Name: 백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 Angiotensin II 유도 고혈압 마우스에서 백혈구 롤링 및 접착을 시각화하는 생체 내 비디오 현미경 기법. 이 방법은 혈관 기능 장애의 면역 세포 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 교육과 연구 (BMBF 01EO1003 및 BMBF 01EO1503)에 대 한 독일 정부에 의해 지원 되었다.

실험은 남성 쥐 나이에 라인 지방 팔 라틴 (승인 번호 23 177-07/G12-1-002 및 23 177-07/G15-1-051)에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인 아래 오래 된 8 ~ 12 주에 실시 했다.
1. 마우스 마 취 및 수술 준비
<ol>
	<li>수술 전에 좋은 건강 및 동물의 상태를 확인 합니다. 수술 전에 체중, 음식, 및 물 소비 (모양, 자세, 자연 스러운 행동) 그들의 일반적인 조건에 대 한 2-3 일 동안 하루에 한 번씩 동물을 모니터링 합니다.</li>
	<li>준비 마스터 믹스 midazolam (5 mg/kg 체중), medetomidine (0.5 mg/kg 체중), 펜타닐 (0.05 mg/kg 몸 무게)와 마 취에 대 한 intraperitoneally (i.p.) 26 G 바늘 200 µ L/30 g 마우스 1 mL 주사기에 주입.</li>
	<li>삼 투 펌프 주입 및 IVM 실험 동물 준비 플랫폼 온난화 39 ° c는 작업 필드에 수행 됩니다. 소독 목욕에 모든 도구를 소독 하 고 소독 온난화 플랫폼.</li>
	<li>절차 동안 눈 연 고와 동물 눈을 보호 합니다. 삼 투 펌프 주입 전에 면도기와 모피를 제거 합니다. 제 모 크림, 면봉을 사용 하 여 년 및 jugular 카 테 테 르 주입 IVM 실험에서의 격리에 대 한. 2 피부 소독 제를 사용 하 여 동물의 피부를 소독: 한 살 균 및 살 균 제 povidone 요오드와 한을 포함 하 피부 살 균 포함 octenidine 알코올 기반 솔루션.</li>
	<li>반대 flumazenil (0.01 mg/kgbody 중량), atipamezol (0.05 mg/kg 체중)와 마 취 ("antisedan") 믹스 마스터 믹스를 준비 하 고 피하 것 26 G 바늘 200 µ L/마우스 1 mL 주사기에 준비 (사우스 캐롤라이나) 주입.</li>
</ol>
2. 삼 투 펌프 준비 및 이식
참고: 삼 투 펌프를 사용 하 여 피하 AngII 주입 Lu 그 외 여러분 에 의해 상세히에서 기술 되었다 17
<ol>
	<li>멸 균 식 염 수와 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여는 AngII를 준비 하 고 농도 동물 무게와 펌프의 배달 속도 조정. 플라스틱 튜브 (유리 튜브를 사용 하지 마십시오.)에서 재구성 된 AngII를 유지.</li>
	<li>7 일 동안 1 mg/(kg·d)를 제공 하는 AngII 솔루션으로 펌프를 채우십시오. 준비 후에, 펌프에서에서 계속 4-6 h에 대 한 살 균 염 분 최소 37 ° c.</li>
	<li>후면 마 취 혼합의 사출 반사 발 고 따뜻한 작업 필드에는 마우스의 완벽 한 마 취를 테스트 합니다. 마 취 유도 10-15 분 소요 하 고 동물 어두운 환경에서 배치 하는 경우 더 잘 작동 합니다.</li>
	<li>마우스 뒷면 하단을 면도 하 고 알콜 피부 살 균 소독.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 척추에 수직인 1 cm 절 개를 확인 합니다. 해협 hemostat를 사용 하 여 펌프에 대 한 주머니를 만들고 펌프를 삽입 (먼저 사회자 흐름). 주머니 없는 압력 상처에 펌프의 자유 운동을 허용 해야 합니다.</li>
	<li>염증; 제한 하기 위하여 하지 클립, 봉합와 상처를 닫습니다 그런 다음 피부 살 균 소독.</li>
	<li>Antisedan 믹스의 200 µ L의 사우스 캐롤라이나 주사로 마 취를 반대 하 고 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다.</li>
	<li>수술 후 진통 buprenorphine와 수행 (0.075 m g/k g 사우스 캐롤라이나) 한 번 수술 후 및 동물의 행동에 따라 수요에.</li>
</ol>
3. jugular 카 테 테 르 주입 및 년 준비
<ol>
	<li>마우스의 완벽 한 마 취 주입 마 취의 후면 음식 반사와 혼합 하 고 온도 유지 하 고 연 고를 두고 직장 프로브와 39 ° C에 수술 등 recumbence에서 마 취 동물을 배치 후 테스트 절차 동안 그들을 보호 하기 위해 눈입니다.</li>
	<li>제 모 크림을 사용 하 여 목 머리카락을 제거 합니다. 면봉을 사용 하 여 확산 하 고 머리카락 밖으로을 시작 될 때까지 2 분 동안 크림을 문 지 르 세요. 추가 2 분 후 주걱으로 크림과 머리카락을 제거 하 고 알콜 피부 살 균으로 피부를 소독 합니다.</li>
	<li>아래는 stereomicroscope 수술을 수행 합니다. 경도 목, 기관지 옆 1 cm에서 피부에 1-1.5 cm 긴 절 개를 확인 합니다. 첫 번째 절 두 사지에 수직으로 다른 두 절을 확인 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 피부 옆 조직 제거 하 고 피부 왼쪽된 경 정 맥 및 기도의 조각을 제거.</li>
	<li>조심 스럽게 분리 귀 밑 샘; 2 곡선된 겸 자에 대 한 관심의 영역에서 설 하 고 submaxillary 땀 샘. 하지 절단 또는 동맥 손상, 경 정 맥에는 년 최고의 액세스할 수 있도록 그들 장소.</li>
	<li>경 정 맥을, 얇은 집게를 사용 하 고 천천히 열고 주변 조직에서 혈관을 부드럽게 닫습니다. 일단 정 맥이 완전히 깨끗 한는 겸 그릇 아래 놓고 아래 각 10 cm의 2 개의 7-0 봉합을 배치.</li>
	<li>두 개의 매듭을 가진 머리에 인접 봉합을 닫습니다. 다른 봉합에 한 매듭을 준비 하지만 그것을 닫지 마십시오.</li>
	<li>잡고 한 손으로 집게와 37 ° C 살 균 염 분 가득한 테 (안쪽 직경, 0.61 m m 외부 직경 0.28 m m) 다른 한편으로는, 함께 하는 동안 얇은 위 또는 곡선된 26 G 바늘 그릇에 작은 절 개를 확인 합니다. 그런 다음 경 정 맥에 카 테 터를 삽입 하 고 두 번 매듭을 닫습니다. 완전 한 동원 정지를 위해 카 테 터를 통해 머리에 인접 봉합을 닫습니다.</li>
	<li>격리 하 고 경 동맥을 준비, 얇은 곡선된 겸 자 사용 하 여 기관지를 덮고 영역 해 부.</li>
	<li>일단 고 년 조직 주변에서 자유롭다, 선박에서 미주 신경 (흰색 라인은 경 동맥에 인접 한 모양)를 제거 (하지만 그것을 잘라 하지 않습니다). 얇은 포 셉 폐쇄 하 고 천천히 부드럽게 신경을 동원을 열 수 있습니다.</li>
	<li>두 동맥은 완전히 깨끗 한, 일단 아래 첫 번째 경 동맥 겸 자 놓고 작은 블랙 3 m m x 폭 2.5 c m 길이 플라스틱 조각 그릇 아래에 배치 합니다. 그것은 매우 중요 한 선박을 overstretch 하지 고 혈액의 흐름은 선박 소유자 배치 되 면 존재 확인. 두 번째 동맥 선박 소유자를 놓습니다. 마우스는 현미경의 밑에 직접 배치 되지 않습니다, 기도에 땀 샘을 다시 넣어 고 37 ° C 살 균 염 분 지 대의 건조 방지를 적용.</li>
</ol>
4. 압 연 및 백혈구 준수 평가 / LysM + IVM와 세포
<ol>
	<li>-20 ° C에 저장 하는 2 mg/mL 재고 솔루션에서 오렌지 acridine 준비 하 고 그것에 게 1:4 1 mL 주사기에 멸 균 식 염 수 (최종 농도 0.5 mg/mL)에 희석.</li></ol>빛에서 주사기를 보호 하 고 하나의 마우스 당 200 µ L를 사용 하 여.<ol>
		<li>다른 조건을 테스트: acridine jugular 테;와 오렌지의 (1) 주입 (2) 주입 acridine 오렌지 직접 꼬리 옆 정 맥 (이 조건으로 아무 jugular 테 이식 했다); (3) 측정 acridine 오렌지 형광 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 마우스 (여기 다시 아무 jugular 테 이식 했다) 없이.</li>
	</ol>
	
	<li>일단 테 장소 이며 2 년은, 현미경 마우스를 놓습니다. 장거리 콘덴서와 X 10을 사용 하 여 고속 넓은 필드 형광 현미경으로 측정을 수행 (NA 0.3)는 단색, 빔 스플리터와 전 하 결합 소자 카메라 물 침수 목표. 이미지 수집 및 실시간 이미징 시스템 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>경 동맥 내 피 표면에 중간 현미경 목표 초점. 천천히 주사 50 µ L의 acridine 오렌지 (0.5 mg/mL) (고려 첫 번째 주입을 위해 카 테 터의 죽은 볼륨). 이미지 당 120 밀리초의 노출 시간 100 이미지 기록 소프트웨어를 설정 합니다.</li>
	<li>각 비디오에 대 한 동맥에 다른 위치에서 경 동맥 (왼쪽 및 오른쪽) 당 4 개의 동영상을 확인 합니다. 형광 신호 감소, acridine 오렌지의 또 다른 50 µ L을 주입.</li>
	<li>모든 동영상을 녹화 후 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.</li>
	<li>초당 10 이미지 비디오 속도 설정 하 고 각 비디오에 대 한 선박 중앙 배치 200 µ m x 250 µ m 사각형 보기에서 롤링 및 부착 세포 계량. 롤링 및 부착 셀; 부착 세포 이동 하지 않거나 10 s 비디오 내 피에서 분리 된 셀으로 정의 됩니다. 정량화를 단순화 하기 위해 빨간 형광으로 채널을 제거 하 고 롤링 및 접착 셀만 녹색 형광을 사용 합니다.</li>
	<li>실험 acridine 오렌지를 사용 하 여, 내 피 세포에 의해 만들어진 배경을 제거 하기 위해 형광의 수동 임계값을 확인 합니다.</li>

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</ol>

저자 공개할 게 없다

LysM+ monocytes 이전 고혈압5의 개발에 연루를 표시 했다. 여기 우리가 LysM+ 면역 세포 롤 및 내 피 레이어 AngII 주입에 대 한 응답에서을 보여줍니다. 이 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 얻은 acridine 오렌지6,10의 주입으로 백혈구를 시각화 하 여 비보에 고혈압에 면역 세포의 역할을 탐구 하는 우리의 이전 연구에서 생쥐. 따라서, 준수 하는 내 피 세포 유형의 차별 수 없었습니다.
IVM 혈관 연구 그리고 vivo에서 , 맥 관 구조에 직접 셀의 관찰에 대 한 매우 유용한 도구입니다 하지만 고혈압의 염증 성 맥락에서 수술로 삽입 된 카 테 터의 도움으로 염료를 주입의 영향 알 수 없는 남아 있습니다. 카 테 터와 acridine 오렌지의 잠재적 효과 평가 하기 위해 주입 우리 이용 했다 LysMCre++ IRG 쥐. AngII 주입 증가 수 있는 피에 LysM+ 세포의. 경 정 맥에 카 테 터의 삽입 효과 증폭 하 고 더 롤링 하 고 붙는 백혈구 테 임 플 란 트 없이 마우스에 비해 카 테 터와 기구 AngII-주입 마우스에서 발견 되었습니다. 이 이식 조직의 염증 반응의 맥락에서 상처 고혈압18에서 면역 반응으로 오버레이 치유 경 카 테 터 원인의 나타냅니다. 또한, 경 동맥을 경 정 맥의 근접 때문 추가 면역 활성화 수 생겼다 경 정 맥에 영향을 미치는 여. 이 효과 없는 꼬리 정 맥에 직접 주사 되었다 때, 이후 우리 효과 예정 이었습니다 추측할 수 있는 염료에 아닙니다 그러나 카 테 터를 삽입 하는 절차. 우리 여기 실험 동안 vivo에서 프로세스와 방해 하지에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 기자 마우스의 중요성을 설명 했다. 또한, 형광 추적기의 꼬리 정 맥 주입 jugular 테 주사 가능한 대안을 수 있습니다.
절차의 하나의 중요 한 단계는 AngII 주입 이다. 혈압의 꼬리 팔목 평가 펌프 AngII 전달의 효과 제어 하기 위해 만들 수 있습니다. 주입의 2−3 일 후 혈압 증가 한다. 제한 하려면 LysM+ 세포 활성화에 영향을 미칠 수 있는 염증, 펌프는 이식 절 개의 폐쇄 클립 대신 봉합 여야 한다. 꼬리 정 맥 주입에 대 한 한 가지 한계를 지적 한다: 각 경 최고의 가능한 데이터 수집을 하려면 4 동영상 촬영 일반적으로. 형광 신호 감소, acridine 오렌지의 50 µ L 주입 하지만 꼬리 주사로 더 어렵습니다 여러 주사는 년 현미경 목표 아래 안정적으로 유지 하 고. 경 정 맥에 카 테 터의 존재의 기간 때문에 혈소판이 풍부한 혈장 카 테 테 르 주입19후 4 h 준비에 응고 활성화에 영향을 미치는 면역 세포 활성화를 조절 또한 수도 있습니다. 카 테 테 르 주입의이 부분 추가 조사가 필요합니다.
마지막으로, 우리가 감사 jugular 카 테 테 르 주입 AngII 주입 후 LysM+ 세포 활성화에 미치는 영향, 경우에 우리 수 없습니다 완전히 견적 준비, 피부 제거, 및 잠재적인 LysM+ 셀에 경 격리의 역할 활성화입니다. 우리는 그 형광 기자 마우스를 사용 하 여 같은 결론 LysMCre++ IRG 마우스 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 동물 준비 중 선박 무결성의 혼란을 피하기 위해 좋습니다.

동맥 고혈압 심혈 관 질환과 죽음의 위험을 증가 하 고 동맥 경화 증, 관상 동맥 심장 병 및 동맥 또는 정 맥 thromboembolisms1의 개발을 촉진. 고혈압의 개발 환경, 유전, 내 분 비과 hemodynamic 요인의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 현재, 면역과 관련 된 염증 고혈압2의 병 인에 중요 한 역할을 감사 합니다.
면역 세포 중 T 림프 톨, monocytes 그리고 대 식 세포는 AngII 유도 혈관 염증과 고혈압, 반응성 산소 종3하 그들의 능력에 관련 부분에 원인이 되 관련 된 것을 발견 했다. 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 결핍 마우스 혈압 증가 및 혈관 염증4AngII 감소 반응을 보였다. 이전 작품에서 우리는 LysM + monocytes 드라이브 AngII 유발 고혈압5에 염증과 혈관 장애는 표시할 수 있습니다. 더 최근에, 우리는 새로운 통로 응고에 요소 사이 협력 혈소판 및 트 롬 빈-종속 혈관 염증6유도 하 혈관 벽 설명. 고혈압에 면역 시스템의 역할에 대 한 현재의 지식은 요약 최근 되었고 로드 리 게 스-Iturbe 외의 검토. 7
때문에 고혈압의 개발에 면역 세포의 관련 되었다 분명, 모델 및 선박 및 면역 세포 간의 상호 작용을 공부 하는 기술을 필요한 되었다. 혈관의 Epifluorescence IVM vivo에서 순환 하는 혈액 세포와 내 피8,,910간의 상호작용을 관찰 하는 유용한 도구입니다. 이 기술로 염료 (acridine orange) 같은 dna intercalating의 주입 nucleated 세포 순환 뿐만 아니라 (endothelium에서)을 시각화할 수 있습니다. Ex vivo rhodamin-6 G와 격리 된 혈소판 스테인드 또는 dichlorofluorescein (DCF) 동맥 또는 정 맥 손상 모델에서 혈소판이 풍부한 혈전을 시각화를 주입 할 수 있습니다.
경 정 맥 카 테 터를 추적기를 삽입 하는 데 사용 하 또는 표시 하는 일반적으로, 혈소판. Endothelium의 변경 및 응고 캐스케이드의 후속 활성화 모두 monocyte 활성화에 효과를 알려져 있습니다. 내 피 부상 즉시 이끌어 낸다 혈소판 활성화 subendothelial 매트릭스 분자를 통해 이어지는 monocyte 매력 및 활성화11조직 인감. 그와 반대로, 그대로 피는 항 응 혈 약 속성 (예를 들어, 직물 요인 통로 억제 물 또는 thrombomodulin)12 과 직접 금지 monocyte, 예를 들면,의 분 비를 통해에 알려져 microRNAs13를 포함 하는 extracellular 소포. Monocytes 조직 요인, 특급 프로 테아 제-활성화 수용 체 (동위) 트 롬 빈에 의해 활성화 될 수 있다 monocyte 활성화14,15에에서 참여 하 고 응고 캐스케이드의 외부 활성 제를 생산 알려져 있습니다. . 따라서, 어떤 활성화 혈소판 또는 응고 캐스케이드 혈관 부상으로 인해 있을 수 있습니다 monocyte 활성화에 대 한 예기치 않은 효과 관찰된 현상 방해. IRG 유전자 변형 LysM Cre 유전자 변형 생쥐, 더블-형광 Cre 기자 마우스 (LysMCre+IRG+)의 도움으로, 우리는 LysM+ 에 카 테 터와 대안 방법으로 주사의 효과 자세히 연구 제안 동맥 고혈압16의 마우스 모델에서 myelomonocytic 셀.

<table><tbody><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td>마취 혼합물</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Pfizer Deutschland GmbH</td><td></td><td>마취 혼합물</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmbH</td><td></td><td>마취 혼합물</td></tr><tr><td>Alzane</td><td>Zoetis,</td><td></td><td>안티세단 혼합물</td></tr><tr><td>Flumazenil</td><td>Hikma 제약</td><td></td><td>안티세단 혼합물</td></tr><tr><td>Braunol</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>옥테니덤</td><td>Sch&uuml; lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼투압 펌프</td><td>Alzet</td><td>1007D</td><td>삼투압 펌프 주입</td></tr><tr><td>안지오텐신 II</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td>삼투압 펌프 주입</td></tr><tr><td>7-0 프롤렌 봉합사</td><td>Ethicon</td><td></td><td>삼투압 펌프 주입</td></tr><tr><td>아크리딘 오렌지</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카테터</td><td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td><td></td><td>내경, 0.28mm; 외경, 0.61mm</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI 형광 현미경</td><td></td></tr><tr><td>빔 스플리터</td><td>광도</td><td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td><td></td></tr><tr><td>대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10X</td><td>모노크로메이터가 있는 수침 대물렌즈</td></tr><tr><td>카메라</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>이미지 획득 및 분석 소프트웨어</td><td>, 올림푸스</td><td>실시간 이미징 시스템, eXcellence RT</td><td></td></tr><tr><td>마우스</td><td>, 잭슨 연구소</td>, <td>Jax 008705</td>, <td>B6. Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td></tr><tr><td>마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>Jax 004781</td><td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td></tr></tbody></table>

백혈구 롤링 angiotensin ii-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

혈관의 Epifluorescence intravital 비디오 현미경 (IVM) 면역 세포의 활성화 및 역할에 그들의 능력을 평가 하 고 내 피 층에 고착 하는 설정된 방법입니다. 형광 염료의 fluorophore 결합 항 체를 주입 하 여 세포를 순환의 일반적으로 사용 됩니다. 또는, 형광 기자 마우스 사용할 수 있습니다. + (LysM+) 특정 lysozyme M에서에서 백혈구의 상호작용 monocytes, 혈관 벽과 혈관 장애 및 동맥 고혈압에 중추적인 역할. 우리는 여기 시각화 하 고 압 연 하는 백혈구 및 접착 angiotensin II (AngII)에 있는 경 동맥에서 계량 기법 제시-IVM에 의해 쥐에서 고혈압을 유발.
카 테 터의 이식 혈관 벽을 손상 하 고 바꾸 인된 혈액 세포 응답에 연결 됩니다. 우리 다른 주입 기술 및 LysMCre++ IRG에서에서 백혈구를 시각화 하기 위해 관리 경로 비교 붉은 형광 단백질의 광범위 한 표현 및 LysM에 있는 녹색 형광 단백질의 조건식 마우스 + 세포. LysM+ 세포 활성화, 연구를 사용 하는 AngII 마우스 주입 압 연 및 접착 endothelium에 백혈구의 증가. 우리 역시 acridine 오렌지는 경을 사용 하 여 카 테 터를 주입 또는 직접 꼬리 정 맥 하 고 비교의 양을 압 연 및 준수 세포. 우리는 jugular 카 테 테 르 주입 당 회전의 수를 증가에 붙는 LysM+ 세포 가짜 주입 LysMCre++ IRG 마우스 컨트롤에 비해 발견. 이 활성화는 AngII 주입 마우스에서 증강 되었다. 흥미롭게도, acridine 오렌지 직접 꼬리를 통해 정 맥 증가 하지 않았다 LysM+ 세포 접착을 주입 또는 가짜 주입 마우스에서 압 연. 우리는 그로 인하여 실험 동안 vivo에서 프로세스와 방해 하지에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 기자 마우스의 중요성을 설명 했다. 또한, 형광 추적기의 꼬리 정 맥 주입 jugular 테 주사 가능한 대안을 수 있습니다.

년 LysMCre++ IRG의 쥐 AngII 주입 IVM를 사용 하 여 관찰 했다. Acridine 오렌지 jugular 카 테 터를 사용 하 여 주입 했다. 우리가 모든 nucleated 순환 세포 (배와 상호 작용 하는 셀 형식의 차별 남아 오픈 이후 선박 상호 작용 또한 수에 비해 혈관 벽 접촉 LysM+ 세포의 비율을 보면 목적 우리의 이전 작품에서 질문)입니다. 기준선에 jugular 카 테 터의 존재는 LysM+ 세포 (그림 2A, D)의 접착을 발생합니다. 오렌지 acridine 주입 후 동일한 세포 형광, 되었지만 또한 내 피 세포 형광 (그림 2B, E). 내 피를 제한 하려면 배경 감소 관련 형광, 후 데이터 나타냅니다 모든 nucleated 고집 셀 LysM+ (그림 2C, F); 이러한 결과 우리의 이전 결과 확인 하 고 LysMCre++ IRG는 LysM+ 세포 활성화에 AngII의 효과 관찰 하기 좋은 모델을 보여주는 AngII 주입 후 사실 만요.
우리 평가 acridine LysM+ AngII LysMCre++IRG에에서 주입 후 세포 활성화에 오렌지의 관리 노선의 역할. AngII 주입, 백혈구 endothelium 상호 작용의 1 주 후 LysMCre++ IRG의 경 동맥에 마우스 몇 군데 있었고 jugular 카 테 터를 통해 또는 꼬리 정 맥을 통해 오렌지 acridine 주입 없이 IVM에 의해 시각. 카 테 터 나 주입, 없이 LysM+ 세포의 롤링 크게 증가 되었다 AngII 주입 치료 쥐 및 접착에 비해 증가 (그림 3)를 보여준 후. Acridine jugular 테 증가 접착 및 AngII에서 오렌지의 주사 카 테 터 (그림 3) 없이 쥐와 비교 된 더 큰 정도로 쥐 취급. 과 비슷한 접착 acridine 꼬리 정 맥에 주황색의 사출 리드 acridine 오렌지 (그림 3)의 주입에는 영향을 받지 않은 쥐에 비해 압 연.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
그림 1입니다. Angiotensin II 주입 및 LysM+ 의 평가 제도 압 연 및 쥐에 접착 세포. LysMCre++ IRG 마우스 AngII 7 일 주입 했다 하 고는 년 동안 셀 acridine jugular 카 테 터를 통해 또는 꼬리 정 맥에 의해 오렌지의 주입 없이 계량 했다 준수로 LysM+ 압 연 사출입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
그림 2입니다. LysM+ 세포 접착 및 IRG+ 마우스 LysMCre+의 경 동맥에서 압 연의 평가. 접착의 LysM+ LysMCre+(A, D) 전에 IRG+ 마우스 세포 (B, E) acridine 주입 jugular 카 테 터를 통해 후. 빨간색과 녹색 형광 기록 했다, (녹색)에서 LysM+ 세포 및 평활 근 세포 (빨간색)으로 표시 했다. Acridine 오렌지의 주입, 후 내 피 세포도 그린에서 볼 수 있지만 셀 시각화 (C, F) nucleated만 순환 수 배경 형광을 제거. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
그림 3입니다. Angiotensin II에에서 형광 염료의 관리 노선 평가 LysMCre+IRG+ 쥐를 주입. 압 연 (A)와 (B) LysM+ 준수의 정량화 세포 가짜 운영 또는 AngII 생긴 동물 및 또는 없이 acridine 오렌지 jugular 카 테 터를 사용 하 여 또는 꼬리 정 맥 주입 하 여 주입. 다른 조건 (C)의 대표 사진. 결과 평균 ± 표준 오차의 의미. 2-방법은 ANOVA 수행한 Bonferroni의 임시 게시물 테스트, n = 3-12/그룹; p &lt; 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 원고 설명 기자 유전자 변형 마우스의 사용 및 다른 관리 경로 angiotensin II 유발 고혈압 면역 세포의 활성화를 평가 하기 위해 혈관의 intravital 비디오 현미경을 사용 하 여 형광 염료의 그들의 롤 및 endothelium에 고착 하는 능력.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

이 epifluorescence intravital video microscopy 또는 IVM protocol of blood-prints의 전반적인 목표는 마우스에서 Angiotensin II에 의해 유발된 고혈압에서 부식된 동맥의 백혈구 롤링 및 접착을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 혈관 기능 장애 및 동맥 고혈압의 병리학에서 백혈구, 특히 리소좀과 양성 세포 간의 상호 작용 메커니즘, 혈관 기능과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 순환 혈액 세포와 혈관 이해 사이의 생체 내 상호 작용을 볼 수 있다는 것입니다.텍스트 protol에 따라 osmatic pumps로 안지오텐신 2 치료 7일 후 수술을 위해 수컷 마우스를 준비합니다. 시술 중 눈을 보호하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 마취된 동물을 섭씨 39도의 수술 플레이트에 등쪽 누움으로 놓고 직장 프로브를 삽입하여 온도를 유지합니다.면봉을 사용하여 제모 크림을 펴 바르고 머리카락이 빠지기 시작할 때까지 목에 문지릅니다. 그런 다음 2분 더 후 주걱을 사용하여 수염과 크림을 제거합니다. 그런 다음 알코올 피부 소독제를 사용하여 피부를 소독하십시오.그런 다음 실체 현미경으로 기관에서 1cm 떨어진 목 피부를 1-1.5cm 세로 절개합니다. 그런 다음 첫 번째 절개 부위의 양쪽 끝에 2개의 수직 절개를 만듭니다. 피부 바로 아래에 있는 조직을 조심스럽게 제거하고 왼쪽 경정맥과 기관을 덮고 있는 피부 조각을 제거합니다.다음으로, 두 개의 구부러진 집게를 사용하여 설하 및 상악하 부식된 땀샘을 관심 영역에서 조심스럽게 분리합니다. 땀샘을 자르거나 손상시키지 않도록 주의하면서 경정맥과 관정맥에 가장 잘 접근할 수 있도록 위치를 잡습니다. 그런 다음 경정맥을 분리하기 위해 혈관과 주변 조직 사이에 얇은 집게를 삽입하고 기구를 천천히 열고 닫아 조직에서 정맥을 부드럽게 분리합니다.경정맥이 완전히 깨끗해지면 겸자를 혈관 아래에 놓고 그 아래에 10cm 길이의 7-0 봉합사 2개를 놓습니다. 두 개의 매듭을 묶어 머리에 가까운 봉합사를 닫고 두 번째 봉합사로 한 매듭을 준비하되 닫지 마십시오. 이제 한 손에는 집게를 들고 섭씨 37도의 멸균 식염수로 채워진 카테터를 잡고 다른 손으로는 가위나 구부러진 26게이지 바늘을 사용하여 혈관을 작게 절개합니다.경정맥에 카테터를 삽입하고 매듭을 두 번 닫습니다. 그런 다음 카테터 위의 머리 근위부에 있는 봉합사를 닫아 완전히 고정할 수 있도록 합니다. 부식된 동맥을 분리하고 준비하려면 얇은 곡선 집게를 사용하여 기관을 덮고 있는 영역을 절개합니다.그런 다음 부식된 부분이 주변 조직에서 제거되면 필요한 경우 얇은 겸자를 천천히 닫았다 열어 신경을 부드럽게 동원하여 혈관에서 라스베가스 신경을 절단하지 않고 제거합니다. 양쪽 동맥이 완전히 깨끗해지면 첫 번째 부식된 동맥 아래에 집게를 놓고 혈관이 과도하게 늘어나지 않도록 주의하면서 3mm x 2.5cm의 작은 검은색 플라스틱 혈관 홀더를 혈관 아래에 놓습니다. 용기 홀더가 제자리에 고정되면 혈류가 있는지 확인하십시오.혈관이 늘어나지 않도록 작업자의 손은 부식된 동맥을 분리하기 위해 첫 번째 집게를 한 번 움직여야 하며 두 번째 집게를 사용하여 혈관 아래에 구멍을 뚫어야 합니다. 혈관 홀더가 올바른 위치에 있으면 두 번째 동맥을 장치 위에 놓습니다. 마우스를 현미경 바로 아래에 두지 않은 경우 땀샘을 기관 위에 다시 놓고 섭씨 37도의 멸균 식염수를 적용하여 영역이 건조되지 않도록 합니다.1mL 주사기에 1mL 당 2mg의 해동된 아크리딘 오렌지 원액을 멸균 식염수에 1-4 희석합니다. 주사기를 빛으로부터 보호하십시오. 측정을 수행하려면 장거리 콘덴서와 단색계, 빔 스플리터 및 CCD 카메라가 있는 10x 침수 대물렌즈를 사용하여 고속 광시야 형광 현미경 아래에 마우스를 배치합니다.내피 표면의 부식된 동맥 중간에 대물렌즈의 초점을 맞춰 실시간으로 이미지를 획득합니다. 아크리딘 오렌지 50mL를 천천히 주사합니다. 그런 다음 사진당 100밀리초의 노출 시간으로 120개의 이미지를 기록하도록 소프트웨어를 설정합니다.각 비디오에 대해 동맥의 다른 위치에서 부식된 동맥당 4개의 비디오를 녹화합니다. 형광 신호가 감소하면 아크리딘 오렌지 50mL를 더 주사합니다. 다른 조건을 테스트하기 위해, 경정맥 카테터가 삽입되지 않은 경우 아크리딘 오렌지를 측면 꼬리 정맥에 직접 주입하고 동일한 이미지 획득을 수행합니다.대조군으로, 주입되지 않은 lys-Mcre 양성, IRG 양성 마우스의 형광 측정을 기록합니다. 각 비디오의 용기 중앙에 배치된 200 미크론 x 250 미크론 직사각형 보기에서 초당 10개 이미지의 속도로 표시되는 롤링 및 접착 셀을 정량화합니다. 롤링 및 접착 세포를 계산합니다.부착 세포는 10초 비디오 내에서 내피에서 이동하거나 분리되지 않는 세포로 정의됩니다. 정량 분석을 단순화하려면 빨간색 형광이 있는 채널을 제거하고 녹색 형광만 사용하여 rolling 및 adhering 세포를 계수합니다. 이 연구에서는 IVM을 사용하여 안지오텐신 2를 주입한 lys-mCre 양성, IRG 양성 마우스의 부식을 관찰했습니다.여기 기준선에서 볼 수 있듯이, 경정맥 카테터의 존재는 lys-M 양성 형광 세포의 접착을 초래했습니다. 아크리딘 오렌지 주사 후, 내피 세포도 형광을 띠었습니다. 그런 다음, 내피 관련 형광을 제한하기 위해 배경을 줄인 결과, 모든 핵 부착 세포가 lys-M 양성임을 밝혔습니다.이 실험에서는 안지오텐신 2 주입 일주일 후 lys-M Cre-positive IRG-양성 마우스의 부식된 동맥에서 백혈구 내피 상호 작용을 경정맥 카테터 또는 꼬리 정맥을 통해 아크리딘 오렌지 주사 유무에 관계없이 IVM으로 이미지화하고 시각화했습니다. 카테터나 주사를 하지 않은 경우, 안지오텐신 2 주입 후 lys-M 양성 세포의 롤링이 치료되지 않은 마우스에 비해 유의하게 증가했습니다. 그리고 접착력도 높아졌습니다.경정맥 카테터와 함께 아크리딘 오렌지를 주입하면 안지오텐신 2 처리 마우스에서 카테터가 없는 마우스에 비해 접착력과 롤링이 더 크게 증가했습니다. 마지막으로, 이 패널에서 볼 수 있듯이 꼬리 정맥에 아크리딘 오렌지를 주입하면 아크리딘 오렌지를 주입하지 않은 마우스와 유사한 접착력과 롤링이 발생합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 30분 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때 혈관 주변의 조직을 손상시키지 않도록 하는 것이 중요하다. 개발 후 이 기술은 심혈관 및 지혈 분야의 연구자들이 생체 내에서 혈관벽에 대한 백혈구 및 혈소판 부착을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 IVM에서 염료 주입 및 수술의 영향을 제한하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.삽입성 형광 염료로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑과 같은 적절한 재료로 염료와의 피부 접촉을 피해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

이 비디오에서는 복강내에 지질다당류를 주입한 마우스 모델의 장간막 정맥에서 혈액 세포-내피 상호 작용의 실시간 시각화를 보여줍니다.

염증 마우스 모델에서 혈액 세포-내피 상호 작용을 분석하기 위한 생체 내 현미경 검사

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

관절의 생체 영상 촬영은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 밝히는 데 매우 유용한 기법입니다. 여기서는 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA) 마우스 모델을 사용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 영상 검사는 관절 내 백혈구의 이동 행동을 밝혀냅니다

배우세요 Angiotensin II 유도 고혈압 마우스에서 백혈구 롤링 및 접착을 시각화하는 생체 내 비디오 현미경 기법. 이 방법은 혈관 기능 장애의 면역 세포 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

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