Name: S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 학습하세요 Nsa1 단백질의 구조화 및 비구조화 영역을 X-선 결정학과 SAXS를 결합하여 분석하는 하이브리드 구조 생물학 방법. 이 기법은 동적 영역 모델링에 필수적입니다.

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회절 데이터 동남 지역 공동 액세스 팀 (SER-고양이) 22-ID와 22-BM beamlines에서 고급 광자 소스 (AP), Argonne 국립 연구소에서 수집 했다. SAXS 데이터 SIBYLS beamline에 사전 빛 소스 (ALS), 로렌스 버클리 국립 연구소에 수집 되었다. 우리는 직원에 대 한 그들의 원격 데이터 수집 및 처리 SIBYLS beamline에 감사 하 고 싶습니다. 우리는 국립 연구소의 환경 건강 과학 (NIEHS) 질량 분석 연구 및 지원 그룹 단백질 도메인 경계를 결정 하는 도움을 위한 감사. 이 작품으로 미국 국립 연구소의 건강 교내 연구 프로그램; 지원 미국 국립 연구소의 환경 건강 과학 (NIEHS)의 (R. E. S. 지아 ES103247)와 건강 연구 (CIHR, M.C.P에 146626)의 캐나다 학회. AP의 사용을 지원 했다 미국 에너지 부, 과학의 사무실, 사무실의 기본적인 에너지 과학 계약 번호에서 W-31-109-잉글랜드-38. 사용 고급 라이트 소스 (ALS)의 감독, 과학의 사무실, 사무실의 기본적인 에너지 과학, 계약 번호에서 미국 에너지 부의에 의해 지원 되었다 드-AC02-05CH11231입니다. 추가 지원 SIBYLS SAXS beamline 건강의 국립 연구소에서 유래에 대 한 프로젝트 노스 (R01GM105404)와 하이 엔드 계측 그랜트 S10OD018483. 우리는 또한이 원고에의 그들의 중요 한 독서에 대 한 안드레아 달과 박사 새 라 안 드레를 감사 하 고 싶습니다.

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜을 사용 하 여, S. cerevisiae 에서 재조합 Nsa1 엑스레이 결정학 및 SAXS에 의해 구조 연구에 대 한 생성 되었습니다. Nsa1은 솔루션에서 품행 되었고 여러 크리스탈 형태로 결정. 이러한 결정의 최적화 하는 동안 Nsa1의 C-말단 효소 저하에 과민 했다 발견 했다. 높은 해상도, orthorhombic 크리스탈 형태로 수만 중복 될 가능성이 Nsa1의 C-터미널 잘림 변형 Nsa1의 유연한 C terminus 크리스탈 패킹을 방해 하기 때문에. Nsa1의 구조는 높은 해상도, 엑스레이 결정학에 의해 해결 되었다 하지만 C-말단 수 하지 빌드할 수 중 크리스탈 형태로 하지 지시 했다. 그러나 결정학으로 어떤 방법으로, 결정학 몇 가지 한계는 Nsa1의 크기 주위 고분자의 원자 해결책 구조를 결정 하기 위한 초연 기술입니다. 결정학의 주요 한계 중 단백질40,41의 무질서 영역을 ...

리보솜 큰 ribonucleoprotein 기계 모든 살아있는 세포에 있는 단백질으로 번역 하는 mRNA의 필수적인 역할을 수행 하는. 리보솜 속1,2,,34나 복잡 한 과정에서 생산 되는 2 개의 소 단위 리보솜 구성 됩니다. 진 핵 리보솜 어셈블리 필수 ribosomal 어셈블리 요소2,,35의 수백의 도움에 의존합니다. Nsa1 (Nop7 관련 1)6큰 ribosomal 소 단위 생산에는 진 핵 리보솜 어셈블리 요소 이며 WD-반복으로 알려진 74 (WDR74) 더 높은 유기 체7에 포함 된입니다. WDR74 쥐8에서 blastocyst 형성에 필요한 것을 보여줘 왔다 그리고 WDR74 발기인은 자주 암 세포9에 돌연변이. 그러나, 함수 및 리보솜 어셈블리에 Nsa1/WDR74의 정확한 메커니즘 여전히 크게 불명 하다. 진 핵 리보솜 성숙 하는 동안 Nsa1/WDR74의 역할을 밝히기 시작, 여러 구조 분석 x 선 결정학 및 작은 각 엑스레이 뿌리기 (SAXS)10를 포함 하 여 수행 했다.
엑스레이 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 전자 현미경, 고 SAXS 고분자 구조 공부를 위한 모든 중요 한 기술이 있습니다. 그러나 크기, 모양, 가용성, 및 구조 생물학 메서드는 특정 고분자 최고의 될 것입니다 적합 한 고분자 영향의 안정성, 지 고는 소위 "잡종" 접근 방식을 통해 여러 기술을 결합 한 점점 더 유익한 도구11. 특히 x 선 결정학 및 SAXS 고분자12의 구조 결정에 대 한 강력 하 고 상호 보완적인 방법이 있습니다.
결정학 고해상도 원자 구조 작은 분자에서 리보솜와 같은 큰 셀룰러 기계에 이르기까지 제공 하 고 단백질 등의 생물 학적 기능을 이해에서 수많은 혁신을 주도하 고 있다 고분자13. 또한, 구조 기반 약물 설계 약물 발견과 개발14에 중요 한 차원을 추가 하는 계산 방법으로 분자 도킹을 위한 크리스탈 구조의 힘을 하네스 랑. 그것의 광범위 한 적용에도 불구 하 고 유연 하 고 무질서 시스템은 결정학 크리스탈 패킹을 방해 수 있습니다 또는 전자 밀도 지도 완료 수 있습니다 이후 또는 품질의 평가에 도전. 반대로, SAXS 솔루션 기반 및 저해상도 구조적 접근 무질서 루프와 테르미니에서 본질적으로 무질서 단백질12,,1516에 이르기까지 유연한 시스템을 설명 하 수 이다. 그것은 광범위 한 입자 크기12와 호환을 고려, SAXS 작업할 수 있습니다 synergistically 결정학 구조 연구에 의해 해결 될 수 있는 생물 학적 질문의 범위를 확장.
Nsa1는 기능, 하지만 유연한 C-말단 엑스레이 결정학 방법을 의무가 아니다 뒤 체계적인된 WD40 도메인을 포함 하기 때문에 혼합 구조 방식을 위해 적당 하다. 다음은 복제, 표현, 그리고 하이브리드 구조 결정 엑스레이 결정학에 의해에 대 한 S. cerevisiae Nsa1 및 SAXS의 정화에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜 순서와 무질서 지역 조합 구성 하는 다른 단백질의 구조 연구에 적응 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Molecular Cloning of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 parallel vector</td><td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>N-terminal His-tag (pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiae genomic DNA</td><td>ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>Primers for cloning Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTTTGCTTCCC</td></tr><tr><td>strong</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) 스타 셀</td>의 <td>재조합</td> 단백질 생산 및 정제 pMBP-C601003 <td></td><td></td></tr><tr><td>NSA1 및 다양한 절단</td><td>Lo et al., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selenomethionine</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, 디옥산 프리</td><td>Promega</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마-알드리치</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Caledon 실험실 화학 물질</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>트리스 버퍼, 1M pH7.5</td><td>KD 의료</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>인비트로젠</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M 이미다졸, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>탈론 친화 수지</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL 원심 필터(MWCO 10K)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel 여과 칼럼</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>TEV Protease</td><td>Prepared by NIEHS Protein Expression Core</td><td>Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization, Proteolytic Screening</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 스크린</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>Salt Rx</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>인덱스 스크린</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>PEG/이온 스크린</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>분자 치수</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Precipitant Synergy</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>3inch 와이드 크리스탈 클리어 씰링 테이프</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Proti-Ace Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>분자 치수</td><td>MD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>분자 치수</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/수산화나트륨 pH 7.5</td><td>분자 치수</td><td>MD2-011-</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 삼염기성</td><td>분자 치수</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22mm x 0.22mm 실리콘화 커버슬라이드</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>실런트가 있는 24웰 플레이트(VDX 플레이트 실란트)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM)</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Seed Bead Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Crystal Caps</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Cryo Wand</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>극저온 폼 듀어</td><td>햄튼 리서치</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 퍽 시스템</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>풀 스커트 96웰 클리어 플레이트</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>AxyMat 씰링 매트</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Lite 분광 광도계</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>모기 로봇</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/Websites</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HKL2000</td><td>Otwinoski and Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Phoenix</td><td>Adams et al., 2010</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Coot</td><td>Emsley et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr> <tr><td>Scatter</td><td>Rambo and Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System, 버전 1.8 Schr&ouml; 딩거, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov and Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun et al, 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al, 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria et al, 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

s. cerevisiae 에서 nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

리보솜 어셈블리 요소 Nsa1 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 에서 전체 길이 구조 결정은 무질서 때문에 도전 이다 고 정한 효소 단백질의 C-터미널. 이 원고는 엑스레이 결정학 및 SAXS에 의해 구조 분석에 대 한 S. cerevisiae 에서 재조합 Nsa1 정화 방법을 설명 합니다. X 선 결정학은 Nsa1의 정돈된 N 맨끝 WD40 도메인의 구조를 해결 하기 위해 활용 하 고 있다 그리고 SAXS 솔루션에서 Nsa1의 C-말단의 구조를 해결 하기 위해 사용 되었다. 솔루션 분산 데이터 솔루션에서 전체 길이 Nsa1에서 수집 되었다. 이론적인 산란 진폭 WD40 도메인의 고해상도 결정 구조에서 계산 그리고 경직 된 몸과 ab initio 모델링의 조합 Nsa1의 C-터미널. 이 하이브리드 접근 방식을 통해 전체 단백질의 제 사기 구조 개축 되었다. 여기에 제시 된 방법의 구조화 및 구조화 되지 않은 도메인의 혼합으로 구성 된 다른 단백질의 하이브리드 구조 결정에 대 한 일반적으로 적용 해야 합니다.

Nsa1 PCR S. cerevisiae genomic DNA에서 증폭 하 고 MBP와 TEV 프로 테아 제 사이트는 N 맨끝 6 x-히스티딘 선호도 태그를 포함 하는 벡터에 subcloned 이었다. Nsa1 대장균 BL21(DE3) 세포로 변형 되었다 고 단백질 식의 높은 수율 IPTG로 유도 및 25 ° C에서 하룻밤 (그림 1A) 성장을 가져온. Nsa1 고정된 코발트 선호도 수 지, TEV protease와 MBP 분열에 의해 그리고 마침내 크기 배제 크로마토그래피 (그림 1B)에 의해 해결에 친 화력 정화 했다. Nsa1를 포함 하는 크기 배제 크로마토그래피에서 분수 풀링, 8 mg/mL에 집중 되었고 결정 화 로봇 결정 화 실험에 대 한 사용. 초기 스파스 매트릭스 크리스탈 스크린의 2 개의 다른 크리스탈 모양 Nsa1,...

이 방법은 엑스레이 결정학 및 소 각 x 선 산란 (SAXS), 복제, 표현, 및 구조 결심을 위한 재조합 Nsa1의 정화를 설명 하 고 다른 단백질의 하이브리드 구조 분석에 대 한 적용 둘 다를 포함 하는 주문 하 고 도메인을 난잡.

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

이 절차의 전반적인 목표는 X선 결정학과 소각 X선 산란에 의한 하이브리드 구조 분석을 위해 정렬된 도메인과 무질서한 도메인의 혼합물로 구성된 재조합 단백질을 생산하는 것입니다. 이 방법은 모든 용액의 결정이 단백질의 구조를 유지하도록 생물학적 기능을 두는 것에 대한 구조 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 X선 결정학으로 해결할 수 없는 단백질 또는 거대 분자의 동적 영역을 모델링하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 처음에는 SAXS 데이터의 품질을 적절하게 평가하는 방법을 배우는 데 어려움을 겪을 것입니다. 절차를 시작하려면 Nsa1 발현 플라스미드를 적절한 E.coli 발현 균주로 변환합니다. 세포를 배양하고 Nsa1 발현을 유도하며 세포를 수확합니다.25ml의 용해 완충액에 세포를 재현탁하고 섭씨 4도로 예냉각하고 EDTA-free 프로테아제 억제제 정제 1정을 포함합니다. 섭씨 4도에서 7분 동안 세포를 초음파 처리하되 2초 동안 켜고 2초 끄는 주기를 반복합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 45분 동안 26, 900배 중력에서 용해물을 원심분리하십시오.원심분리 중에 혼합물이 얼지 않는지 확인하십시오. 다음으로, 10ml의 고정화된 코발트 친화성 수지를 포함하는 중력 흐름 컬럼을 용해 완충액으로 평형화합니다. 정화된 용해물을 컬럼에 로드하고 섭씨 4도에서 수지를 통해 흐르도록 합니다.그런 다음 100ml 분량의 용해 버퍼로 수지를 두 번 세척합니다. 20ml의 용리 완충액으로 컬럼에서 Nsa1을 용리합니다. 단백질의 용출을 확인하기 위해 4-15% SDS-PAGE 겔에 eluere의 15mcl 분취액을 실행합니다.그런 다음 1mg/ml TEV 프로테아제 원액 1ml를 용액에 첨가합니다. MBP 태그를 제거하기 위해 섭씨 4도에서 밤새 엘루에르를 배양합니다. 그런 다음 10킬로달톤 원심 필터 장치를 사용하여 MBP-절단된 Nsa1을 약 5ml로 농축하되 과도하게 농축하지 않도록 주의합니다.Buffer A.로 사전 평형을 이룬 겔 여과 컬럼에서 농축된 단백질을 정제합니다. 이 절차의 중요한 단계 중 하나는 정제 중에 모든 응집체를 제거하는 것입니다. 응집체는 결정화 및 SAXS 데이터 수집 및 분석을 방해합니다. SDS-PAGE로 각 컬럼 분획에서 15mcl 샘플을 분석하여 Nsa1에서 MBP의 분리를 확인합니다.Nsa1 함유 분수를 결합합니다. 10 킬로달톤 원심 여과기 장치를 사용하여 결합 된 분획을 약 8mg / ml로 농축합니다. 289나노미터에서 흡광도를 측정하고 단백질 농도를 계산합니다.즉시 단백질 분해 스크리닝 및 결정화 시험을 진행하십시오. 단백질 분해 스크리닝을 시작하려면 알파-코모트립신, 트립신, 엘라스타아제, 카파인, 셉틸리신 및 내단백질분해효소 GluC의 1mg/ml 원액을 준비합니다. 희석 완충액으로 각 원액을 1:10, 1:100 및 1:1, 000으로 희석합니다.완충기 A.Then를 가진 1mg/ml에 Nsa1의 8mg/ml 해결책을 묽게 하십시오, 각 프로테아제 희석을 위해, 프로테아제 희석의 1mcl를 묽게 된 단백질 주식의 9mcl와 결합하십시오. 용액을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 10mcl의 2x SDS-PAGE 샘플을 추가하여 각 용액에 버퍼링하고 용액을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.4-15%SDS-PAGE 겔에 용액을 실행하여 프로테아제 내성 도메인을 식별합니다. 프로테아제 불안정 영역을 제외하는 truncated expression 구문을 만듭니다. 결정화 최적화를 위해 이러한 단백질을 발현하고 정제합니다.다양한 농도에서 Nsa1 단백질에 대한 SAXS 데이터를 획득한 후 터미널 셸 파일 경로를 데이터가 포함된 디렉터리로 설정합니다. 그런 다음 해석 소프트웨어를 실행합니다. 산란 곡선을 해석 소프트웨어에 로드합니다.자동 RG 도구를 사용하여 각 곡선에 대한 회전 반경과 전방 산란 강도를 결정합니다. 그런 다음 각 산란 곡선에 대한 Kratky 플롯을 생성하여 밀도 정도를 결정합니다. autonome 도구를 사용하여 회전 반지름의 3배의 시작 최대 치수를 사용하여 각 곡선에 대한 쌍별 분포 함수를 계산합니다.최대 차원을 최적화하여 실험적 산란 곡선과 일치하는 부드러운 쌍별 분포 함수 곡선을 얻습니다. 농도 전반에 걸쳐 구조적 매개변수를 비교하여 방사선 손상 또는 농도 의존적 영향이 없는지 확인합니다. 집중 계열에 걸쳐 회전 반경, 분자량, 전방 산란 및 쌍 거리 분포 함수를 포함한 주요 구조적 매개변수를 비교하는 것이 중요합니다.이는 방사선 손상이나 농도 영향이 없도록 하기 위한 것입니다. 다음으로, 시작 단백질 결정 구조 파일, 표적 단백질 염기서열 파일 및 실험적 SAXS 데이터 파일을 사용하여 앙상블 최적화 방법 유틸리티를 실행합니다. 시작 결정 구조 파일의 카이 제곱 값을 앙상블 파일과 비교하여 앙상블 모델이 실험 데이터에 잘 맞는지 여부를 확인합니다.분자 시각화 소프트웨어를 사용하여 생성된 conformer와 결정 구조를 오버레이합니다. conformers의 총 수와 각 conformer에 대한 점유 비율이 산란 곡선에 기여하는 것을 주목하십시오. Nsa1의 프로테아제 불안정한 C 말단의 단백질 분해 절단은 사방정계 결정의 형성을 초래했습니다.갓 정제된 Nsa1은 입방체 결정을 형성했지만 결정 구조는 여전히 불안정한 c 말단에 대한 전자 밀도가 부족했습니다. Nsa1의 n-말단 7 blated beta propeller WD-40 domain은 두 구조 모두에서 잘 분리되어 있었습니다. Nsa1 WD-40 영역만으로는 실험용 SAXS 데이터에 적합하지 않았습니다.강체 모델링과 C 종단의 초기 재구성을 조합하여 적합도를 크게 향상시켰습니다. 앙상블 모델링은 적합도를 훨씬 더 크게 개선하여 용액 내 C-말단 꼬리의 확인 샘플링을 밝혔습니다. SAXS는 저해상도 구조 기술이지만 X선 결정학과 같은 고해상도 구조 연구를 매우 잘 보완합니다.따라서 유연한 영역과 무질서한 영역을 모델링할 수 있습니다. 거대분자의 SAXS 데이터를 수집하고 분석함으로써 거대분자에서 발생한 확증적 변화를 이해하기 시작할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 X-ray 결정학과 SAXS를 통해 정렬된 영역과 무질서한 영역으로 구성된 단백질의 구조를 해결하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

구 균 에서 탄수화물 기질 의무적인 단백질의 광범위 한 생 화 학적 및 구조 특성화를 수행 하기 위한 효율적인된 프로토콜 제공 됩니다.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

이 프로토콜은 자세하게에서 조작 상 온에서 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 미세 장치를 작동 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 그것은 동적 산란에 의해 단백질 결정 화를 모니터링 하는 방법 설명 하 고 처리 하 고 분석 하는 방법을 얻은 회절 데이터.

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

이 프로토콜에는 저해상도 ab initio 모델 및 대비 세제의 일치와 작은 각 중성자 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 세제 solubilized 막 단백질의 구조 정보를 가져오는 방법을 보여 줍니다.

막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

여기, 우리는 어떻게 작은 각 엑스레이 뿌리기 (SAXS) 고분자 구조를 나타내는 저해상도 봉투에 대 한 정보를 활용할 수 있습니다 제시. 고해상도 구조 기술 엑스레이 결정학, 핵 자기 공명 등와 함께에서 사용 될 때 SAXS 다중 도메인 단백질 및 고분자 복합물 솔루션에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

우리는 후속 구조 결정, 형광 단백질 리안의 많은 작은 결정에서 수집 부분 회절 데이터 세트의 구성에 사용 하기 위해 완전 한 회절 데이터 세트를 얻기 위해 MeshAndCollect 프로토콜의 사용을 제시.

MeshAndCollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션

이 프로토콜은 구조 수준에서 M42 아미노펩티다아제인 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 연구하기 위해 개발되었다. 단백질 정제에서 X선 데이터 처리에 이르기까지 간단한 파이프라인입니다. 결정발생, 데이터 세트 인덱싱 및 분자 교체는 연구의 경우, TmPep1050H60A H307A 변이체를 통해 강조되었다.

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

생물학적 거대 분자의 SEC-BioSAXS 측정은 거대 분자와 그 복합체의 용액 구조를 결정하기위한 표준 접근 방식입니다. 여기에서 는 SEC-BioSAXS 데이터를 두 가지 유형의 SEC 추적(완전히 해결되고 부분적으로 해결된 피크)의 크로마토그램에서 분석합니다. 우리는 분산 및 BioXTAS RAW를 사용하여 분석 및 deconvolution을 시연합니다.

EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

중성자 단백질 결정학은 수소 원자의 국소화화를 허용하여 단백질 기능의 중요한 기계학적 세부 사항을 제공하는 구조 기술입니다. 우리는 여기에 단백질 결정, 중성자 회절 데이터 수집, 구조 미세 조정 및 중성자 산란 길이 밀도 지도의 분석을 장착하기위한 워크플로우를 제시한다.

단백질 구조에서 수소 원자 모델링을 위한 중성자 결정학 데이터 수집 및 처리

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

학습하세요 Nsa1 단백질의 구조화 및 비구조화 영역을 X-선 결정학과 SAXS를 결합하여 분석하는 하이브리드 구조 생물학 방법. 이 기법은 동적 영역 모델링에 필수적입니다.

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

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