백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

이 epifluorescence intravital video microscopy 또는 IVM protocol of blood-prints의 전반적인 목표는 마우스에서 Angiotensin II에 의해 유발된 고혈압에서 부식된 동맥의 백혈구 롤링 및 접착을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 혈관 기능 장애 및 동맥 고혈압의 병리학에서 백혈구, 특히 리소좀과 양성 세포 간의 상호 작용 메커니즘, 혈관 기능과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 순환 혈액 세포와 혈관 이해 사이의 생체 내 상호 작용을 볼 수 있다는 것입니다.

텍스트 protol에 따라 osmatic pumps로 안지오텐신 2 치료 7일 후 수술을 위해 수컷 마우스를 준비합니다. 시술 중 눈을 보호하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 마취된 동물을 섭씨 39도의 수술 플레이트에 등쪽 누움으로 놓고 직장 프로브를 삽입하여 온도를 유지합니다.

면봉을 사용하여 제모 크림을 펴 바르고 머리카락이 빠지기 시작할 때까지 목에 문지릅니다. 그런 다음 2분 더 후 주걱을 사용하여 수염과 크림을 제거합니다. 그런 다음 알코올 피부 소독제를 사용하여 피부를 소독하십시오.

그런 다음 실체 현미경으로 기관에서 1cm 떨어진 목 피부를 1-1.5cm 세로 절개합니다. 그런 다음 첫 번째 절개 부위의 양쪽 끝에 2개의 수직 절개를 만듭니다. 피부 바로 아래에 있는 조직을 조심스럽게 제거하고 왼쪽 경정맥과 기관을 덮고 있는 피부 조각을 제거합니다.

다음으로, 두 개의 구부러진 집게를 사용하여 설하 및 상악하 부식된 땀샘을 관심 영역에서 조심스럽게 분리합니다. 땀샘을 자르거나 손상시키지 않도록 주의하면서 경정맥과 관정맥에 가장 잘 접근할 수 있도록 위치를 잡습니다. 그런 다음 경정맥을 분리하기 위해 혈관과 주변 조직 사이에 얇은 집게를 삽입하고 기구를 천천히 열고 닫아 조직에서 정맥을 부드럽게 분리합니다.

경정맥이 완전히 깨끗해지면 겸자를 혈관 아래에 놓고 그 아래에 10cm 길이의 7-0 봉합사 2개를 놓습니다. 두 개의 매듭을 묶어 머리에 가까운 봉합사를 닫고 두 번째 봉합사로 한 매듭을 준비하되 닫지 마십시오. 이제 한 손에는 집게를 들고 섭씨 37도의 멸균 식염수로 채워진 카테터를 잡고 다른 손으로는 가위나 구부러진 26게이지 바늘을 사용하여 혈관을 작게 절개합니다.

경정맥에 카테터를 삽입하고 매듭을 두 번 닫습니다. 그런 다음 카테터 위의 머리 근위부에 있는 봉합사를 닫아 완전히 고정할 수 있도록 합니다. 부식된 동맥을 분리하고 준비하려면 얇은 곡선 집게를 사용하여 기관을 덮고 있는 영역을 절개합니다.

그런 다음 부식된 부분이 주변 조직에서 제거되면 필요한 경우 얇은 겸자를 천천히 닫았다 열어 신경을 부드럽게 동원하여 혈관에서 라스베가스 신경을 절단하지 않고 제거합니다. 양쪽 동맥이 완전히 깨끗해지면 첫 번째 부식된 동맥 아래에 집게를 놓고 혈관이 과도하게 늘어나지 않도록 주의하면서 3mm x 2.5cm의 작은 검은색 플라스틱 혈관 홀더를 혈관 아래에 놓습니다. 용기 홀더가 제자리에 고정되면 혈류가 있는지 확인하십시오.

혈관이 늘어나지 않도록 작업자의 손은 부식된 동맥을 분리하기 위해 첫 번째 집게를 한 번 움직여야 하며 두 번째 집게를 사용하여 혈관 아래에 구멍을 뚫어야 합니다. 혈관 홀더가 올바른 위치에 있으면 두 번째 동맥을 장치 위에 놓습니다. 마우스를 현미경 바로 아래에 두지 않은 경우 땀샘을 기관 위에 다시 놓고 섭씨 37도의 멸균 식염수를 적용하여 영역이 건조되지 않도록 합니다.

1mL 주사기에 1mL 당 2mg의 해동된 아크리딘 오렌지 원액을 멸균 식염수에 1-4 희석합니다. 주사기를 빛으로부터 보호하십시오. 측정을 수행하려면 장거리 콘덴서와 단색계, 빔 스플리터 및 CCD 카메라가 있는 10x 침수 대물렌즈를 사용하여 고속 광시야 형광 현미경 아래에 마우스를 배치합니다.

내피 표면의 부식된 동맥 중간에 대물렌즈의 초점을 맞춰 실시간으로 이미지를 획득합니다. 아크리딘 오렌지 50mL를 천천히 주사합니다. 그런 다음 사진당 100밀리초의 노출 시간으로 120개의 이미지를 기록하도록 소프트웨어를 설정합니다.

각 비디오에 대해 동맥의 다른 위치에서 부식된 동맥당 4개의 비디오를 녹화합니다. 형광 신호가 감소하면 아크리딘 오렌지 50mL를 더 주사합니다. 다른 조건을 테스트하기 위해, 경정맥 카테터가 삽입되지 않은 경우 아크리딘 오렌지를 측면 꼬리 정맥에 직접 주입하고 동일한 이미지 획득을 수행합니다.

대조군으로, 주입되지 않은 lys-Mcre 양성, IRG 양성 마우스의 형광 측정을 기록합니다. 각 비디오의 용기 중앙에 배치된 200 미크론 x 250 미크론 직사각형 보기에서 초당 10개 이미지의 속도로 표시되는 롤링 및 접착 셀을 정량화합니다. 롤링 및 접착 세포를 계산합니다.

부착 세포는 10초 비디오 내에서 내피에서 이동하거나 분리되지 않는 세포로 정의됩니다. 정량 분석을 단순화하려면 빨간색 형광이 있는 채널을 제거하고 녹색 형광만 사용하여 rolling 및 adhering 세포를 계수합니다. 이 연구에서는 IVM을 사용하여 안지오텐신 2를 주입한 lys-mCre 양성, IRG 양성 마우스의 부식을 관찰했습니다.

여기 기준선에서 볼 수 있듯이, 경정맥 카테터의 존재는 lys-M 양성 형광 세포의 접착을 초래했습니다. 아크리딘 오렌지 주사 후, 내피 세포도 형광을 띠었습니다. 그런 다음, 내피 관련 형광을 제한하기 위해 배경을 줄인 결과, 모든 핵 부착 세포가 lys-M 양성임을 밝혔습니다.

이 실험에서는 안지오텐신 2 주입 일주일 후 lys-M Cre-positive IRG-양성 마우스의 부식된 동맥에서 백혈구 내피 상호 작용을 경정맥 카테터 또는 꼬리 정맥을 통해 아크리딘 오렌지 주사 유무에 관계없이 IVM으로 이미지화하고 시각화했습니다. 카테터나 주사를 하지 않은 경우, 안지오텐신 2 주입 후 lys-M 양성 세포의 롤링이 치료되지 않은 마우스에 비해 유의하게 증가했습니다. 그리고 접착력도 높아졌습니다.

경정맥 카테터와 함께 아크리딘 오렌지를 주입하면 안지오텐신 2 처리 마우스에서 카테터가 없는 마우스에 비해 접착력과 롤링이 더 크게 증가했습니다. 마지막으로, 이 패널에서 볼 수 있듯이 꼬리 정맥에 아크리딘 오렌지를 주입하면 아크리딘 오렌지를 주입하지 않은 마우스와 유사한 접착력과 롤링이 발생합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때 혈관 주변의 조직을 손상시키지 않도록 하는 것이 중요하다. 개발 후 이 기술은 심혈관 및 지혈 분야의 연구자들이 생체 내에서 혈관벽에 대한 백혈구 및 혈소판 부착을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 IVM에서 염료 주입 및 수술의 영향을 제한하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

삽입성 형광 염료로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑과 같은 적절한 재료로 염료와의 피부 접촉을 피해야 한다는 것을 잊지 마십시오.