 다음 OK를 눌러 시퀀싱 실행을 시작합니다. 염기서열분석 반응 후 데이터를 전송하고 염기서열분석 서버에서 데이터 분석 파이프라인을 수행합니다. 게놈 DNA의 분해 수준을 나타내는 지표인 절대 DNA 수량과 RQ 값은 FFPE 검체에 비해 TIC 검체를 사용하여 더 높은 DNA 수율을 달성했음을 보여줍니다.또한, TIC DNA의 RQ 값은 다양한 종양 유형에서 FFPE DNA의 RQ 값에 비해 유의하게 높았습니다. APC Q1367*은 1번 부위에서 추출한 FFPE 및 TIC DNA에서 확인되었으며, APC S1356*KRAS G12D 및 TP53 M237i는 2, 3, 4번 부위에서 추출한 FFPE 및 TIC DNA 모두에서 검출되었으며, 이는 동일한 종양 부위에서 준비된 쌍을 이룬 FFPE 및 TIC DNA 샘플에서 동일한 체세포 돌연변이가 확인되었음을 시사합니다. 특히, 원발성 결장직장암과 2개의 전이성 간암 샘플 사이에서 동일한 체세포 돌연변이가 검출되었는데, 이는 2번 부위의 종양 클론이 간으로 전이되었음을 시사한다.개발 후 이 기술은 분자 및 의학 연구 분야의 연구자들이 유전적 암을 식별할 수 있는 길을 열었습니다.

simple-rapid-method-to-obtain-high-quality-tumor-dna-from-clinical

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

순환 종양 세포는 세포 손상을 보면서 겁에 질리게하지 않고 암 환자의 혈액으로부터 격리됩니다. 종양 세포의 분리는 상피 마커에 대한 항체 이외에 E-selectin의 bimolecular 표면을 사용하여 수행됩니다. 나노튜브 코팅은 특별히 높은 캡처 purities 결과 암 세포 접착을 촉진합니다.

환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

이 프로토콜은 포르말린이 고정된 파라핀 내장 생검 조직에서 거대세포바이러스의 qPCR 검출을 설명하며, 이는 빠르고 민감하며 특이적이며 모호한 헤마톡실린 및 에오신 또는 면역조직화학적 염색 패턴을 해석하는 데 유용합니다.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

이 프로토콜은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45+ 세포(림프구/백혈구)의 정성적 및 정량적 평가를 위해 신선한 인체 조직 조각의 신속한 비효소적 해리를 설명합니다. 또한, 일차 조직 균질액으로부터 얻어진 상등액은 추가 분석 또는 실험을 위해 수집 및 저장될 수 있습니다.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

여기에 우리가 존재 바이오 입자의 수​​집을위한 최적화하고 효율적인 제거 전략을 설명 한 번에 5 ㎕를 마이크로 볼륨 용해 / STR 증폭을 포함하는 향상된 증폭 프로토콜과 함께, 샘플 'DNA 터치'를,의 회복을 허용하는 짧은 탠덤 반복 (STR) 바이오 입자 기증자 (들)의 프로필.

법의학 &#39;터치 DNA&#39;증거에서 간체 미세 조작술에 의해 복구 된 단일 인간 Bioparticles의 향상된 유전자 분석

이 원고는 두 개의 차세대 염기서열분석 패널에 대한 임상 프로토콜을 설명합니다. 한 패널은 혈액학적 악성 종양을 조사하고 다른 패널은 고형 종양에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 유전자를 대상으로 합니다. 인간 악성 종양에서 드라이버 돌연변이의 분자 분류는 귀중한 예후 및 예측 정보를 제공합니다.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

피부 종양은 모스 (Mohs) 현미경 수술 후 폐기됩니다. 임상 지원 직원이 임상 작업을 방해하지 않고 하류 실험실 응용을위한 피부 종양 ( 예 : 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색 종) 샘플을 효과적으로 처리하고 저장할 수있는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.

클리닉 기반 생물 저장소의 설립

우리는 종양 세포의 특성에 대 한 새로운 접근을 제시. 우리 DNA 형광-제자리에서면역 형광 결합-셀 기능성된 의료 와이어에 vivo에 직접 환자의 혈액에서에서 CTCs를 풍부 하 게의 수에 의해 점령을 평가 하는 교 잡.

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

이 프로토콜은 포르말린-고정된 파라핀-포매된 조직 샘플의 퍼센트 종양 함량을 증가시키는 방법을 제시한다.

종양 거대 해부를 통한 종양 내용 향상

배우세요 터치 인쇄물 세포학을 사용하여 병리 임상 표본에서 고품질 종양 DNA를 간단하고 신속하게 추출하는 방법입니다. 이 기술은 차세대 염기서열분석을 위한 종양 세포 농축을 용이하게 하여 암 유전학 연구와 임상 진단에 활용됩니다.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

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