S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

이 절차의 전반적인 목표는 X선 결정학과 소각 X선 산란에 의한 하이브리드 구조 분석을 위해 정렬된 도메인과 무질서한 도메인의 혼합물로 구성된 재조합 단백질을 생산하는 것입니다. 이 방법은 모든 용액의 결정이 단백질의 구조를 유지하도록 생물학적 기능을 두는 것에 대한 구조 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 X선 결정학으로 해결할 수 없는 단백질 또는 거대 분자의 동적 영역을 모델링하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 처음에는 SAXS 데이터의 품질을 적절하게 평가하는 방법을 배우는 데 어려움을 겪을 것입니다. 절차를 시작하려면 Nsa1 발현 플라스미드를 적절한 E.coli 발현 균주로 변환합니다. 세포를 배양하고 Nsa1 발현을 유도하며 세포를 수확합니다.

25ml의 용해 완충액에 세포를 재현탁하고 섭씨 4도로 예냉각하고 EDTA-free 프로테아제 억제제 정제 1정을 포함합니다. 섭씨 4도에서 7분 동안 세포를 초음파 처리하되 2초 동안 켜고 2초 끄는 주기를 반복합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 45분 동안 26, 900배 중력에서 용해물을 원심분리하십시오.

원심분리 중에 혼합물이 얼지 않는지 확인하십시오. 다음으로, 10ml의 고정화된 코발트 친화성 수지를 포함하는 중력 흐름 컬럼을 용해 완충액으로 평형화합니다. 정화된 용해물을 컬럼에 로드하고 섭씨 4도에서 수지를 통해 흐르도록 합니다.

그런 다음 100ml 분량의 용해 버퍼로 수지를 두 번 세척합니다. 20ml의 용리 완충액으로 컬럼에서 Nsa1을 용리합니다. 단백질의 용출을 확인하기 위해 4-15% SDS-PAGE 겔에 eluere의 15mcl 분취액을 실행합니다.

그런 다음 1mg/ml TEV 프로테아제 원액 1ml를 용액에 첨가합니다. MBP 태그를 제거하기 위해 섭씨 4도에서 밤새 엘루에르를 배양합니다. 그런 다음 10킬로달톤 원심 필터 장치를 사용하여 MBP-절단된 Nsa1을 약 5ml로 농축하되 과도하게 농축하지 않도록 주의합니다.

Buffer A.로 사전 평형을 이룬 겔 여과 컬럼에서 농축된 단백질을 정제합니다. 이 절차의 중요한 단계 중 하나는 정제 중에 모든 응집체를 제거하는 것입니다. 응집체는 결정화 및 SAXS 데이터 수집 및 분석을 방해합니다. SDS-PAGE로 각 컬럼 분획에서 15mcl 샘플을 분석하여 Nsa1에서 MBP의 분리를 확인합니다.

Nsa1 함유 분수를 결합합니다. 10 킬로달톤 원심 여과기 장치를 사용하여 결합 된 분획을 약 8mg / ml로 농축합니다. 289나노미터에서 흡광도를 측정하고 단백질 농도를 계산합니다.

즉시 단백질 분해 스크리닝 및 결정화 시험을 진행하십시오. 단백질 분해 스크리닝을 시작하려면 알파-코모트립신, 트립신, 엘라스타아제, 카파인, 셉틸리신 및 내단백질분해효소 GluC의 1mg/ml 원액을 준비합니다. 희석 완충액으로 각 원액을 1:10, 1:100 및 1:1, 000으로 희석합니다.

완충기 A.Then를 가진 1mg/ml에 Nsa1의 8mg/ml 해결책을 묽게 하십시오, 각 프로테아제 희석을 위해, 프로테아제 희석의 1mcl를 묽게 된 단백질 주식의 9mcl와 결합하십시오. 용액을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 10mcl의 2x SDS-PAGE 샘플을 추가하여 각 용액에 버퍼링하고 용액을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.

4-15%SDS-PAGE 겔에 용액을 실행하여 프로테아제 내성 도메인을 식별합니다. 프로테아제 불안정 영역을 제외하는 truncated expression 구문을 만듭니다. 결정화 최적화를 위해 이러한 단백질을 발현하고 정제합니다.

다양한 농도에서 Nsa1 단백질에 대한 SAXS 데이터를 획득한 후 터미널 셸 파일 경로를 데이터가 포함된 디렉터리로 설정합니다. 그런 다음 해석 소프트웨어를 실행합니다. 산란 곡선을 해석 소프트웨어에 로드합니다.

자동 RG 도구를 사용하여 각 곡선에 대한 회전 반경과 전방 산란 강도를 결정합니다. 그런 다음 각 산란 곡선에 대한 Kratky 플롯을 생성하여 밀도 정도를 결정합니다. autonome 도구를 사용하여 회전 반지름의 3배의 시작 최대 치수를 사용하여 각 곡선에 대한 쌍별 분포 함수를 계산합니다.

최대 차원을 최적화하여 실험적 산란 곡선과 일치하는 부드러운 쌍별 분포 함수 곡선을 얻습니다. 농도 전반에 걸쳐 구조적 매개변수를 비교하여 방사선 손상 또는 농도 의존적 영향이 없는지 확인합니다. 집중 계열에 걸쳐 회전 반경, 분자량, 전방 산란 및 쌍 거리 분포 함수를 포함한 주요 구조적 매개변수를 비교하는 것이 중요합니다.

이는 방사선 손상이나 농도 영향이 없도록 하기 위한 것입니다. 다음으로, 시작 단백질 결정 구조 파일, 표적 단백질 염기서열 파일 및 실험적 SAXS 데이터 파일을 사용하여 앙상블 최적화 방법 유틸리티를 실행합니다. 시작 결정 구조 파일의 카이 제곱 값을 앙상블 파일과 비교하여 앙상블 모델이 실험 데이터에 잘 맞는지 여부를 확인합니다.

분자 시각화 소프트웨어를 사용하여 생성된 conformer와 결정 구조를 오버레이합니다. conformers의 총 수와 각 conformer에 대한 점유 비율이 산란 곡선에 기여하는 것을 주목하십시오. Nsa1의 프로테아제 불안정한 C 말단의 단백질 분해 절단은 사방정계 결정의 형성을 초래했습니다.

갓 정제된 Nsa1은 입방체 결정을 형성했지만 결정 구조는 여전히 불안정한 c 말단에 대한 전자 밀도가 부족했습니다. Nsa1의 n-말단 7 blated beta propeller WD-40 domain은 두 구조 모두에서 잘 분리되어 있었습니다. Nsa1 WD-40 영역만으로는 실험용 SAXS 데이터에 적합하지 않았습니다.

강체 모델링과 C 종단의 초기 재구성을 조합하여 적합도를 크게 향상시켰습니다. 앙상블 모델링은 적합도를 훨씬 더 크게 개선하여 용액 내 C-말단 꼬리의 확인 샘플링을 밝혔습니다. SAXS는 저해상도 구조 기술이지만 X선 결정학과 같은 고해상도 구조 연구를 매우 잘 보완합니다.

따라서 유연한 영역과 무질서한 영역을 모델링할 수 있습니다. 거대분자의 SAXS 데이터를 수집하고 분석함으로써 거대분자에서 발생한 확증적 변화를 이해하기 시작할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 X-ray 결정학과 SAXS를 통해 정렬된 영역과 무질서한 영역으로 구성된 단백질의 구조를 해결하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.