단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

이 프로토콜의 전반적인 목표는 현장 마이크로샘플링 모세관 전기영동 질량 분석법을 통해 발달 중인 배아의 살아있는 세포에서 대사 산물을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 발달 중인 배아에서 직접 단일 세포의 대사를 분석할 수 있기 때문에 세포 및 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 다양한 세포 크기로 확장할 수 있으며 살아있는 배아에서 개별 세포의 최소 침습적 샘플링이 가능하다는 것입니다.

배아가 상대적으로 빠르게 발달하고 맞춤형 모세관 전기영동 전기분무 이온화 기기가 사용되기 때문에 일부 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 하나의 1X Steinberg 용액에 2%아가로스를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 여전히 액체인 상태에서 60mm 페트리 접시의 바닥에 용액을 코팅합니다.

아가로스 젤이 냉각되고 응고되면 공 모양이 될 때까지 6인치 파스퇴르 피펫의 끝 부분을 불태웁니다. 그런 다음 가열된 끝을 가볍게 터치하여 아가로스에 약 1mm 깊이의 5-10개의 웰을 각인합니다. 테이퍼 팁 마이크로피펫을 제작하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 있는 설정을 사용하여 Flaming/Brown 유형 모세관 풀러에서 붕규산 모세관을 당깁니다.

다음으로, 한 쌍의 미세하고 날카로운 집게를 사용하여 당겨진 마이크로피펫의 끝을 끊어 약 20미크론의 모세관 팁 외경을 얻습니다. 정밀도와 재현성을 돕기 위해 실체 현미경에서 이 단계를 수행하십시오. 성체 xenopus laevis의 성선 자극 호르몬 유도 자연 교미를 통해 또는 텍스트 프로토콜에 언급된 체외 수정을 통해 배아를 얻습니다.

배아가 2세포 단계로 쪼개지기 시작할 때 먼저 배아를 젤리 제거 용액에 2분 동안 그대로 두어 배아를 둘러싼 젤리 코트를 제거합니다. 그런 다음 배아가 채취 접시 표면에 달라붙지 않도록 2분 더 부드럽게 휘젓습니다. 접시 내용물을 깨끗한 비커에 부드럽게 붓고 비커에서 젤리 제거 용액을 빠르게 디캔팅합니다.

즉시 계란을 0.1X Steinberg의 용액으로 덮고 남은 젤리 제거 용액을 헹굽니다. 부드럽게 소용돌이친 다음 용액을 디캔팅합니다. 이 단계를 4회 반복하여 배아를 철저히 씻습니다.

젤리가 제거된 배아를 페트리 접시에 담긴 1X Steinberg의 용액으로 옮깁니다. 접시 안의 혼잡을 최소화하려면 100mm 접시당 약 100개의 배아를 놓습니다. 2세포 단계에서 절단 배아를 별도의 접시로 분류하고, 이 접시에는 정형화된 색소 침착화가 황산염 지도를 확립하기 위해 참조하여 등쪽 배쪽 접근을 자신 있게 표시합니다.

시상면(midsagittal plane)을 표시하는 첫 번째 분열 고랑(cleavage furrow)이 짙은 색소의 동물 당김(animal pull)과 옅은 색소의 동물 당김(animal pull)을 양분하여 두 반쪽이 거울 이미지(mirror image)가 되도록 하여 올바르게 절단된 배아를 식별합니다. 다음으로, 제작된 마이크로피펫을 다축 마이크로매니퓰레이터에 장착합니다. 마이크로피펫을 마이크로인젝터에 연결합니다.

플라스틱 전달 피펫을 사용하여 8개 세포 배아 중 약 5개를 흡인하고 0.5X Steinberg 용액이 들어 있는 샘플링 플레이트로 전달합니다. 헤어 루프를 사용하여 샘플링할 배아를 개별 웰에 배치하고 올바르게 식별된 관심 세포가 대략 90도 각도로 마이크로프로브를 향하고 있는지 확인합니다. 실체 현미경 아래에서 작업하는 동안 마이크로피펫의 끝을 살아있는 배아 내에서 식별된 단일 세포로 안내합니다.

마이크로인젝터를 사용하여 미세모세관에 음압 펄스를 가하여 세포 내용물의 원하는 부분을 빼냅니다. 세포에서 마이크로프로브를 부드럽게 집어넣고 그 팁을 마이크로 크기의 바이알에 냉각된 4마이크로리터의 대사 산물 추출 용매로 옮깁니다. 다음으로, 마이크로인젝터를 사용하여 모세관에 1초 동안 양의 80psi의 압력 서지를 가하여 흡입물을 용매로 배출합니다.

증발을 방지하기 위해 바이알을 단단히 닫고 샘플링이 완료될 때까지 바이알을 얼음 위에 다시 놓습니다. 샘플링이 완료되면 약 1분 동안 마이크로 원심분리기 바이알이 포함된 샘플을 와류로 혼합하여 대사 산물의 추출을 촉진합니다. 그런 다음, 바이알을 섭씨 4도에서 5분 동안 8, 000회 g으로 원심분리하여 세포 파편 및 기타 미립자를 펠릿화합니다.

세포 추출물을 세포 파편과 함께 저장하고 CE-ESI-MS로 측정할 때까지 하루 동안 섭씨 영하 20도에서 또는 섭씨 영하 80도에서 최대 1개월 동안 침전시킵니다. 텍스트 프로토콜에서 참조된 대로 배경 전해질 바이알과 샘플 로딩 미생물을 보유하는 스테이지의 신속한 수직 변환이 가능한 CE 주입 플랫폼을 구축합니다. 먼저 전기 분무 금속 이미터를 3포트 T-union에 장착하여 CE-ESI 인터페이스를 조립합니다.

그런 다음 전기 분무 이미터를 통해 분리 CE 모세관을 공급하여 이미터의 팁 너머로 약 40-100미크론 돌출되도록 합니다. 정확성을 돕기 위해 실체 현미경 아래에서 작업하십시오. 시트 용액 모세관을 나머지 포트에 연결하여 전기 분무 용액을 공급합니다.

CE-ESI 인터페이스의 누출 없는 작동을 위해 적절한 슬리브와 손가락으로 조이는 연결을 사용하십시오. 플레이트 홀더를 사용하여 CE-ESI 인터페이스를 3축 변환 스테이지에 장착하고 전기 분무 이미터 팁을 질량 분석기 오리피스에서 약 2mm 떨어진 곳에 배치합니다. 계면의 구성 요소를 청소하려면 먼저 분당 1마이크로리터의 전기 분무 이미터를 통해 전기 분무 시트 용액을 공급하고 CE 분리 모세관을 통해 BGE를 공급합니다.

주사기 펌프를 사용하여 일정한 속도로 용매를 공급합니다. 그런 다음 주사기를 모세관 입구 끝에 연결하여 각 측정 전에 CE 분리 모세관을 세척합니다. 대형 주사기를 효율적으로 사용하여 용매 공급 라인의 재충진 및 프라이밍을 최소화합니다.

약 5분 동안 분리 모세관을 헹군 후 주입구를 스테인리스 스틸 바이알에 있는 BGE 용액으로 옮깁니다. 전기 분무 이미터 팁을 질량 분석기 오리피스에서 약 2mm 떨어진 곳에 배치합니다. 변환 스테이지를 사용하여 이 거리를 미세 조정하여 안정적인 콘 제트 영역에서 전기 스프레이를 생성하는 동시에 실체 현미경을 사용하여 스프레이를 모니터링합니다.

안정적인 작동을 보장하기 위해 약 30-45분 동안 총 이온 전류 또는 TIC의 안정성을 모니터링합니다. 약 15초에 걸쳐 전위를 점차적으로 증가시켜 BGE 바이알에 21 플러스 또는 마이너스 2kW를 적용하며, 일반적으로 1%%의 포름산을 BGE로 사용하여 분리 모세관을 통해 약 7.5마이크로암페어의 전류를 생성합니다. 각 측정 전에 약 5분에서 10분 동안 TIC 프로파일을 모니터링하여 시스템 안정성을 보장한 다음 분리 전위를 단계적으로 0볼트로 낮춥니다.

1마이크로리터의 아세틸 냉각 표준 용액을 주입 바이알에 피펫팅하고 BGE 바이알의 분리 모세관을 주입 바이알로 옮깁니다. CE 주입 단계를 1 초에 15cm 들어 올립니다. 60초 후, 유체역학적으로 6나노리터의 시료를 분리 모세관에 주입합니다.

그런 다음 스테이지를 다시 시작 수준으로 변환하고 모세관 입구 끝을 BGE로 부드럽게 이동합니다. 그 직후 CE 전압을 높여 전기영동 분리 및 EMA 상태 획득을 시작합니다. 표준물질이 검출되면 데이터 수집을 중지하고 분리 전압을 단계적으로 0볼트로 낮춥니다.

그런 다음 오리피스에서 2cm 떨어진 곳까지 이미터를 검색합니다. 세포 추출물을 분석하기 전에 분리 모세관을 5분 동안 세척합니다. 10나노리터의 단일 세포 추출물을 측정하려면 90초 동안 유체역학적으로 샘플을 주입하는 동안 이 단계를 반복합니다.

세포 추출물의 대표적인 electropherogram이 여기에 나와 있으며, 여기에는 일련의 식별된 대사 산물의 분리가 표시됩니다. 70개의 서로 다른 신호가 표준 또는 탠덤 질량 스펙트럼 라이브러리의 신호와 비교하여 세포 추출물 신호의 이동 시간 및 MS/MS 단편화 패턴을 기반으로 작은 극성 대사 산물로 높은 신뢰도로 식별되었습니다. 대사산물 식별은 시료에서 알 수 없는 신호의 정확한 질량, 이동 시간 및 단편화 거동을 대사산물 표준 또는 대사산물 데이터베이스에서 사용할 수 있는 데이터와 비교하여 수행됩니다.

이 단계는 히스티딘에 대해 입증되었습니다. 여기에서 마이크로프로브 CE-ESI-MS를 사용하여 식별하고 샘플링한 개별 등쪽 세포는 8세포, 16세포 및 32세포 배아 단계에서 표시됩니다. 세 가지 다른 세포 유형에서 식별된 대사 산물에 대한 다품종 분석을 통해 세포 단계 전반에 걸쳐 서로 다른 대사 프로필과 복잡한 대사 경향을 밝혀냈습니다.

정량적 메타데이터의 주성분 분석은 8개 세포 배아의 확인된 전구 세포가 분열하여 16세포 및 32세포 배아에서 세포 클론을 형성함에 따른 대사 변화를 밝혀냈습니다. 선별된 대사산물에 대한 대표적인 경향이 표시됩니다. 아세틸콜린(acetylcholine)과 같은 대사산물은 세포 분열에 따라 풍부하게 감소한 반면, 트롤아민(trolamine)과 세린/아르기닌(serine/arginine)은 이러한 세포 유형에서 상반된 경향을 보였습니다.

일단 숙달되면 이 기술은 일반적으로 각 세포에 대해 10초 이내에 매우 빠르게 수행할 수 있습니다. 우리는 초기 xenopus laevis 배아에서 대사 세포 이질성을 매핑하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 마이크로프로브 모세관 전기영동-질량 분석법을 사용하여 단일 배아 세포의 대사 산물을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안, 대사체는 동적이고 세포는 발달 중인 배아에서 빠르게 분열하므로 빠르게 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 분석 세부 사항을 검사하여 세포 대사에 대한 높은 정성적 충실도의 데이터가 수집되었는지 확인합니다. 이 기술의 의미는 당사의 마이크로프로브 질량 분석 접근 방식이 빠르게 작동하고 최소 침습적이며 작은 샘플과 호환되기 때문에 살아있는 표본의 진단으로 확장됩니다.

이 절차에 따라 조직 사양에 대한 대사 산물의 영향과 같은 추가 질문에 답하기 위해 황산염 추적과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 고전압 전원 공급 장치로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 전기 절연 전기 인터페이스와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.