Name: 유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 학습하세요 유전자로 인코딩된 형광 센서를 활용한 독성 산화 스트레스 평가 방법을 실시간 세포 이미징으로 탐구하세요. 이 기술은 높은 특이성과 감도로 산화환원 항상성의 시공간 역학을 연구합니다.

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저자는 Katelyn Lavrich 실험 설계 및 원고 편집에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

1입니다. 셀의 준비
참고:이 절차는 불멸 하 게 셀 라인 (BEAS-2B; lentiviral 변환을 설명 합니다. ATCC, 머내서스, VA) 원하는 기자 roGFP2 (하이퍼)을 표현 하. 다른 셀 라인/형식 및 유전자 이동, transfection, 등의 방법으로 그들은 기자 식 시각화 보기의 필드 (일반적으로 5-10의 세포) 당 센서 표현 세포의 충분 한 수를 적절 한 수준에서 결과 활용할 수 있습니다. 분석 방법에 대 한 궁극적으로 사용 될 접시에 절차를 수행 해야 경우 transfection 방법 (예: transfect 현미경에 나타납니다 같은 접시에 셀). 아래 설명 하는 단계 6-잘 셀 문화 판에서 셀 transductions 준비에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 이 형식이 원하는 응용 프로그램에 대 한 적절 한 크기, 다른 배를 교체하실 수 있습니다.
<ol><li>정상적인 성장 미디어에 약 40-60% 합류 세포 성장. 참고:이 연구는 인간 기관지 상피 세포 선, BEAS-2B keratinocyte 성장 매체 (KGM)에서 재배를 활용.</li>
	<li>변환, 직전 셀에 성장 매체를 수식에 의해 계산으로 바이러스의 적절 한 금액을 포함 하는 혈 청 자유로운 미디어의 500 µ L 바꿉니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq1.jpg"><ol>
<li>BEAS 2B 셀의 변환에 대 한 혈 청 무료 keratinocyte 기저 매체 (KBM) 사용 하 여 바이러스 성 외피 동안 KGM 성장 매체를 대체. 참고: 위의 계산 셀 6 잘 형식에의 한 잘 단일 변환입니다. 필요한 경우, 수행의 여러 transductions 우물 불리고 수 하는 우물의 수 곱셈와 수식을 조정 하 여 수행할 수 있습니다. 5와 20 사이 감염 (MOI)의 다양성을 사용 하 여 lentiviral transductions에 대 한 있습니다. Adenoviral transductions 100과 500 사이의 나 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C 4 h, 간단한 락으로 30 ~ 60 분 마다 접시에 바이러스 성 입자를 재배포 또는 모션 소용돌이에서 바이러스 혼합 셀을 품 어.</li>
	<li>접시에 완전 한 성장 매체의 1 mL을 추가 하 고 추가 4-16 h는 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>모든 미디어를 제거 하 고 신선한 완전 한 성장 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>계속 성장 하 고 셀 통로, 필요에 따라 확장 합니다. 참고: 셀 appreciably 표현 12-48 시간 내 센서를 시작 한다. Lentiviral 벡터 변환에 대 한 사용 되었습니다, 원하는 센서의 안정적인 식 구절에 걸쳐 계속 해야 합니다.</li>
	<li>현미경-기반 평가 대 한 유리로 씨 셀 현미경 요리 바닥과 이미징 전에 원하는 합류 (≥70-80%)을 성장. 참고: 밀도 시드 접시 크기, 사용 되 고 세포 선의 성장 율 시드 다음과 같은 평가의 시간에 따라 달라 집니다. 예를 들어 씨앗 300000 BEAS 2B 세포 성장의 1 일 후 약 70-80% 합류를 35 mm 접시에.</li>
</ol>2. 현미경 설치
참고: 아래에 설명 된 프로토콜 404 및 488 nm 레이저 라인을 갖춘 공초점 현미경을 사용 하 여 수행 됩니다. 그들의 처방된 업무가/방출에이 프로토콜에서 설명 하는 센서의 fluorometric 평가 만들기의 다른 방법을 해야 합니다 또한 가능한 데이터 얻을 수 있습니다. 중요 한 것은, 장비 설정 유형, 나이, 악기 사용 되 고;의 상태에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 따라서, 어떤 악기 값을 언급 한 다른 실험실에서 사용 하는 장비에 특정 하지 않을 수 있습니다.
<ol><li>적절 한 온도 (예를 들어, 37 ° C) 습도 유지 하기 위해 환경 제어를 사용 하 여 모든 이미징 분석 수행 (일반적으로 &gt; 95% 상대 습도), 및 가스 농도 (예를 들면, 5% CO2) 걸쳐 셀에 대 한 적합 한는 실험의 기간입니다.</li>
	<li>상대 습도의 높은 값을 사용 하는 경우 유지 습도 분위기 접촉 수 있습니다 어떤 표면 든 지 (예., 현미경 목표) 이상 약간 온도에 습도 응축을 방지 하기 위해 생성 됩니다. 이 객관적인 히터 테이프 및 적절 한 히터 제어 난방의 사용으로 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>현미경의 모든 구성 요소를 켜고, 510에서 방출 된 488 고 404 nm에서 순차 구동에 필요한 모든 장비를 설정 nm. 광 구성의 모든 구성 요소 실시간 획득에 대 한 적절 하 게 설정 되어 확인 하십시오.</li>
	<li>37 ° c, 5% CO2 분위기, 일정 한 온도 유지 하기 위해 무대 상단 환경 챔버 설정 및 &gt; 95% 습도. 이미지 수집을 시작 하기 전에 모든 환경 컨트롤의 초기 설정 후 적어도 10 분 동안 환경 챔버를 equilibrate. 참고: 환경 조건 제거 또는 실험 길이, 셀 형식, 사용 되 고 노출에 따라 조정 될 수 있습니다.</li>
	<li>환경 챔버 내 무대 위에 셀 (단계 1.7)의 접시를 놓습니다.</li>
	<li>원하는 대물 렌즈와 접 안 렌즈와 하얀 빛을 사용 하 여 셀의 초점면 찾아서 정상적인 형태를 보장. 참고: 1.4 나 60 X 바이올렛-수정, 오일 몰입 렌즈 일반적으로 사용을 허용 하는 confocal 시스템의 광학 해상도 극대화 하면서 세포내 구획의 식별.</li>
	<li>보기의 필드에 있는 셀의 형광 식을 확인 합니다. 적절 한 필터 세트, fluorescein isothiocyanate (FITC) 등 넓은 필드 형광 조명 아래 셀을 시각화 하는 동안 그것을 할. 이 시점에서, 사용 하 여 넓은 필드 조명 동안 있기 때문에 쉽게 공부 하는 셀의 필드를 선택 하려면 요리를 이동 하는 접 안 렌즈를 통해 보고 하는 것이 더 편리. 일반적으로, 녹색 형광으로 표시, 센서를 표현 하는 적어도 5 ~ 10 셀을 포함 하는 필드의 보기를 선택 합니다.<ol>
<li>또는, confocally 표현 되는 센서와 가장 호환 되는 파장에서 레이저 여기를 사용 하 여이 평가 수행 (488 nm는 일반적으로 최고의 작품). 주: 그들의 본질적인 형광 속성으로 인해 그것은 더 어려울 것 이다 어느 FITC를 사용 하 여 그 표현 roGFP2 보다 하이퍼를 표현 하는 세포를 구상 하 또는 488 nm. 그러나, 그것은 여전히 희미 한 셀 참조 가능 해야.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 보기 필드 발견 되 면 환경 챔버를 닫습니다. 참고: 연구를 통해 안정적인 초점 비행기의 유지 보수를 용이 하 게 하 고급 현미경 스탠드에서 자주 사용할 수 초점 유지 기능을 사용.</li>
	<li>원하는 노출 기간에 걸쳐 관심의 센서의 최적의 평가 보장 하기 위해 수집 매개 변수를 설정 합니다. 다음은 권장 사항 및 센서 응답의 confocal 영상에 대 한 접근:<ol>
<li>488 nm에서 여기 및 방출 510에 대 한 레이저 전원 조정 nm. 셀, 시각화 수 있도록 레이저 전력 레벨을 선택 하 고 이것을 샘플 또는 복제 요리 사이 일정 하 게 유지. 참고:이 연구를 위해 12%와 1.5% 레이저 전원 사용 되었다 488 고 404 nm 레이저 라인에 각각.</li>
		<li>수집 소프트웨어의 confocal 컨트롤을 사용 하 여 선택 된 초점 비행기는 488에서 검색 하 여 셀 (z 축)의 중심에서 최대한 형광 방출 강도 대 한 최적화 된 z-비행기를 조정 하는 동안 nm. 이것은 쉽게 가장 과다 노출 된 세포에서 z-비행기에 대 한 검색 하는 동안 높은 이득 설정을 사용 하 여 이루어집니다. 적절 한 초점 비행기 발견 되었습니다 일단 관찰 되 고 픽셀 밀어붙이는 없이 사용 되 고 기자의 형광에 대 한 가장 최적의 설정에 이득을 반환 합니다. 참고: 레이저와 이득 설정을 발견 하 고 실험 하는 동안 세포 관찰에 적합는 완전히 사용 되 고 confocal 시스템에 의존 합니다. 일반적으로, 일단 셀 보기의 필드에서 발견 되었습니다, 그것 것이 좋습니다 최소한 레이저 힘의 사용 (일반적으로 ≤20%), 고성능 레이저 빛을 사용 하 여 셀의 과도 한 스캐닝 센서에 의해 산화 변화 감지 유도 수 있습니다.</li>
		<li>이득을 사용 하 여 초기 형광을 세밀 하 게 조정. RoGFP2와 이러한 셀 EGSH 가 증가 하면 488 nm 여기에 의해 유도 된 510 nm 형광 잃게됩니다-채도 없이 악기의 상한 (≈ 90% 상대 강도) 근처 기준선을 설정 합니다. 488 nm 여기 형광 강도 이어야 한다 반면, H2O2 감지 되 면 이러한 세포 510 nm의 형광 강도 얻을 것 이다 세포를 표현 하는 하이퍼에 대 한 기준선에서 낮은 (≈ 10% 상대 강도).</li>
		<li>2.9.2-404 nm에서 여기와 510에서 방출 2.9.3 단계 반복 nm. 이득 404 nm 여기 파장에 대 한 설정은 각 센서에 대 한 488 nm 여기 사용 된 반대 (즉, 낮은 기준 형광 (≈ 10% 상대 강도) 404에서 roGFP2,2 H에 대 한 높은 기준 형광 (≈ 90% 상대 강도)에 대 한 nm O2 센서). 참고: 일반적으로 404 nm 여기에 형광 (510 방출) 상당히 낮은 것 보다 셀에 488 nm 여기 얻을 수 roGFP2와 하이퍼, 404 nm 피크로는 상대적으로 경미한 흥분이 모두에 게 최대 센서입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 수집
<ol><li>수집 소프트웨어를 순차적으로 두 여기 파장을 흥분 시키기 위해 설정 (첫 번째 488 nm 그리고 404 nm) 510에 대 한 배출량을 수집 하 고 실험의 원하는 길이 걸쳐 미리 정해진된 시간 간격에 nm (예: 캡처 이미지 마다 60 60 분에 대 한 s)입니다.<ol>
<li>또는, 이미지 수동으로 노출 전후 경우 수집할 변경 EGSH 또는 H2O2 에 대략적인 타이밍 테스트 되 고 xenobiotic 알려져 있습니다. 그러나,이 시간 해상도의 손실이 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험적인 매개 변수의 실시간 평가 대 한 필드에 적어도 5-10 센서 표현 셀을 선택 하 고 관심 ("ROIs") 실험 기간 동안 그들의 형광 변화를 모니터링 하는 영역으로 그들을 설정 합니다. 참고:이 단계는 선택 사항, 그리고 실시간으로 직접 관찰 하는 것은 바람직하지 않다 또는 소프트웨어 제한 방지 연속 모니터링 하는 경우 실험 후 수행할 수 있습니다. 세포 인구에 따라 ROIs로 셀을 표현 하는 센서의 선택 셀에 걸쳐 식 레벨의 범위를 나타낼 수 있습니다.<ol>
<li>이러한 연구에 대 일 분 기준 기간 후 환경 toxicant 9, 10-phenanthrenequinone (9, 10-PQ) 또는 과산화 수소 (H2O2)를 추가 합니다.</li>
		<li>이 프로토콜에서 나중에 사용에 대 한 모든 시 약을 준비 합니다.  9, 10-15 m m의 농도에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 PQ를 녹이 고 250 µ M 작업 솔루션을 기저 세포 미디어에 희석.  또한, 주입 시 1 m m의 최종 농도 얻을 것 이다 물에 과산화 수소의 작업 솔루션을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험적인 매개 변수를 정의한 후 시간 과정 취득을 시작 합니다. Xenobiotic 노출 시작 전에 적어도 5 분 (또는 5 데이터 요소)의 초기 계획 기간을 설정 합니다.</li>
	<li>노출 하는 toxicant 세포 생체 외에서 주입에 대 한 기존의 접근을 사용 하 여 조사 되 고. 물 또는 다른 적절 한 용 매에 녹는 화합물을 준비 하 고 미디어에 직접 주사.<ol>
<li>유기 용 매 (예: 디 메 틸 sulfoxide 또는 에탄올) 필요한 경우, 마지막 용 매 농도 0.1% 이하로 유지. 솔벤트 셀의 별도 접시에 차량 제어 전자GSH 또는 H2O2 생산에 영향을 생성 하지 않습니다 확인 합니다.</li>
		<li>더 낮은 가용성을 가진 화합물, 혼합 단계 주입 후 micropipette 프로토콜을 사용 하 여 추가 합니다. 적절 한 캐리어 가스 혼합물을 사용 하 여 환경 챔버에 직접 가스 노출 펌프.</li>
	</ol>
</li>
	<li>노출 기간 동안 형광에 변화를 모니터링 합니다. 필요에 따라 다음 주사를 수행 합니다. 상당한 주의 하지 주사, 중 접시를 이동 하기 위하여 동일한 셀 같은 초점면에서 촬영 하는 동안 전체 시간 내내 뒤를.</li>
	<li>실험의 끝에, 적절 한 컨트롤에 셀을 표시 합니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서에 대 한 화합물 산화와 감소의 그들의 비율 응답 지적된 데모에 이러한 센서의 특정 농도 추가 합니다. H2O2 와 dithiothreitol (DTT) 산화 하 고 두 센서를 줄이기 위해 적절 한 컨트롤로 제공 합니다. 일반적으로, 100-1000 µ M H2O2, 1-5 m m dithiothreitol (DTT), 뒤의 최종 농도 사용자를 완전히 산화 하 고 이러한 센서를 줄일 수 있습니다.<ol>
<li>이러한 연구에 대 한 최대 센서 응답을 결정 하기 위해 5mm DTT 뒤 1 m m H2O2 를 사용 합니다.</li>
		<li>응답, 센서 수 있도록 적어도 5 분을 기다려야 하 고 원제, DTT는 세 뇨 르를 형광 또는 설립된 기준선 근처의 수준에 반환 등을 주사. 참고:이 단계에서 컨트롤의 사용 정규화에 대 한 중요 한 이며 각 셀에 센서의 동적 범위를 결정 하는 모든 실험의 끝에 실행 되어야 한다. RoGFP2를 위한 aldrithiol 또한 실험의 끝에 추가할 수 있습니다. Aldrithiol 센서를 직접 산화 roGFP2 redox 릴레이 무시 합니다. 다음 xenobiotic 노출 센서 기능을 평가 하기 위해 유용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>설정 되지 않은 경우 분석할 셀 주위 ROIs를 그립니다. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 각 ROI 시간 과정을 통해 각 파장에서의 형광 강도 측정. 셀 이동 하지 않았다 또는 접시 실행 하는 동안 이동 하지 않은 확인 하십시오. 참고: ROIs 설립 동봉된 영역 각 셀의 형광 식 패턴을 그려서 가장 쉽게 이루어집니다. 더이 과정을 돕기 위해, 설립된 시야 내에서 셀의 빛 (또는 명시) 이미지를 전송된 셀 경계를 정의 하는 노력에 형광 이미지 위에 중첩 수 있습니다. 그러나, 전송된 빛 이미지를 사용 하 여 사용자를 실험의 과정을 통해 추가 채널 (이미지의 집합)를 잡으려고 합니다. 또는, 특정 제조 업체 ROIs 더 양적, 덜 주관적 방법 설치 하기 위하여 강도 임계값 같은 특정 매개 변수를 사용 하는 이미징 소프트웨어에 알고리즘을 통합 합니다.</li>
	<li>원하는 분석 소프트웨어 (예: 전자 스프레드시트)를 내보냅니다.</li>
	<li>수식을 사용 하 여 각 시간 지점에서 각 ROI에 대 한 비율 센서 응답을 계산: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq3.jpg">
</li>
	<li>각 시간 지점에 대 한 모든 ROIs의 계산 된 비율 값을 평균입니다.</li>
	<li>Xenobiotic (예를 들어, 첫 번째 5 번 포인트)의 추가 하기 전에 수집 이전에 계산 된 비율 값 (단계 4.4)을 평균 하 여 데이터를 정규화 하는 데 사용 됩니다 초기 계획 값을 계산 합니다.</li>
	<li>4.5에서 계산 기준 값으로 각 값을 분할 하 여 단계 4.4 비율 값을 정상화. 정규화 된 비율 값이 기준선에 1 중심, EGSH 또는 H2O2 증가 하면서 다음 주사 증가 비율을 발생 합니다. 산화 변화 유도 xenobiotic의 평가 3-6 회 기준 값의 범위에 있는 값을 생성 해 경향이 있다.</li>
	<li>응답 시간과 실험에서 비교에 투입, 100%로 제어 산화 제 (예: 1 m m H2O2)에 대 한 응답을 정의 하 여 정규화 된 데이터 최대 센서 응답의 표현. 참고: 최대 센서 응답의 데이터를 표현 하는 경우 그것은 중요 제어 산화의 동일한 농도 실험에 걸쳐 일관 되 게 사용 되도록. 라이브 셀 이미징 분석에서 파생 된 모든 데이터는 기존의 쌍 단위 및 group-wise 통계 분석 조사 관의 판단에 따라 선택 될 의무가.</li>
</ol>

이 문서에서 설명 하는 연구는 국민 건강 및 환경 효과 연구 실험실, 미국 환경 보호국, 검토 하 고 게시에 대 한 승인. 이 문서의 내용을 나타내는 기관 정책, 해석 안도 않습니다 상표명 또는 상용 제품의 언급 구성 승인 또는 사용을 위해 추천.

세포내 전자GSH 및 H2O2에 각각, 변화를 감지에 roGFP2 및 하이퍼 사용 이전 생리 및 독성 연구 25,35,36에에서 잘 설명 되었습니다. ,39,40,41,,4243. 여기에 설명 된 프로토콜 세포내 산화 환 원 항상성의 섭 xenobiotic 유도 평가 하기 위해 설계 된 지적된 독물학 연구에서 이러한 유전자 인코딩 redox 센서를 구현 하는 효과적인 방법을 보고 합니다. 가장 중...

용어는 "산화 스트레스" 자주 인용 독성, 메커니즘으로 아직 거의 구체적으로 설명 하는이 용어가입니다. 산화 스트레스 반응성 산소 종, 자유 래 디 칼, 항 산화 분자의 산화에의 한 피해의 세대를 포함 하 여 여러 가지 세포내 프로세스를 참조할 수 있습니다 그리고 심지어 특정 시그널링의 활성화 폭포. 다양 한 환경 오염 물질1,2 , 제약 에이전트3,4 5 xenobiotic 화합물 자체의 어느 직접 행동에 의해 산화 스트레스를 유발 하 문서화 되었습니다. 6 또는 이차 세포 응답7,8,,910의 일환으로 산화 종의 생산. 그것은 그러므로 정확 하 게 관찰 하 고 불리 한 결과에 지도 하는 산화 과정을 특성화 독성에 큰 관심의. 산화 스트레스 측정의 종래의 방법 포함 산화 쓰이므로11,12,13,,1415 또는 산화 방지 제16의 식별 ,17,18,,1920또는 스스로21,,2223, 반응 종 직접 측정 24. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 자주 사용 샘플, 공간 해상도 제거 하 고 잠재적으로 소개 하는 유물25는 세포 장애, 필요 합니다. 산화 제 종류의 검출 및 산화 긴장의 표시에 대 한 더 과민 하 고 특정 메서드의 개발 xenobiotic 노출의 부작용의 조사에 광범위 하 게 적용 됩니다.
라이브 셀 현미경 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서의 새로운 세대를 사용 하 여 살아있는 세포의 세포내 산화 환 원 상태를 모니터링 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 이 센서는 일반적으로 바이러스 성 발기인 transfection 또는 변환 방법론을 통해 도입의 통제 벡터를 사용 하 여 표현 됩니다. 이후 세포 형광 센서 표현 확인 될 수 있다 쉽게 시각적으로 높은 식 효율성 필요 하지 않습니다. 독성 학적 평가 대 한 이러한 센서를 표현 하는 세포로 그들은 실시간으로 xenobiotic 화합물에 노출 되는 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 수 있다. 이 실험 설계 반복된 측정 동일한 셀에 각 셀의 설립된 기준 자체 컨트롤 역할을 수 있도록 허용 합니다. 라이브 셀 이미징 업체 높은 시간 해상도 겸손 한 크기 또는 자연에 과도에 특히 그 산화 이벤트의 검출에 적합. 그들의 표적 분자에 과민 하 고 특정 되 고, 뿐만 아니라 이러한 센서 들의 형광 빛의 두 파장을 사용 하 여 흥분 수 있습니다. 이 현상을 수 정통 센서 응답 인공 센서 식, 셀 두께, 램프에 변화 등으로 인 한 그와 관련 된 신호 변경의 분별을 허용 하는 비율으로 표현 될 형광 방출 강도, photobleaching, 고26형광 검출기 감도. Fluorogenic 센서의 사용의 또 다른 장점은 그들은 공간 해상도 기존의 방법25,,2627여 일치의 수준을 만드는 특정 세포 구획을 타겟팅 할 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)에 따라 유전자 인코딩 센서의 큰 가족 개발 되 고 생리 마커, ATP/ADP 비율25, 칼슘 농도, 온도, pH 등의 광범위 한 다양 한 보고서를 특징 ,,2829,,3031. 이 중 티 산화 환 원 잠재력 (EGSH)와 과산화 수소 (H2O2)의 센서는 있습니다. 이러한 센서는 산화 환 원 생물학 및 생리학에 응용 프로그램에 대 한 개발 되었다, 그러나 그들은 또한 xenobiotic 유발 산화 스트레스 공부에 적응 했습니다. 특히, 여기에 설명 된 프로토콜 EGSH 센서 roGFP2 및 H2O2 센서 하이퍼의 사용을 설명 합니다.
roGFP2는 세포내 감소와 산화 glutathione의 (GSH/GSSG) 티 과산화 효소 (메타), glutaredoxin (Grx)과 티 reductase redox 릴레이 통해 산화 환 원 잠재력에 보고 (GR) (그림 1)25, 32 , 33. 티 주된 세포 항 산화 분자 이며 cytosol25,34millimolar 농도에서 그것의 감소 된 모양 (GSH)에 주로 존재 하는. EGSH 하지 어떤 기능 결과에 연결 되어있다, 하는 동안 세포내 산화 상태34의 중요 한 지표로 인식 된다. GSSG의 농도에서 상대적으로 작은 증가 roGFP2에 의해 감지 되는 EGSH 증가 발생 합니다. 똑같이 중요 한, EGSH 의 모니터링 xenobiotic 노출 동안 roGFP2를 사용 하 여 수 잠재적으로 redox 릴레이에 여러 지점에서 행동의 메커니즘에 대해 많이 고 공개 pentose 인산 염 등 관련된 경로 션트 (그림 1 )35. 여기 두 번째 센서, 하이퍼는 세균 H2O2의 규제 도메인에 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 삽입에서 파생 된 세포내 H2O2 조사-중요 한 전사 OxyR136요소. H2O2 생리 조건37, 에서 중요 한 세포내 신호 분자로 점점 인식 되 고는 이전 되었습니다 간주 됩니다 손상 반응 산소 중간, 비록 38, H2O2 에 대 한 인식할 수 없는 역할 뿐만 아니라 독극물에 존재 하는 것을 건의. 예를 들어, 초과 H2O2 xenobiotic 노출에 의해 유도 된 세포질 신호 또는 생체 변화에 dysregulation 전조 수 있습니다.
두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 여러 설립된 셀 라인, 인간의 해 암 세포 선 A431 등 인간 기관지 상피 세포 선 BEAS-2B, EGSH 및 H2에서 변화를 관찰 하에 표현 O2 다양 한 독성 노출에 대 한 응답에서. 가스 오염 물질 (오존35), 미 립 자 물질 (1, 2 naphthoquinone39,40 와 아연41), 그리고 니켈 나노 입자 (되지 않은 데이터)의 수용 성 구성 요소 포함 됩니다. 이러한 연구는 이러한 두 센서의 가능한 응용 프로그램의 작은 하위 집합만을 나타냅니다. 이론적으로, 수신 하 고 기존의 분자 생물학 기법을 통해 이러한 센서의 DNA를 표현 할 수 있는 모든 세포 유형 xenobiotics 세포 산화 상태를 변경 하는 의심의 효과 평가 하기 위해 활용할 수 있습니다. 날짜 하려면, 하나 이상의 이러한 센서의 다양 한 원핵생물과 진핵생물, 등 여러 포유류, 식물, 박테리아, 효 모 세포 종류25,26,,3642표현 되었습니다. EGSH 및 H2O2 센서에 대 한 판독은 510에서 방출 하는 형광의 강도에 변화 nm 404 488 nm 빛과 여기에. 이 메서드는 fluorometric 플랫폼, 다양 한 종류의 현미경 (confocal 및 넓은 필드)와 판 독자를 포함 하 여 널리 적응. 여기에 제시 된 방법은 체 외에서 독성 시스템에 O2 세포내 전자GSH 및 H2의 민감하고 구체적인 관찰에 대 한 있습니다.

<table><tbody><tr><td>roGFP2 플라스미드</td><td>오레곤 대학교</td><td>N/A</td><td>관대한 선물 S.J. 레밍턴</td></tr><tr><td>HyPer 플라스미드</td><td>에브로겐</td><td>FP941</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>시그마 알드리치</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>시그마 알드리치</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>9,10-페난트레퀴논</td><td>시그마 알드리치</td><td>156507</td><td></td></tr><tr><td>블랙 벽 유리 바닥 접시</td><td>Ted Pella</td><td>14029-20</td><td></td></tr><tr><td>BEAS-2B 세포주</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>192151</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Office Suite</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>해당 사항</td> Nikon C1si <td></td></tr><tr><td>컨포칼 이미징 시스템</td><td>Nikon</td><td>해당 사항</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자로 인코딩된 fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

산화 스트레스는 일반적으로 인용된 독물학 메커니즘, 공부를 기존의 방법 샘플, 잠재적인 유물의 소개와는 반응에 대 한 특이성의 부족의 파괴를 포함 하 여 결점의 수에서 고통 받는 종 관련된입니다. 따라서, 비-파괴, 민감한, 그리고 특정 방법 관찰 하 고 계량 세포내 산화 환 원 섭, 더 일반적으로 산화 스트레스 라고 하는 데 사용할 수에 대 한 독성의 분야에서 현재 필요가 하다. 여기, 우리는 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서, roGFP2 및 하이퍼 xenobiotic 유발 산화 응답 관찰 라이브 셀 이미징 연구에 사용할 수를 사용 하는 방법을 제시. roGFP2 하이퍼 동안 티 redox 잠재적인 (EGSH)와 함께 equilibrates 과산화 수소 (H2O2)를 직접 감지. 두 센서 transfection 또는 변환을 통해 다양 한 세포 유형으로 표현 될 수 있다 그리고 특정 세포 구획을 대상 수 있습니다. 가장 중요 한 것은, 라이브 셀 현미경이이 센서를 사용 하 여 기존의 방법을 사용 하 여 가능 하지 않은 높은 공간 및 시간 해상도 제공 합니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 404에 의해 순차적으로 흥분 때 판독으로 510 nm 역할에서 모니터링 하는 형광 강도 변화 nm, 488 nm 빛. 이 속성은 두 센서 비율, 일반적인 현미경 아티팩트를 제거 하 고 센서 식 셀 사이의 차이 대 한 수정. 이 방법론 confocal 이미징 시스템, 기존의 와이드 필드 현미경 검사 법, 그리고 접시와 함께 사용을 위해 적당 한 만드는 소정의 파장에 흥분 하 고 수집 방출의 fluorometric 플랫폼의 다양 한 적용 독자입니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 세포 EGSH 및 H2O2 세대 실시간으로 모니터링 하 다양 한 세포 유형 및 독물학 연구에에서 사용 되었습니다. 여기에 설명 된 세포 유형 및 산화 스트레스의 라이브 세포 독성 평가에 roGFP2 및 하이퍼의 응용 프로그램에 대 한 fluorometric 플랫폼에 걸쳐 널리 적응력은 표준화 된 방법이입니다.

EGSH 및 세포내 H2O2 에서 변화를 감지에 roGFP2 및 하이퍼 사용 잘 했습니다25,36,,4243 위에서 설명한 고 여기 설명 된다. 기준선 및 다음의 추가 H2O2 와 DTT에 roGFP2을 표현 하는 셀의 공초점 이미지는 그림 2에 표시 됩니다. 데이터는 실험을 통해 수집 된 이미지를 수출 그리고 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로 분석 했다. 같이, 긍정적인 컨트롤로 exogenous H2O2 의 추가 생산 하 고 재현할 수 응답 데이터...

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

이 방법론의 전반적인 목표는 산화 환원 항상성에서 독성 유발 섭동의 특정 평가를 위해 유전적으로 인코딩된 산화 환원 센서의 사용을 확립하는 것입니다. 산화 스트레스와 함께 사용되는 기존 접근 방식의 중요한 한계를 극복함으로써 이 방법은 독성 산화 스트레스와 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 수준의 특이성과 민감도를 비교할 수 없는 공간-시간 해상도와 결합하여 살아있는 세포의 독성 산화 스트레스를 조사한다는 것입니다.404 및 488 나노미터의 레이저 라인이 장착된 컨포칼 현미경과 환경 제어 장치를 사용하여 모든 이미징 분석을 수행하여 실험 기간 동안 세포에 적합한 적절한 온도, 습도 및/또는 가스 농도를 유지합니다. 높은 상대 습도 값을 사용하는 경우 대물 히터 및/또는 가열 테이프를 사용하여 습도가 생성되는 온도 또는 그보다 약간 높은 온도에서 가습된 대기와 접촉할 수 있는 표면을 유지하여 결로를 방지하십시오. 모든 현미경 구성 요소를 켜고 488 및 404 나노미터에서 순차 여기(sequential excitation)에 필요한 모든 장비를 510 나노미터에서 방출하도록 설정합니다.광학 구성의 모든 구성 요소가 실시간 획득을 위해 적절하게 설정되었는지 확인합니다. 섭씨 37도, CO2 5% 대기, 95% 이상의 습도에서 일정한 온도를 유지하기 위해 스테이지 상단 환경 챔버를 설정합니다. 이미지 획득을 시작하기 전에 모든 환경 제어의 초기 설정 후 최소 10분 동안 환경 챔버를 평형을 이룹니다.환경 챔버 내의 스테이지 상단에 세포 접시를 놓습니다. 원하는 대물 렌즈를 사용하여 접안렌즈와 백색광을 사용하여 세포의 초점면을 찾고 정상적인 형태를 보장합니다. 1.4 개구수 60 X 바이올렛 보정 오일 침지 대물 렌즈가 일반적으로 사용되며, 이를 통해 세포 내 구획을 식별하는 동시에 컨포칼 시스템의 광학 해상도를 극대화할 수 있습니다.Flourescian-isothioanate 또는 FITC와 같은 적절한 필터 세트를 사용하여 광시야 형광 조명 아래에서 세포를 시각화하면서 시야에서 세포의 형광 발현을 확인합니다. 이 시점에서 접안렌즈를 통해 보면서 광시야 조명을 사용하는 것이 더 편리한데, 연구할 세포의 영역을 선택하기 위해 접시를 옮기는 것이 더 쉽기 때문입니다. 원하는 시야를 찾으면 환경 챔버를 닫습니다.초점 유지 기능을 사용하면 스터디 전체에서 안정적인 초점면을 쉽게 유지할 수 있습니다. 다음으로, 원하는 노출 기간 동안 관심 센서의 최적 평가를 보장하기 위해 획득 매개변수를 설정합니다. 이렇게 하려면 488나노미터에서 여기와 510나노미터에서 방출에 대한 레이저 출력을 조정합니다.세포를 시각화할 수 있는 레이저 출력 수준을 선택하고 샘플 간에 이를 일정하게 유지하거나 접시를 복제합니다. 획득 소프트웨어의 컨포칼 컨트롤을 사용하여 Z-평면을 조정하면서 488나노미터로 스캔하여 선택한 초점면이 세포 중앙의 최대 형광 방출 강도에 맞게 최적화되었는지 확인합니다. 가장 많이 과도하게 노출된 셀이 있는 Z-평면을 조정하는 동안 높은 게인 설정을 사용합니다.적절한 초점면이 발견되면 관찰되는 픽셀을 과포화시키지 않고 사용 중인 리포터의 형광에 가장 최적화된 설정으로 게인을 되돌립니다. 그런 다음 게인을 사용하여 기준선 형광을 미세 조정합니다. roGFP2를 사용하면 글루타티온 산화환원 전위가 증가할 때 488 나노미터 여기(excitation)에 의해 유도된 510 나노미터 형광이 손실되므로 과포화 없이 기기의 상한선 근처에 기준선을 설정할 수 있습니다.404나노미터에서 여기(excitation)와 510나노미터(nanometer)에서 방출(emission)을 사용하여 이 단계를 반복합니다. 404 나노미터 여기 파장에 대한 게인 설정은 각 센서에 대해 488 나노미터 여기에 사용되는 설정과 반대입니다. 일반적으로 404 나노미터 여기의 형광은 roGFP2를 발현하는 세포에서 488 나노미터 여기로 얻을 수 있는 형광보다 상당히 낮으며, 404 나노미터 엿보기는 이 센서에 대한 상대적으로 작은 여기 최대값이기 때문입니다.두 개의 여기 파장을 순차적으로 여기하도록 획득 소프트웨어를 설정하고 원하는 실험 기간 동안 510나노미터와 사전 결정된 시간 간격으로 둘 다에 대한 방출을 수집합니다. 실험 파라미터의 실시간 평가를 위해 현장에서 최소 5개에서 10개의 센서 발현 세포를 선택하고 이를 관심 영역으로 설정하여 실험 중 형광 변화를 모니터링할 수 있습니다. 다음으로, 환경 독성 물질 인 9, 10-PQ를 디메틸 설폭 사이드에 15 밀리 몰의 농도로 용해시킨다.기저 세포 배지에 용해된 독성 물질을 250마이크로몰 작업 용액으로 희석하여 최종 농도 25마이크로몰을 만듭니다. 또한 이 프로토콜에서 나중에 사용할 수 있도록 과산화수소 작업 용액을 준비합니다. 실험 매개변수가 정의되면 시간 경과 획득을 시작합니다.생체이물 노출을 시작하기 최소 5분 전에 기준선을 설정합니다. 체외 투여를 위한 기존 접근법을 사용하여 연구 중인 독성 물질에 세포를 노출시킵니다. 노출 기간 동안 형광의 변화를 모니터링합니다.필요에 따라 후속 주입을 수행합니다. 동일한 초점면에서 이미지화하는 동안 전체 시간 경과에 걸쳐 동일한 세포를 따르도록 주사 중 접시를 이동하지 않도록 세심한 주의를 기울이십시오. 실험이 끝나면 세포를 적절한 대조군에 노출시켜 roGFP2를 완전히 산화시키고 감소시킵니다.control simuli를 추가하면 노출 종료 시 센서 응답성을 검증하고 관찰된 응답이 포트 손상의 직접적인 결과가 아님을 확인할 수 있습니다. 따라서 독소의 초기 평가에서 특히 중요합니다. 이러한 연구에서는 1밀리몰의 과산화수소를 사용하여 최대 센서 응답을 결정합니다.센서가 응답할 때까지 최소 5분 동안 기다린 다음 DTT와 같은 환원제를 주입하여 센서를 줄이고 설정된 기준선 또는 그 근처의 형광 수준으로 되돌립니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다. 여기에 표시된 것은 roGFP2를 발현하는 기관지 상피 세포주 Bees 2B를 사용하여 생성된 확립된 용량 반응을 보여주는 대표적인 결과입니다.5마이크로몰, 25마이크로몰 또는 100마이크로몰 용량의 과산화수소에 노출되도록 표시된 커서. 꿀벌 2B 세포를 이전에 검증되지 않은 환경 독성 물질인 9, 10-PQ에 노출시키면 roGFP2에 의해 평가된 세포 내 글루타티온 산화환원 전위가 점진적이지만 강력하게 증가합니다. 여기에서 각 줄은 접시에 있는 개별 세포의 원시 roGFP2 비율을 나타냅니다.테스트 화합물은 1밀리몰의 과산화수소에 필적하는 최대 반응을 생성하지만, 이 알려진 산화환원 순환기는 5밀리몰의 DTT를 첨가하여 완전히 감소된 센서의 변화를 일으켰으며, 이는 센서가 이 산화환원 활성 유기 화합물에 노출된 후에도 기능을 유지한다는 것을 시사합니다. 이 접근 방식은 독성학자가 독성 유발 산화 스트레스의 주요 기계론적 사건을 조사하는 데 도움이 될 것이며, 광범위한 독성 물질 및 세포 유형에 걸쳐 산화 환원 독성학의 새로운 분야에서 더 집중적인 연구를 위한 길을 닦을 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유전적으로 인코딩된 센서와 라이브 셀 현미경을 사용하여 타의 추종을 불허하는 공간-시간 분해능에서 높은 감도와 특이성으로 독성 산화 스트레스의 중추 마커를 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

산화 세포 환경을 감지하는 심사 방법은 CM - H2DCFDA의 산화를 측정하는 것입니다. 일단 비 형광의 형광 화합물로 세포, CM - H2DCFDA 변경 내에 산화. 형광에이 변경 사항은 유동세포계측법으로 측정하고 산화 환경에서 세포의 수를 나타냅니다.

고양이 Astrocyte 세포주에서 산화 스트레스에 대한 심사 분석, G355 - 5

이 비디오는 배양된 오가노이드에서 산화 스트레스를 시각화하는 기술에 대해 설명합니다. 이 연구는 서로 다른 ROS 조절제로 처리한 후 오가노이드에 존재하는 다양한 세포 유형에서 ROS 축적으로 인한 산화 스트레스 수준을 이해하는 데 도움이 됩니다.

형광 프로브 이미징 분석: 반응성 산소종 유도 처리로 처리된 배양된 장 오가노이드 세포의 산화 스트레스를 시각화하는 기술

이 동영상은 GFP 발현 형질전환 마우스에서 얻은 3D 장 오가노이드의 ROS 수준을 정량화하기 위한 유세포 분석 분석을 보여줍니다. 이 방법은 ROS 생산에 대한 테스트 화합물의 효능을 조사하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.

산화 스트레스를 정량화하기 위한 유세포 분석 분석: 형량 탐침을 사용하여 장 오가노이드의 활성 산소 종을 정량화하기 위한 분석

여기에서 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 산화 스트레스를 측정하는 프로토콜을 보고합니다. 이 절차를 통해 전체 배아 조직과 단일 세포 집단 모두에서 활성 산소 종(ROS)을 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정성적 분석과 정량적 분석을 모두 수행합니다.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

이 문서는 공초점 살아있는 현미경 검사를 사용하여 1 차해 및 피질 뉴런에 있는 급성 동요에 기초 redox 상태 및 redox 반응에 있는 다름을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 최소한의 수정으로 다른 세포 유형 및 현미경에 적용 될 수 있습니다.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

이 프로토콜은 고처리량 스크리닝 접근 방식을 사용하여 형광 염료 프로브로 디하이드로에티듐(DHE)을 사용하여 세포 내 활성 산소종(ROS)을 정량화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 세 가지 서로 다른 간세포 암종 세포주에서 세포 내 활성 산소종(ROS)의 정량적 평가 방법을 설명합니다.

Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

학습하세요 유전자로 인코딩된 형광 센서를 활용한 독성 산화 스트레스 평가 방법을 실시간 세포 이미징으로 탐구하세요. 이 기술은 높은 특이성과 감도로 산화환원 항상성의 시공간 역학을 연구합니다.

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