Name: Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 운동신경말단에서 PALM 기술을 이용한 단일분자 추적 방법을. Syntaxin-1A 단백질의 이동성과 국소화를 실시간으로 관찰하여 시냅스 단백질 역학을 연구할 수 있습니다.

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우리가 단일 분자 분석 종류 그들의 지원을 위해 장 바티스트 Sibarita와 다니엘 Choquet (IINS, CNRS/보르도의 대학) 감사합니다. 우리는 특히 닉 Valmas 감사와 비디오와 그들의 도움에 대 한 제시카 Mcgaw (QBI, 퀸즐랜드의 대학) 녹음, 음성으로 그래픽 디자인을 그림. 이 작품은 호주 연구 협의회 (AR) 검색 프로젝트에 의해 지원 되었다 (F.A.M. DP170100125), 호주 연구 협의회 (F.A.M. LIEF 그랜트 LE0882864), 미래 친교 (FT100100725 B.V.S.), 호주 연구 협의회 (LIEF 부여 F.A.M에 LE130100078입니다.) 그리고 NHMRC 프로젝트 부여 (B.V.S.에 APP1103923). F.A.M. NHMRC 수석 연구원 (ONT1060075)입니다.

1. 유전자 변형 초파리 mEos2 태그 단백질 표현 디자인
<ol><li>태그 mEos2 단백질와 단백질을 선택 합니다. 이미징 성공률을 높이기 위해 선택 도메인 막 횡단 단백질 신경 원형질 막14 (예를 들어, Syntaxin-1A), 시 냅 스 소포 또는 autophagosomes26,27 (예를 들어, 단백질 Synaptobrevin-2), 또는 cytosolic 단백질 신경 플라즈마 막 단백질 (예를 들어, Munc18-1)와 가까운 상호 작용을.</li>
	<li>MEos2 태그 단백질 (그림 1) 인코딩 transgenes를 생성 합니다. 단백질 및 mEos2에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관 디자인. 참고: mEos2 코딩 순서는 관심사의 단백질의 C-말단에 융합 하도록 설계 되었습니다 pmEos2 N1 플라스 미드에서 증폭 될 수 있다. 복제 예 수행할 수 vivo에서 재결합 Saccharomyces cerevisiae 사용 하는 pFL44S에에서 의해-attB-MCS-w + 벡터14,28, 깁슨 등 다른 복제 메서드를 사용할 수 또는 어셈블리 프로토콜29<ol>
<li>BamHI 및 XbaI 벡터를 선형화 하 고 공동 인코딩 mEos2 및 관심사의 단백질 PCR 파편 함께 ura3- 효 모 세포로 변환. 유전자 변형 플라이 라인30를 생성 하는 구문으로 초파리 배아를 주사.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후방 표준 효 모와 당 밀 매체 또는 플라스틱 튜브에 포함 된 다른 어떤 적당 한 대체에 유전자 변형 비행 문화. 건강 하 고 상당히 큰 시 냅 스 boutons31, 튜브, 인구 과잉 파리 방지 고 계란-누워;의 매일 후 새로운 튜브에 파리를 플립 이렇게 세 번째 탈피 애벌레는 먹이 잘 하면 그들은 매체에 방황 시작 시간에 의해 적절 한 크기를 도달 합니다. 실 온 (25 ° C)에서 유전자 변형 비행을 올립니다. 참고: 큰 시 냅 스 boutons 이미징 동안 구상 단백질의 큰 수량을 산출 하는 경향이 있다.</li>
</ol>2입니다. 유 충 탈피 3의 해 부
<ol><li>지름 및 적절 한 실리콘 엘라 스토 머 키트 (그림 2A)를 사용 하 여 높이에 mm ≤20 mm 원통형 또는 semicylindrical 모양된입니다 (PDMS) 기본 ≤20을 확인 합니다. 실리콘 엘라 스토 머는 실리콘 경화제 10: 1의 비율로 믹스.<ol>
<li>철저 하 게 5 분 부는 dimsensions와 금형에 혼합물 위에 나열 된에 대 한 혼합물을 저 어. 오븐에서 45 분 동안 100 ° C에서 강화 하자. PDMS 기본 해 부를 실시 하는 재단 될 것입니다. PDMS 자료 유리 바닥 문화 접시의 우물에 맞는 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리병 벽에서 방황 하 고 세 번째 탈피 애벌레를 선택 합니다. 4.5 확대 광학 스테레오-현미경을 사용 하 여 시각화를 지 면 PDMS 원통형 기지에 배치 하는 유 충.</li>
	<li>곡선 및 minutien 핀 입 걸 앞쪽 spiracles, 확장 하는 2 사이 머리에 그리고 두 후부 spiracles 사이의 항문에 꼬리에 붙어 핀셋을 각도 사용 합니다. 고정된 유 충에 실 온에서 슈나이더의 곤충 매체의 40 µ L를 추가 합니다. 참고: Hemolyph 같은 솔루션 (HL3 또는 HL6) 또한 슈나이더의 솔루션32,33대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>Minutien 핀 벽의 중간에 incise을 사용 하 여 유 충의 복 부 체 벽의 지 면을 통해 액세스를 제공 합니다.</li>
	<li>체 벽을 사용 하 여 봄이 위 절 개 포인트에서 엽니다. 이전 후부 방향34에서 중간을 따라 자릅니다.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 고 사람은 유 충을가 위 봄: 침 샘, 기관, 창 자 등 내장을 제거. 슈나이더의 곤충 매체와 두 번 유 충을 씻어.</li>
	<li>좋은 집게 두 체 벽 날개를 잡고, 부드럽게 그들을 밖으로 기지개와 각 측면에 2 개의 minutien 핀을 스틱. 이 육각형 모양의 준비 (그림 2A)을 생산 한다.</li>
	<li>봄이 위를 사용 하 여 이미징; 동안 근육 움직임의 가능성을 감소 하 고 복 부 신경 코드에서 뇌를 분리 이 또한 평면 이미징 요리에 대 한 준비를 제공 합니다. PDMS 베이스에 모든 6 개의 minutien 핀을 밀어 곡선된 핀셋을 사용 합니다. 참고: 핀의 단지 작은 부분 복 부 벽 안에 포함 한다.</li>
	<li>유 충 해 부 절차 살아있다 확인, 약간 복 부 신경 코드를 찌 르 지,이 유 충 복 부 벽의 연동 수축을 유도 한다.</li>
</ol>3. 약간 비스듬한 조명 단일 입자 추적 현미경
<ol><li>유리 바닥 문화 접시에 해 부 유 충-PDMS 기지 반전. 실내 온도 슈나이더의 곤충 매체 (그림 2B)의 2 개 mL로 이미징 접시를 채우십시오.</li>
	<li>복 부 근육 6 및 735 63 x를 사용 하 여 시 냅 스와 함께 두 번째 및 세 번째 세그먼트에 모터 뉴런을 찾습니다 / 1.2 형광 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 나 물 침수 목표.</li>
	<li>해 부 유 충;를 사용 하는 현미경의 접 안경 밝은 분야 조명 사용 하 여 근육 6를 식별 합니다.</li>
	<li>현미경 수집 소프트웨어를 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 구성에 TIRF에 침투 깊이 증가, 그렇지 않으면 간접 조명 달성 TIRF 중요 한 각도에서 이동 1 °를 겨냥 틀 카메라 각도 밀어.</li>
	<li>녹색에서 mEos2를 시각화 하는 488 nm 레이저를 켠다. 낮은 레이저 파워를 사용 하 여 (22.8의 5% 미만 mW)을 피하기 위해 녹색 형광 표백. (어떤 문자열에 구슬 처럼 보이는) 신경 근육 접합 찾아서 낮은 해상도 TIRF 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>동시에 405 nm 레이저에 전환 (빨간 종 녹색에서 photoconverts mEos2)와 확률론 단일 mEos2 형광 단백질을 지역화 하려면 561 nm 레이저 (이미지 빨간 photoconverted mEos2). 참고: 낮은 405 nm 레이저 힘의 사용은 권장 (4.78의 0.9%를 0.005 mW)이 영화 중 비교적 일정 photoconversion 속도 대 한 수 있습니다. 50와 75 %561 nm 레이저의 사용 (20.1 mW), 이것이 신경 근육 학 교차로 주변 근육 조직의 형태에 부정적인 영향을 주지 않고 빨간 mEos2 종에서 형광을 확보 하기에 충분.</li>
	<li>각 신경 근육 접합 체인 시리즈 이상으로 구성 15000 프레임 33 Hz.에 as.czi 형식 저장 가능한 참조에 대 한 함께 메타 데이터를 보존 하기 위해 한 번 취득.</li>
	<li>ImageJ를 사용 하 여 '.tiff' 파일을 '.czi' 동영상 파일을 변환.</li>
	<li>추적 분석 소프트웨어11,14,36 TrackMate 같은 피지/ImageJ37 에 적합 한 단일 분자와 인수 영화 분석 ( 재료의 표참조). 'X' 및 'y' 강도 포인트의 가우스 맞는 각 지역화의 좌표 확산 기능 (PSF). 참고: 문제 해결: 녹색 형광 관찰 되지 않거나 488 nm 레이저에 노출 되 면 신경 근육 학 교차로에서 너무 희미, 짧게는 photoconverting 및 레이저 이미징에 스위치 (405 nm 및 561 nm),이 레드의 더 생산 하는 데 도움이 mEos2의 종입니다. 다음 488 nm 레이저로 다시 전환 하 고 TIRF 이미지.</li>
</ol>4. 단일-분자 지역화 고정된 애벌레에
<ol><li>팜 통해 단백질 nanocluster 크기를 측정 해 부 고정 제-4 %paraformaldehyde 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 희석 된 후 슈나이더의 곤충 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 유 충을 품 어.</li>
	<li>제거 해 부 핀 고 고정된 유 충 1.7 mL에 스냅 잠금 microcentrifuge 튜브를 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>해 부 및 다른 많은 애벌레 필요에 따라 다음 그들 3 회로 씻어 PBS로 수정.</li>
	<li>블록 버퍼 (PBS, 0.1% 트라이 톤 X-100 그리고 3% 정상 염소 혈 청의 솔루션)에 PBS를 바꿉니다.</li>
	<li>PBS와 애벌레 세 번 세척 후 필요한 기본 항 체 (블록 버퍼 솔루션에 희석)으로 품 어.</li>
	<li>4 oc.에서 밤새 품 어</li>
	<li>3 회와 함께 PBS, 애벌레를 세척 후 필요한 이차 항 체 (블록 버퍼 솔루션에 희석)으로 품 어.</li>
	<li>세 번 PBS와 애벌레를 씻고, 다시 PDMS 기지, 앞에서 설명한 단일 분자 추적에 대 한 이미지에 유 충을 첨부.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜 3 탈피 초파리 애벌레의 신경 근육 학 교차로에서 단백질 mEos2 태그의 단일 분자 추적을 설명합니다. -표현의 유전자 변형 단백질을 피하기 위해, Syntaxin-1A-mEos2 식 생 Syntaxin-1A 발기인에 의해 주도 되었다. 시 냅 스 단백질 이동성의 연구는 대부분 체 외에서 배양된 세포와 대뇌 피 질의 뉴런9,11,,1213의 조사 제한 되었습니다. 이 단백질 전시 살아있는 동물에서 비슷한 이동성 서명 여부를 하는 것은 크게 알려져 있다입니다. 단일 단백질 이동성에 vivo에서시각화 하 등 광학 투명성, 접근성, 그리고 침투 깊이 한계 극복할 수 있다. 애벌레 준비를 해 부하 고 시각화 하는 근육의 표면에 포함 된 신경 근육 접합부, 우리 광 투명성과 접근성의 문제를 피할. 일반 TIRF 구성에서 이미지 단일 분자 이동성 시도 실패 입증. 그러나, 약간 비스듬한 조명 사용 증가 여기 레이저 깊이 침투 수 있습니다. 또한, 유 충을 무력화 하는 데 사용 하는 minutien 핀을 단백질 이동성에 마 취 사용의 어떤 가능한 부정적인 영향을 피하기 위해 도움이. 그것은 기름 침수 목표, x 100 같은 높은 배율 목표를 사용 하 여 단일 분자 비보를 시각화 수 있습니다. 그러나, 증가 확대 초점 드리프트의 발생을 증가할 수 있습니다. 또한, 우리는 낮은 강도 (~ 30%) 사용 모터 신경 맨끝에 단일 분자 이미지를 성공적으로 561 nm 레이저. 추가 테스트 하는 것은 저전력 레이저를 사용 하 여 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜은 신경 원형질 막의 근접 내의 시 냅 스 단백질의 이동성을 시각화 적당 하다. 이 방법을 사용 하 여, 작은 단백질-Syntaxin-1A 및 바인딩 단백질 Atg18a autophagosome-의 이동성 성공적으로 이미지 비보14,26되었습니다. 모터 신경 축 삭도 수에 단백질의 이동성27조사. 그러나, 뇌 또는 복 부 신경 코드에 단백질의 이동성의 기본 조직을; 제작한 높은 배경 신호 때문에 평가 하기 어려운 증명할 수 있습니다. 또한, (replicability 되도록) 뇌 구조를 태그 붙일 필요 합니다 같은 뇌 구조에 단백질 이동성을 시각화 하 고 듀얼 카메라 이미징의 사용을 필요한 것.
보다 더 많은 개발 3 탈피 애벌레38,39 초파리 에서 슈퍼 해상도 현미경에 대 한 현재 사용할 수 있는 방법은 주로 이미징 배아, 제한 됩니다. 이러한 프로토콜 주요 문제는 그들은 몇 군데, 지역에서 궤도의 낮은 수를 산출 하 고 그러므로 이동성 상태22,40의 심층 분석을 방지. 우리의 vivo에서 단일 분자 프로토콜 추적 궤적의 높은 번호를 생성 하는 능력 있으며 따라서 Caenorhabiditis 선 충 , 제 브라 등 다른 동물 모델에서 사용 될 수 있습니다. 실제로, 모든 NMJ 체인 생성 ~ 2400 궤도 다른 모바일 상태와이 상태14,27사이 전환 분석을 위해 적당 한 만들기. 또한, 많은 비보에 단일 분자 이미징 전략은 동물20,22는 이미징 이루어집니다 physiologic 기능을 변경할 수 있는 무력화 하는 마 취약의 사용에 의존 합니다. 여기 우리는 minutien 핀을 사용 하 여 애벌레를 무력화 하는 ' 마 취 무료 ' 프로토콜을 최적화.
이 프로토콜의 사용 가능성은 3 개 차원에 있는 단백질의 이동성을 시각화에 대 한 있을 수 있습니다. 슈퍼 해상도 현미경에 최근 발전 있도록 단백질 이동성 시각화 된 체 외에 'x', 'y', 그리고 'z' 차원41,42. 우리의 현재 메서드의 'z' 축에 있는 단백질의 이동성에 대 한 고려 하지 않습니다. 그러나 터미널 초파리 모터 신경 구형 구조 이며 귀중 한 미래의 접근 3 차원 볼륨43단백질 이동성을 계량 하는 것. Z-차원에서 이미징은 난시 렌즈를 사용 하 여 가능 합니다. 또는, TIRF 모드44,45, z-해상도 증가 된다. 그러나, 우리의 실험에서 난시 렌즈 없이 syntaxin1A mEos2의 단일 분자 시각화에 약간 비스듬한 조명을 사용 했습니다.
결론적으로, 두 유전자 변형 초파리 비행 재고 표현 하는 단백질의 유전자 변형 유 충으로 변화의 가능성을 갖춘 TIRF 현미경을 해 부하는 photoconvertible 단백질, PDMS 기본 태그로 조명의 각도이 프로토콜에 설명 된 대로 단일 단백질을 시각화 하는 데 필요한 가장 중요 한 도구입니다.

신경 통신 원형질 막1시 냅 스의 소포를 포함 하는 신경 전달 물질의 규제 융합을 통해 발생 하는 신경 전달 물질 방출에 의존 합니다. Exocytosis2,,34,,56 라고 하는이 프로세스는 매우 동적 이며 업 또는 다운-통제 자극7의 속도 변동에 따라 될 수 있습니다. 이러한 프로세스에 관련 된 단백질 브라운 모션 적용 되며 따라서 전체 조직 유지 하는 다양 한 바인딩 이러한 생리 기능을 보강 하는 작업의 수를 표시. 플라즈마 막 단백질은 매우 동적, 원형질 막7,,89,10,11에 nanoclusters로 분자의 측면 트래핑을 허용 12. 따라서, 이러한 단백질의 이동성 조사 작업8의 그들의 모드를 명료 하 데 도움이 됩니다. 지금 알려진 다 측면 빠른 기동성을 전시 하 고 옆쪽으로 분자 제공할 수 있다 nanoclusters 내에서 트랩핑 녹는 N-ethylmaleimide 민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (SNAREs), 예를 들면 Syntaxin-1A, 같은 시 냅 스 단백질 창 고 그리고 소포 융해9,13,,1415에 대 한 사이트.
Photoconvertible 형광 단백질 단위체 (m) Eos16,17 가18, 등의 최근 개발 허용 했다 접근의 사용을 통해 신경 플라즈마 막 단백질의 전체 해상도 등 사진 활성화 지역화 현미경 (팜) 및 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)14,,1519. 이러한 발전 성과 교양된 라이브 세포와 신경 생물학 단백질의 nanoclustering에 대 한 조사를 활성화 했습니다. 최근에, 연구는 실시 되었습니다 명료 (비슷한 높은 해상도)에서 역학과 라이브 그대로 생물의 신경에 있는이 막 단백질의 조직 같은 생쥐, 꼬마 선 충, 및 를 초파리 melanogaster14,20,,2122.
하지만 또한 같은 hindrances를 극복 하는 능력 뿐만 아니라 (예: 팜, 폭풍우, 및 photoconvertible fluorophores), 최근에 개발 된 슈퍼 해상도 이미징 도구를 사용 해야 역학과는 단백질에서 생체 내에서 의 조직 조사 단백질 및 이미징 레이저의 침투 깊이 접근으로 그대로 동물에 세포내 단백질 이미징 본질적으로 이미지 그대로 마우스의 해 마 같은 그대로 동물의 생활 조직 내의 깊은 포함 하는 구조 단백질으로 도전 이다. 따라서, 단백질 또는 직물의 표면 가까이는 몇 군데 더 쉽게. Vivo에서 화상 진 찰과 다른 어려움은 동물에서 재현성 보장 이다. 로 해부학 한 샘플에서 다른 다를 수 있습니다, 다른 그대로 동물 샘플에서 복제의 용이성과 구조를 선택 하면 증명할 수 있는 또한 도전. 틀에 박힌 구조를 사용 하 여 같은 synapses, 이러한 어려움 들을 극복에 도움이.
최근 연구 결과 다른 조사 예는 조직/기관의 표면에 단백질 조직 몇 군데 있다 하는 동안 꼬마 선 충22, 같은 광학 투명 한 표 피와 동물에서 단백질 이동성을 몇 군데 있다 살아있는 마우스21의 두개골을 통해 대뇌 피 질의 뉴런에 걸 이미지입니다. 경우에 따라 마 취약 사용 되었습니다 움직이지; 동물 유지 그러나, 특정 마 취약 관심사의 단백질을 저하 수 있습니다. 따라서 오류를 최소화 하기 위해 vivo에서 화상 진 찰 동안 동물을 움직이기 힘 드는 유지 하는 대체 수단을 탐험 한다.
슈퍼 해상도 이미징 vivo에서 다른 경고는 관심사의 단백질을 조명 하는 데 사용 하는 레이저 부정적인 주변 조직에 영향을 미칠 수 및 따라서 여기 강도 가능한 한 낮게 유지는 것이 좋습니다. 레이저에 의해 주변 조직의 조명 또한 배경 신호를 증가 경향이 있다. 낮은 자극 강도 사용 하 여 백그라운드를 줄이는 데 도움이 됩니다, 그리고 그것은 되 고 경고는 또한 형광 단백질 광자 수확량에서 감소 이어질 수 있습니다. 분석 하는 동안 배경 빼기 대안 이미지 분석 전에 배경 신호를 줄이기 위해 수단으로 사용 될 수 있습니다.
초파리 는 vivo에서 특정 단백질 기능 조사에 대 한 기초가 튼튼한 유전 도구 제공 이미징에 대 한 이상적인 유기 체를 선물 한다. 상류 활성화 순서 (UAS)-Gal4 시스템 단백질의 시간적, 공간적 표현 가능 하 고 따라서 neurotransmission23, 조작 하는 데 사용 될 그런 초파리 과도 사용 하 여 열 유전자 자극 수용 체 잠재력 하위 가족 A1 (dTRPA1)24 또는 광학 유전자 자극 훨씬 red 이동 CsChrimson25 를 사용 하 여 이미징14와 결합 될 수 있다. 우리는이 시스템에서 수행 하는 단일 분자 이미징 vivo에서 의 합병증의 많은 극복 하 고 지금 설명 하는 방법 단일 입자 추적 실시 될 수 있습니다 초파리 melanogaster 3 탈피 애벌레에서.

<table><tbody><tr><td>PDMS (Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>광학 실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>곡선 핀셋 (스타일 5/45)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>Minutien 핀 (0.1mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(16%)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear 스냅잠금 마이크로 원심분리기 튜브(1.7mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black 수집 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>PALM Tracer 플러그인</td></tr><tr><td>플라이 스트레인</td><td></td><td>w1118; HA-SX1A-메오스2</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

최고 해결책 현미경 검사 법 기술의 증가 수는 나노 세포 세계 지배 메커니즘을 밝히기를 돕고 있습니다. 살아있는 세포에 개별 분자의 시각화에 대 한 특별 액세스 제공 단일 분자 이미징 기세를 얻고 있다. 여기, 우리가 초파리 애벌레에 단일 입자 추적 사진 활성화 지역화 현미경 (sptPALM)을 수행 하기 위해 개발 하는 기술을 설명 합니다. 도킹, 프라이 밍, 및 포함 하는 신경 전달 물질의 융합을 추진 하는 주요 연 접 단백질에 의존 하는 시 냅 스 통신 플라즈마 막으로 소포. 단백질 지질 및 단백질-단백질 상호 작용의 범위는 밀접 하 게 이러한 프로세스 조절 및 연 접 단백질 따라서 이동성 각 이러한 키 이벤트와 관련 된 변화를 전시. 이 단백질의 이동성 그대로 살아있는 동물에 그들의 생리 기능으로 연결 하는 어떻게 조사 하 고 행동의 그들의 정확한 메커니즘을 이해 하는 데 필수적 이다. 높은 해상도 vivo에서 단백질 이동성 추출 광학 투명성, 접근성, 등 침투 깊이 한계 극복 필요 합니다. Photoconvertible 형광 단백질 Syntaxin-1A를 약간의 간접 조명을 통해 시각 및 모터 신경 터미널에서 또는 제 3의 모터 신경 축 삭을 따라 추적 수 연 접 단백질에 초파리 를 탈피 하는 방법 설명 유 충입니다.

위에 나열 된, Syntaxin-1A-mEos2 유전자 변형 Drosophilamelanogaster 했다 프로토콜을 사용 하 여 생성 (그림 1). 유전자 변형 3 탈피 초파리 애벌레 PDMS 원통형 자료 (그림 2A-F)에 해 부 했다. Syntaxin-1A의 단일 분자를 시각화 하려면 우리는 약간 비스듬한 레이저 조명14TIRF 현미경에 팜 사용.
Syntaxin-1A의 단일 분자는 두 번째 복 부 세그먼트의 6 근육에 모터 신경 연 접 맨끝에 추적 했다. MEos2의 녹색 형광 형식 1b boutons 488 nm 레이저 (그림 3A)를 사용 하 여 흥분 하는 경우에 Syntaxin-1A-mEos2의 저해상도 이미지와 같이 검출 될 수 있었다. 이미징 실험, 405 nm 및 561 nm 여기 레이저 이미징 깊이 했다 133.5 및 165.6 nm, 각각. 녹색 이미지는 16 개별 프레임의 평균으로 인수 되었다. 이 녹색 이미지는 photoconverted 동영상 혼자 연 접 모터 신경 맨끝을에 지 방화의 분석을 제한 하는 데 사용 하는 관심의 영역을 만드는 사용 되었다.
취득된 photoconverted sptPALM 영화 분석 슈퍼 해결된 강도, 확산 계수, 생성 및 궤적 지도 (그림 3A). Syntaxin-1A-mEos2 이동성 개별 궤적 (그림 3B)의 제곱 변위 (MSD)의 분석에 의해 정량 추가 되었다. 통계 비교를 할 수 있는 엠 곡선 (그림 3B)에서 영역을 사용 하 여. 이동성의 추가 분석 Syntaxin-1A-mEos2의 확산 계수 분포 있고이 부동 인구 (그림 3C)을 모바일의 비교에서 통계적으로 계산 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> 그림 1 : MEos2 태그 구문을 생성. pFL44S-attB-MCS-w + 벡터 BamHI 및 XbaI 오는지. 겹치는 연쇄 반응 (PCR) 관심 (POI)의 단백질을 인코딩 조각 그리고 mEos2, 각각, 수 복제 될, 예를 들어 ura3- 효 모 세포에서 vivo에서 재결합 또는 깁슨 어셈블리. 참고 Syntaxin-1A-mEos2 transgene 생성, 우리는 구조 복제 어귀 생 Syntaxin-1A 발기인 및 종결자 시퀀스. 결과 구문 이후에 표현 관심 (POI)의 mEos2 융합 단백질 유전자 변형 플라이 라인을 만들 초파리 배아에 주입 수 있습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> 그림 2 : 초파리 유 충 해 부 및 간접 조명입니다. (A) 스키마 초파리 유 충 절 개 반 원통형 PDMS 기지에 실시를 보여주는. 모 깎기 애벌레에 열렸다는 PDMS의 minutien 핀을 사용 하 여 젤. (B-C) 유 충 PDMS 준비 슈나이더의 곤충 매체를 포함 하는 유리 바닥 문화 접시 안에 배치 했다. 약간 비스듬한 조명 구성에 TIRF 현미경 모터 신경 맨끝에서 Syntaxin-1A-mEos2를 시각화 하기 위해 사용 되었다. (D F) 해 부 초파리 애벌레는 반 원통형 PDMS 기지. 유 충은 팜 슈퍼 해상도 현미경에 몇 군데와 애벌레 PDMS 준비 슈나이더의 중간, 가득 이미징 접시에 배치 되었다. 스케일 바, 10 m m. (이 그림 수정 되었습니다14에서). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> 그림 3 : Vivo에서 Syntaxin-1A-mEos2 연 접 모터 신경 터미널에서 추적. (A) A 저해상도 TIRF의 이미지 Syntaxin-1A-mEos2 형식 1b 모터 신경 맨끝에. Photoconversion 영화 분석 33 Hz 생성 된 sptPALM 초 해결, 확산 계수, 강도와 궤적에서 지도 몇 군데. 5,309 개별 궤적 군데 이상의 16000 프레임 영화 수집 했다. 스케일 바, 3 μ m입니다. (B-C) Syntaxin-1A-mEos2의 제곱 변위 (MSD) 6 다른 모터 신경 맨끝;에서 플롯은 MSD 곡선 (AUC) 지역 이동성의 수준을 계량에 사용 되었다. 확산 계수 분포 보여;의 비율으로 양이 정해질 수 있는 모바일 및 부동 Syntaxin-1A 인구 모터 신경 터미널 당 ~ 2400 궤도의 평균 가져온 (n = 3 애벌레). 데이터의 평균 표준 오차로. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Drosophila presynaptic motor nerve terminal에서 생체 내 단일 분자 추적. 이 기술은 third-instar Drosophila 유충의 운동 신경 말단에서 단일 단백질을 in vivo에서 추적하고 이미지화할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 단백질을 in vitro 시스템에서 관찰된 것과 유사한 고해상도로 이미지화, 추적 및 국소화할 수 있다는 것입니다.형질전환 초파리의 디자인. 관심 시냅스 단백질에는 광전환성 형광단이 표시되어 있으며, 이는 Drosophila melanogaster에서 발현됩니다. third-instar Drosophila 유충의 해부.방황하는 세 번째 instar 유충을 원통형 또는 반원통형 실가드 베이스에 놓습니다. 40마이크로리터의 Schneider's Insect Medium을 유충에 추가합니다. 해부 현미경으로 유충의 머리에 미세한 핀을 꽂고 꼬리에 다른 핀을 꽂아 유충을 움직이지 못하게 합니다.접근을 용이하게 하려면 minutien 핀을 사용하여 유충 복부 부위의 등쪽 정중선을 좁게 절개합니다. 이 절개 지점에서 스프링 가위를 사용하여 몸벽을 따라 전방 후방 방향으로 자릅니다. 미세한 집게와 스프링 가위를 사용하여 유충에서 내부 장기를 제거하십시오.해부된 유충을 Schneider's Insect Medium으로 씻습니다. 두 개의 몸통 벽 플랩 각각에 두 개의 미세한 핀을 꽂아 육각형 모양의 절개 유충 준비물을 만듭니다. 스프링 가위를 사용하여 복부 신경삭에서 유충 뇌를 분리합니다.곡선 핀셋을 사용하여 미세 핀을 Sylgard 베이스에 밀어 넣습니다. 단일 입자 추적 광활성화 국소화 현미경 검사. 유충의 실가드 베이스를 실온 Schneider's Insect Medium 2밀리리터로 채워진 바닥 유리 배양 접시에 뒤집습니다.ELYRA PS.1 현미경의 63x 침수 대물렌즈에 물을 바르고 접시를 스테이지에 놓습니다. 투과광을 켜고 접안렌즈를 사용하여 10x 공중 대물렌즈의 도움으로 실가드 기지에 있는 유충을 찾습니다. 63x 수침 대물렌즈로 전환하고 명시야 조명을 사용하여 근육 6을 식별합니다.ZEN Black Acquisition Software를 사용하여 Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF, 구성을 선택합니다. 488나노미터 레이저를 전환하여 eMos2를 녹색으로 시각화합니다. 끈에 달린 구슬처럼 보이는 신경근 접합부를 찾아 저해상도 TIRF 이미지를 획득하고, 405나노미터 레이저와 561나노미터 레이저를 동시에 켜서 광변환을 하고 eMos2 적색 종을 이미지화합니다.405나노미터 레이저에 매우 낮은 레이저 출력을 활용하여 적당히 일정한 확률적 광변환을 허용합니다. 여기서 405나노미터 레이저는 0.09%로 작동되는 반면 561나노미터 레이저는 50%로 작동됩니다.소프트웨어의 TIRF 각도 옵션에서 TIRF 임계각을 약간 밀어냅니다. 노출 시간을 30밀리초로 설정합니다.신경근 접합부의 시계열 이미지를 획득합니다. 여기에서 15, 000 프레임 영화를 획득했습니다. 동영상을 czi 형식 파일로 저장합니다.데이터 분석. 적절한 단일 분자 추적 분석 소프트웨어로 획득한 필름을 분석합니다. 각 형광 단백질 국소화의 x 좌표와 y 좌표를 Intensity point spread 함수의 가우스 피팅으로 구합니다.각 지역화의 궤적을 추적하려면 각 지역화에 대해 최소 8개의 연속적인 서로 다른 프레임 모양이라는 임계값과 각 프레임 간의 최대 3픽셀 이동성을 설정합니다. 궤적 이미지, 평균 제곱 변위, 추적된 모든 국소화의 확산 계수를 얻습니다. 대표적인 결과.3개의 서로 다른 유충에서 여러 신경근 연접부에서 Syntaxin-1A-eMos2의 개별 궤적의 평균 제곱 변위를 평균 더하기 뺀 평균의 표준 오차로 표시했습니다. 평균 제곱 변위 곡선 아래의 영역도 표시되었습니다. Syntaxin-1A-mEos2의 확산 계수는 여러 신경근 접합부에서 유사하게 얻어졌으며 상대 주파수 분포의 히스토그램으로 표시되었습니다.확산 계수 임계값은 Syntaxin-1A의 두 집단, 즉 이동성 집단과 부동성 집단을 보여주었습니다. Syntaxin-1A-mEos2의 이동 대 부동성 개체군의 비율을 계산했습니다. 결론. 이 비디오는 초파리 유충의 신경근 접합부에서 단일 단백질 추적이 어떻게 수행될 수 있는지에 대한 이해를 제공해야 합니다.이 기술은 뉴런 통신 분야의 연구자들이 생체 내에서 고해상도로 단일 단백질의 이동성과 조직을 시각화하고 관찰할 수 있는 방법을 제공합니다.

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

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Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

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서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

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이 비디오는 초파리 유충의 신경근 접합부에 있는 시냅스 부톤의 시냅스 전류를 기록하는 기술을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 단일 시냅스 부톤의 활동을 모니터링할 수 있으며, 이는 자발적 또는 비동기적 시냅스 활동이 향상된 돌연변이 파리 계통 연구에 중요합니다.

Drosophila larval neuromuscular junction에서 시냅스 전류 기록

이 비디오에서 초파리 유충 신경 섬유는 세포막 지질에 결합하는 FM 염료에 잠겨 있습니다. 흡입 미세전극 및 전기 펄스는 세포내이입 과정을 자극하여 FM 염료를 새로 형성된 세포내포에 통합합니다. 신경 전달의 시냅스 전 단계를 시각화하는 이 방법은 시냅스 기능과 신경전달물질 방출을 연구하는 데 유용합니다.

Microelectrode-Mediated FM Dye loading and unloading in Drosophila 유충 신경 세포의 검출기

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

여기에서는 Drosophila 애벌레 뇌의 실시간 준비에서 매우 운동성 수지상 필로포디아를 이미지화하기 위해 사용한 방법과 수상돌기의 정량적 평가를 위해 시간 경과 3D 이미징 데이터 세트를 정량화하기 위해 개발한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 개발에 역학.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

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배우세요 Drosophila melanogaster 운동신경말단에서 PALM 기술을 이용한 단일분자 추적 방법을. Syntaxin-1A 단백질의 이동성과 국소화를 실시간으로 관찰하여 시냅스 단백질 역학을 연구할 수 있습니다.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

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