Name: Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 Cryptococcus neoformans의 다당류 캡슐과 세포체 크기를 자동 측정하는 이미지 처리 알고리즘을 사용하는 방법입니다. 이 기술은 대량 샘플 분석을 통해 병원성 연구의 효율성과 정확성을 높입니다.

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우리는 누구의 슬라이드 두 번째 인간의 측면-의해-측면 비교로 서 사용 된 안토니 보 웬 사 브리 나 놀란 그 슬라이드 3 인간의 측면-의해-측면 및 두 번째 현미경 비교로 사용 했다 인정 하 고 싶습니다.

1입니다. 인도 잉크 슬라이드의 준비
<ol><li>슬라이드에 cryptococcal 샘플의 10 µ L 플라스틱 모든 원형 효 모 스트레인 작동 하지만이 실험에 대 한 H99 사용 유일한 스트레인. 참고: 샘플 문화 미디어에서 직접 경우 PBS 또는 물과 1:2 희석 방지할 수 있습니다 인도 잉크 clumping에서.</li>
	<li>샘플에 인도 잉크 얼룩의 2 µ L 플라스틱 하 고 물리적으로 샘플을 피 펫 팁을 밀고 하 인도 잉크 균등 하 게 분산 때까지 원운동에서 이동 하 여 혼합.</li>
	<li>배치 하는 coverslip 샘플 다음 부드럽게 그리고 균일 하 게 낮추는 coverslip의 반대편 샘플 슬라이드의 표면에 대해 coverslip의 왼쪽된 가장자리를 눌러.</li>
	<li>5 분 동안 건조 공기를 허용 합니다.</li>
	<li>부드럽게 하는 물개를 형성 하 고 인도 잉크 얼룩 보존 coverslip 국경 매니큐어의 가벼운 레이어를 적용.</li>
</ol>2. 이미지 슬라이드
<ol><li>카메라 부착 및 알려진된 픽셀 미크론 변환 밝은 분야 현미경에 슬라이드를 배치 합니다. 셀 캡슐은 명확 하 고 셀 몸은 초점, 어두운 밴드 필터, 목표, 및 대비를 조정 합니다. 참고: 다양 한 필터, 목표, 및 대비 설정을 작동 하지만 목표, Ph1 필터, 2 x 2 비 닝 x 20는 것이 좋습니다.</li>
	<li>보기의 필드는 하지만 하지 cryptococcal 세포로, 세포 캡슐과 배경, 사이 명확한 대조와 overpopulated 조밀 하 고 어두운 밴드 시각 셀 시체와 함께 제대로 초점을 확인 합니다. 참고: 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수는 샘플 및 사용 목적에 따라 달라 집니다. 셀 클러스터 또는 중복 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 측면은, 셀 초점 비행기 크게 다양 하지 않습니다 그리고 그 중요 한 인도 잉크 얼룩 배경 (필드의 적어도 25%)에서 명확 하 게 볼 수 있습니다.</li>
	<li>으로 측정 알고리즘 단일 디렉토리에 이미지에서 실행 되 고 출력 데이터는 이미지 파일의 이름에 따라 구성 됩니다 분명 제목, 단일 디렉터리에 이미지를 저장 합니다.</li>
</ol>3. 알고리즘 설정
<ol><li>Python 버전 2.7을 설치</li>
	<li>"핍 설치 베개" 명령을 실행 하 여 추가 파이썬 라이브러리를 설치 하 고 "핍 설치 openpyxl".</li>
	<li>MATLAB에서 지침에 따라 설치</li>
	<li>빌드 https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html에서 제공 하는 지침에 따라 MATLAB 파이썬 라이브러리.</li>
	<li>이 원고 보충 자료 ("QCA.py", "Analysis2.m", 및 "TestRun.m")에 포함 된 세 가지 필요한 파일을 다운로드 합니다. 참고:이 파일은 어떤 위치에 추출 될 수 있다 하지만 모든 3 동일한 디렉터리에 있어야 합니다.</li>
</ol>4입니다. 알고리즘의 사용
<ol><li>QCA.py를 두 번 클릭 하 여 응용 프로그램을 실행 합니다. 참고: 응용 프로그램 시작 하려면 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. "QCA.py" 파일 ".m" 파일 실제 알고리즘 실행을 호출 하는 프로그램 구조를 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>프로그램에 설명 된 단계를 따릅니다.<ol>
<li>이미지 파일의 확장 형식 앞에 마침표와 세미콜론으로 구분 된 입력 (예. ". TIF;입니다. jpeg") 다음 클릭 버튼을 입력 합니다.</li>
		<li>디렉터리 선택 단추를 클릭 하 고 이미지를 포함 하는 폴더를 선택 하 여 이미지 파일이 있는 디렉터리를 선택 하십시오.</li>
		<li>이미지 목록 생성 버튼을 클릭 하 여 디렉터리에서 이미지 파일의 목록을 생성 합니다. 이미지는 오른쪽에 텍스트 상자에 나열 됩니다. 검토 하 고 목록을 정확 하 고 완전 한 확인 하십시오.</li>
		<li>무작위 이미지 선택 버튼을 클릭 하 여 미리 보기를 사용 하 고 목록에서 임의의 이미지를 선택 합니다. 참고: 이미지를 "잘못 된 이미지 모드 오류" 열 수 없는 경우 알고리즘은 여전히 제대로 작동 하지 이미지를 표시 하는도 불구 하. 4.2.7 단계 후 테스트 이미지는 여전히 표시 됩니다.</li>
		<li>현미경 목적과 binning 설정을 입력 합니다. 기본 설정이 일치 하지 않는 경우 사용 하는 현미경 "사용자 정의 픽셀 변환"을 선택 하 고 이미지 파일에 대 한 픽셀을 음 변환 입력. 일단 선택, 계산 변환 버튼을 클릭 하 고 오른쪽에 텍스트 상자에 올바른 변환을 확인 하십시오. 참고: 그림 1 에 표시 된 대표 이미지 확대와 2 x 2 비 닝 선택 x 40로 계산 했다.</li>
		<li>서클 검색 알고리즘 매개 변수를 입력 합니다.<ol>
<li>Min과 Max 캡슐 반경 항목으로 외부 캡슐 탐지에 대 한 감지 최소 및 최대 반지름을 입력 합니다. 작은 범위에는 더 정확한 결과 얻을 수 있게 됩니다.</li>
			<li>최소 및 최대 셀 바디 반경 항목으로 세포 체 감지 감지 최소 및 최대 반지름을 입력 합니다. 참고: 이러한 항목의 모든 4 소스 이미지에 따라 그들의 각각 값을 픽셀 단위로 표현 하는 숫자 이어야 합니다.</li>
			<li>알고리즘의 감도 임계값 조정 캡슐 및 셀 바디 감도 슬라이더를 이동 합니다. 낮은 감도 엄격한 될 것입니다 고 거짓 긍정적인 원 탐지 줄어들지만 적은 진짜 서클을 검색할 수 있습니다. 반대로, 높은 감도 검색 속도 증가 하지만 거짓 긍정적인 원형에서 또한 발생할 수 있습니다. 참고: 대표적인 결과 최소 캡슐 반경 7, 45의 최대 캡슐 반지름, 최소 몸 반경 4, 30의 최대 몸 반지름, 87, 캡슐 감도 및 87의 바디 감도 얻은 했다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>테스트 실행 버튼을 클릭 하 여 무작위로 선택 된 이미지에 매개 변수를 테스트 합니다. 결과 원본 이미지를 대체 하는 프로그램의 위 중심에 표시 됩니다. 결과 정확한 경우에, 또한 선택 된 파라미터 모든 선택 된 이미지에 맞는 보장 하려고 추가 임의 이미지를 선택 하는 것이 좋습니다.<ol>
<li>기관 및 감지 하는 캡슐의 수를 최대화 하 고 시각적으로 동그라미 제대로 맞게 표시 여부 검사. 감지 하는 캡슐 내에서 시체의 수 오른쪽에 텍스트 상자에 표시 됩니다. 그렇지 않으면, 결과 정확한 될 때까지 알고리즘 매개 변수를 조작 합니다. 참고: 두꺼운 색된 동그라미는 시각화 도움에. 측정에 대 한 생성 하는 실제 원 HCT 알고리즘에 의해 계산 하는 수학 곡선입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>분석 시작 단추를 클릭 하 여 이미지 파일의 전체 디렉터리에 감지 알고리즘을 실행 합니다. 각 이미지 분석 될 것 이다 고 프로그램 표시 됩니다 "완료" 오른쪽 텍스트 상자에 모든 이미지를 분석 하는 경우.</li>
		<li>일치 및 정리 단추를 클릭 합니다. 일치 하는 검색 된 캡슐에, 감지 셀 시체와 진정한 캡슐 반경 캡슐에서 몸을 빼서 계산 됩니다. 참고: 경우 형광을 검출 하는 알고리즘 사용 되 고 또는 다른 상황이 하나의 원형은 감지이 단계 필요 하지 않습니다. 대신 당겨 시체 또는 당겨 캡슐 버튼 각각만 파란색 이나 녹색 원만에 대 한 데이터를 수집 하려면 클릭 합니다. 그것은 그 캡슐 데이터를 검색 하는 경우에 반지름 됩니다 참조 셀의 총 반경 세포 체의 반경 수 없습니다 뺄 때 주의 하는 것이 중요.</li>
		<li>이미지 디렉토리에 "CleanedOuput.csv" 파일에 완성 된 데이터를 찾습니다. 데이터의 원피스를 선택 하는 경우에 "CleanedBodies.csv" 또는 "CleanedCapsules.csv" 파일이 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li>
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<li>García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+CAP59+%28or+Cap59p%29+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li>
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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 기술의 중요 한 단계는 인도 잉크 슬라이드를 준비 하 고 현미경 이미지를 획득. 알고리즘의 다양 한 슬라이드와 이미지 기술 성공적으로 테스트 되었습니다 동안 권장된 프로토콜이이 원고에 설명 되어 있습니다. 다 당 류 캡슐이이 입자는 너무 커서 다 당 류 fibril 네트워크 침투 캡슐의 도메인에서 인도 잉크 입자의 배제에 기반으로 감지 됩니다. 인도 잉크 제외 어두운 배경 위에 밝은 원 발생합니다. 알고리즘 서클 얼마나 잘 그들은 그들의 배경과 대조에 따라 검색 합니다. 따라서, 다 당 류 캡슐과 배경, 신호 대 잡음 비율을 증가 하 고 결과 품질 향상 간의 높은 대비 무거운 인도 잉크 얼룩 발생 합니다. 반대로, 세포 체는 밝은 배경 위에 어두운 원형으로 감지 됩니다. 세포 체는 현미경으로, 설정 되어 있는 초점면 확산으로 나타나는 원 상단에 회색 또는 셀의 아래쪽으로 센터에서 압축 된 어두운 밴드를 기반으로 모양이 변경 됩니다. 가장 정확한 원 감지에 발생이 같은 이유로 이미 논의 세포 체 압축, 어두운 악대로 나타나는 ...

Cryptococcus neoformans immunosuppressed 인구에서 주로 인간의 질병와 관련 된 전세계 편 발견 병원 성 효 모 이다. C. neoformans 전염병1인 사하라 총 연간 사망자의 중요 한 원인이 가장 주목할만 하 게 차지 한다. Cryptococcal 감염의 주요 임상 징후는 감염 된 대 식 세포 (트로이 목마 방법)에 전송 하 여 중앙 신경 시스템의 침공을 다음과 같이 meningoencephalitis 또는 혈액-뇌 장벽에의 직접 교차점. C. neoformans 는 인체 온도, urease 활동, melanization, 및 다 당 류 캡슐2의 형성에서 복제 하는 기능을 포함 한 몇 가지 독성 요소를 표현 한다. 다 당 류 캡슐 glucuronoxylomannan와 glucoronoxylomannangalactan 고분자와 기능 호스트 면역 반응2등 환경 스트레스 요인에 대 한 보호벽으로 반복 구성 됩니다.
Cryptococcal 다 당 류 캡슐 크기의 크기 일관 되 게 연관 되지 않은 독성과, 비록 증거가 병 인2,3,,45에 있는 요인 다는 것 6,7. 캡슐 크기 염 병 리6와 연결, 제어 Cryptococcus 감염5, 하 대 식 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다 이며 독성의 손실8결 석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 캡슐 크기 측정은 일반적인 cryptococcal 연구, 하지만 아무 fieldwide 캡슐 측정 하는 방법에 대 한 표준.
현재, C. neoformans 다 당 류 캡슐 측정 현미경 이미지, 수동 측정에 기반 하 고 실험실9,10, 마다 이미지 및 측정 취득의 정확한 방법 11. 이 방법에는 즉시 관심사는 일부 연구 요구 정확도 신뢰성 유지를 어렵게 만드는 개별 측정의 수천의 수집 이다. 또한, 결과 게시 하는 경우에 종종 있다 측정 방법의 부적당 한 설명. 많은 출판물 어떻게 그들의 측정 가져온, 설명 하지 어떤 초점 비행기 사용 되었다, 그들은 한 측정을 사용 하거나 몇 가지, 또는 다른 평균 반지름 또는 지름, 사용 여부를 어떻게 그들은 캡슐 식별에 대 한 임계값을 결정 세부 사항입니다. 일부 출판물만 상태는 프로그램으로 그들의 방법 사용 되었다, 예를 들어, "어도비 포토샵 c s 3의 사용 된 셀 측정 하"11. 재현성 어려울 수 있습니다 표준화 및 정보 보고의이 부족이 불가능 한 경우. 인간의 시력, 컴퓨터 밝기, 현미경 설정 차이 슬라이드 조명, 및 다른 요인 뿐만 아니라 개인 간의 하지만 샘플, 사이 계산 픽셀 강도 값의 비율에 따라 일정 하 게 유지 됩니다 반면 변화할 수 있다 고 샘플 사이의 적용 가능 합니다. 이 기술은 없는 없음 전에 필드에 대 한 캡슐 크기를 측정 하는 표준화, 신속, 정확 하 고 간단한 기술 제공의 맥락에서 생성 되었습니다.
앞에서 설명한 대로 CHT 알고리즘은 오래 된, 그리고 스크립트를 자동으로 검색 하는 원 전에 작성 되었습니다. 이 메서드는 어디 다른 스크립트 짧은을 것 이라고 하는 두 가지 영역에서 향상 됩니다. 첫째, 단순히 서클 감지 충분 하지 않습니다, cryptococcal 세포와 두 가지 동그라미 서로 관하여 감지 해야 하기 때문에. 이 방법은 특히 감지 캡슐 내에서 셀 시체, 둘 사이 차별 하 고 관련 몸 캡슐 쌍에 대해서만 계산을 수행. 둘째, 심지어 때 동일한 프로토콜, 다른 수 사관 다음으로 끝날 것 이다 다른 이미지 획득. 탐정 제어할 모든 알고리즘 매개 변수를 함으로써,이 도구는 수집 방법의 광범위 한 범위에 맞게 조정할 수 있습니다. 표준화 범위, 목표, 필터, 그리고에 대 한 필요가 있다.
이 기술은 이미지 내 원 그들의 배경과 그 명암을 감지 하는 탐정 필요 어떤 상황 든 지에 쉽게 적용할 수 있습니다. 두 원 가볍고 어두운 그들의 백그라운드 검출 될 수 있다, 보다,이 기술을 사용 하 여 측정.

<table><tbody><tr><td>인도 잉크</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td></td><td></td>261194</tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>Fisherfinest 프리미엄 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td><td>Sally Hansen</td><td>N/A</td><td>109 보이지 않는</td></tr><tr><td>SAB 미디어</td><td>시그마</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>크립토쿠스 neoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>H99 변형</td></tr><tr><td>Olympus AX70 현미경</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>단종되었습니다. 명시야 현미경</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>단종 ; 카메라 현미경 어태치먼트</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>가장 최근 권장</td></tr><tr><td>Python 프로그래밍 언어</td><td>Python</td><td>N/A</td><td>버전 2 필요 ; 2.7 권장</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>가장 최근 버전 권장</td></tr><tr><td>PBS(Phosphate Buffered Saline)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

이 기술의 목적은 많은 수의 다 당 류 캡슐 측정에 대 한 일관 된, 정확한, 및 관리 프로세스를 제공 하입니다.
첫째, 임계값 이미지 강도 값 고유 각 이미지에 대 한 계산에 따라 생성 됩니다. 그런 다음 원형 개체와 확고 원 Hough 변환 (CHT) 알고리즘을 사용 하 여 백그라운드에 따라 검색 됩니다. 마지막으로, 검색 된 셀 캡슐과 시체 중심 좌표와 반지름 크기, 일치 하 고 데이터 관리 스프레드시트에서 사용자에 게 보내집니다.
이 기법의 장점은 간단 하지만 중요 한입니다. 첫 번째, 이러한 계산 인간 보다는 알고리즘에 의해 수행 되기 때문에 정확성과 신뢰성 증가 된다. 정확성이 나 신뢰성 얼마나 많은 샘플 분석에 아무 하락이 있다. 둘째,이 이렇게 캡슐 측정 연구소에 의해 다릅니다 현재 상황 대신 Cryptococcus 필드에 대 한 잠재적인 표준 운영 절차를 설정 합니다. 셋째, 주어진 있다는 수동 캡슐 측정 느리고 단조, 자동화에 차례로 점점 강력한 통계 및 높은 처리량 데이터 분석을 용이 하 게 하는 효 모 세포의 큰 숫자에 빠른 측정 수 있습니다.
이 기술의 주요 제한 방법에서 온 알고리즘 기능. 첫째, 알고리즘 서클 생성할 것 이다. 동안 Cryptococcus 세포와 그들의 캡슐에 원형 형태, 비 원형 물체 감지에이 기술을 적용할 것은 어려울 것 이다. 둘째, 서클 감지는 어떻게 인해 CHT 알고리즘 여러 클러스터 된 서클의 바깥쪽 가장자리에 따라 거 대 한 의사 원을 검색할 수 있습니다. 그러나, 의사 원 안에 잡힌 안하고 셀 시체 수 있습니다 쉽게 감지 되며 결과 데이터 집합에서 제거.
이 기술은 인도 잉크 밝은 분야 현미경 검사 법;에 따라 Cryptococcus 종의 원형 다 당 류 캡슐을 측정 하기 위한 의미 그것은에 적용 될 수 있지만 다른 대비 원형 개체 측정을 기반으로 합니다.

카메라(그림 1)과 함께 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 인도 잉크 슬라이드의 현미경 사용 이미지를 먼저 얻을 수 있습니다. 세포 분리 및 세포와 배경 사이 대조를 만들 충분 한 얼룩을 사용 또한 보기의 필드를 압도 하지 충분히 낮은 밀도를 중요 하다. 프로토콜에서 설명 했 듯이, 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수 샘플, 현미경, 사용 목적에 따라 달라 집니다. 셀 클러스터 또는 중복 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 측면은, 셀 초점 비행기 크게 다양 하지 않습니다 그리고 그 중요 한 인도 잉크 얼룩 배경 (필드의 적어도 25%)에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이러한 방향 평균 픽셀 휘도 값과 표준 편차를 추가 하 여 각 이미지에 고유한 임계값을 결정 하는 알고리즘을 수 있습니다. 강도 값이 말했다 임계값 보다 높은 모든 픽셀은 흰색 간주 됩니다 및 낮은 강도 값을 가진 ...

이 기술은 다 당 류 캡슐 몸과 반지름을 측정 하도록 설계 되어 자동된 배치 이미지 프로세서를 설명 합니다. 처음 Cryptococcus neoformans 캡슐 측정을 위해 설계 자동된 이미지 프로세서는 원형 개체의 다른 기반으로 하는 대비 검출에도 적용할 수 있습니다.

Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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이 기술의 전반적인 목표는 지루한 수동 측정을 자동화하는 것입니다. 이 방법은 캡슐 또는 세포체 크기 간의 관계, 독성의 다양한 측면과 같은 크립토코커스 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 피로 없이 방대한 양의 시료를 분석할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 크립토콕시스 치료로 확장되는데, 캡슐과 세포체 크기가 병원체의 중요한 측면이기 때문입니다. India Ink Slide를 준비하려면 먼저 10마이크로리터의 크립토코커스 샘플을 슬라이드에 피펫팅합니다. 작업이 필요한 모든 원형 yi 변형률이지만 이 실험에서는 H99가 사용된 유일한 변형자였습니다.2마이크로리터의 인도 잉크를 시료에 얼룩진 피펫으로 만든 후 피펫 팁을 시료에 물리적으로 밀어 넣고 인도 잉크가 고르게 분포될 때까지 원을 그리며 움직여 혼합합니다. 커버 슬립의 왼쪽 가장자리를 슬라이드 표면에 대고 눌러 샘플 위에 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립의 반대쪽을 샘플 위로 부드럽고 균일하게 내립니다.슬라이드를 5분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 커버 슬립 테두리에 매니큐어를 살짝 바르면 밀봉을 형성하고 인도 잉크 얼룩을 보존할 수 있습니다. 샘플을 이미지화하려면 카메라 부착물과 알려진 픽셀에서 미크론으로의 변환이 있는 명시야 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다.필터, 대물렌즈 및 대비를 조정하고, 시야가 조밀하되 과도하게 채워지지 않도록, 세포 캡슐과 배경 사이의 대비가 뚜렷한 크립토코커스 세포로, 어두운 띠로 시각화된 세포체에 적절하게 초점을 맞춥니다. 이미지를 촬영한 후에는 측정 알고리즘이 단일 디렉토리의 이미지에 대해 실행되고 출력 데이터가 이미지 파일의 이름에 따라 구성되므로 명확한 제목이 있는 단일 디렉토리에 저장합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 알고리즘을 설정한 후 QCA.py 두 번 클릭하여 응용 프로그램을 실행합니다.프로그램에 설명된 단계를 수행하는 동안 이미지 파일의 확장자 유형을 입력하고 앞에 마침표가 오고 세미콜론으로 구분됩니다. 그런 다음 Enter 버튼을 클릭합니다. Select Directory(디렉토리 선택) 버튼을 클릭하여 이미지 파일이 있는 디렉토리를 선택하고 이미지가 포함된 폴더를 선택합니다.Generate Image List 버튼을 클릭하여 디렉토리의 이미지 파일 목록을 생성합니다. 이미지는 오른쪽의 텍스트 상자에 나열됩니다. 목록을 검토하고 목록이 정확하고 완전한지 확인합니다.그런 다음 Select Random Image 버튼을 클릭하여 목록에서 미리보기로 사용할 임의의 이미지를 선택합니다. 그런 다음 현미경 대물렌즈와 비닝 설정을 입력합니다. 기본 설정이 사용된 현미경과 일치하지 않으면 사용자 지정 픽셀 변환을 선택하고 이미지에 대한 픽셀에서 마이크로미터로의 변환을 입력합니다.선택했으면 Calculate Conversion(전환 계산) 버튼을 클릭하고 오른쪽의 텍스트 상자에 따라 변환이 올바른지 확인합니다. 원 감지를 위한 알고리즘 파라미터를 입력하려면, 외부 캡슐 감지를 위해 감지할 수 있는 최소 및 최대 반경을 최소 및 최대 캡슐 반경 항목으로 입력합니다. 그런 다음 cell body detection을 위해 검출할 수 있는 최소 및 최대 반경을 min 및 max cell body radius 항목으로 입력합니다.이제 캡슐 및 세포체 감도 슬라이더를 이동하여 알고리즘의 감도 임계값을 조정합니다. 민감도가 낮으면 엄격해지고 가양성 원 감지가 감소하지만 실제 원을 더 적게 감지할 수도 있습니다. 반대로, 민감도가 높으면 탐지율이 증가하지만 거짓 긍정 원이 발생할 수도 있습니다.감지된 시체와 캡슐의 수를 최대화하고 원이 올바르게 맞는지 육안으로 검사합니다. 감지된 캡슐 내의 시체 수는 오른쪽의 텍스트 상자에 표시됩니다. 그렇지 않으면 결과가 정확해질 때까지 알고리즘 매개변수를 조작합니다.Begin Analysis 버튼을 클릭하여 이미지 파일의 전체 디렉토리에서 감지 알고리즘을 실행합니다. 각 이미지가 분석되고 모든 이미지가 분석되면 프로그램의 오른쪽 텍스트 상자에 완료가 표시됩니다. 그런 다음 일치 및 정리 버튼을 클릭합니다.이렇게 하면 감지된 세포체를 세포가 들어 있는 감지된 캡슐과 일치시키고 캡슐에서 몸체를 빼서 실제 캡슐 반경을 계산합니다. 이미지 디렉터리의 CleanedOutput에서 완료된 데이터를 찾습니다. CSV 파일.데이터를 하나만 선택한 경우 파일에 CleanedBodies. csv 또는 CleanedCapsules.csv 레이블이 지정됩니다. 여기 인도 잉크 슬라이드의 현미경 이미지에서 볼 수 있듯이 세포는 분리되어 있으며 시야를 압도하지 않을 만큼 충분히 낮은 밀도로 되어 있습니다.세포와 배경 사이의 대비를 만들기 위해 충분한 얼룩도 사용되었습니다. 알고리즘은 평균 강도 값을 취하고 표준 편차를 더하여 각 이미지에 고유한 임계값을 결정합니다. 강도가 임계값보다 높은 픽셀 강도는 흰색으로 간주되고 강도가 낮은 픽셀 강도는 검은색으로 간주됩니다.세포체는 캡슐의 흰색 배경에 있는 견고한 검은색 원으로 시각화되어야 합니다. 사용하기에 가장 좋은 초점면은 세포체가 어둡고 집중된 띠로 나타나는 초점면입니다. 이 초점면은 세포의 초점을 적절하게 맞추기 때문에 표준으로 허용됩니다.이것은 UVITEX로 세포벽을 시각화하여 확인되었는데, UVITEX는 중앙에 약한 신호가 있는 선명하고 집중된 세포벽이 분명한 일종의 염색입니다. 프로토콜을 정확하게 따르고 최적의 이미지를 얻을 때 알고리즘은 정확하고 신뢰할 수 있습니다. 그러나 프로토콜을 잘못 따르고 잘못된 염색, 과밀 또는 이전에 언급한 기타 매개변수로 인해 최적이 아닌 이미지를 얻을 경우 알고리즘은 정확도를 잃고 사람의 측정을 다시 요약할 수 없습니다.이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 약 10분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실제 샘플을 획득할 때 준비할 수 있도록 최적의 이미지를 획득하기 위한 느낌을 미리 익히는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 크립토코커스 연구 분야의 연구자들이 캡슐과 세포체가 명확하게 시각화된 모든 이미징 시스템에서 캡슐과 세포체 크기를 탐색할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 크립토코커스 캡슐과 세포체를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 크립토코커스로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 기본 BSL2 안전과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 옵소니화된 박테리아와 면역 세포 간의 상호 작용을 조사하기 위한 옵소노 준수 분석을 보여줍니다. 항캡슐 항체가 포함된 테스트 혈청으로 처리된 형광 표지 박테리아는 대식세포로 배양됩니다. 대식세포를 형광으로 염색한 후, 대식세포 표면에 부착된 박테리아를 시각화를 위해 현미경으로 관찰합니다.

안티 캡슐 항체에 의한 캡슐화된 박테리아의 옵소니화를 평가하기 위한 Opsono-Adherence Assay

여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 문화 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 CFU 열거에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다.

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

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우리는 소규모로 미생물 외다당류의 식별 및 특성화를 위한 자동화된 모듈식 고처리량 방법을 제시합니다. 이 방법은 빠른 사전 선택을 결합하여 분비된 다당류의 총량을 상세한 탄수화물 지문과 결합하여 새로 분리된 박테리아 균주 또는 전체 균주 수집을 빠르게 스크리닝할 수 있습니다.

자동화 모​​듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

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박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

배우세요 Cryptococcus neoformans의 다당류 캡슐과 세포체 크기를 자동 측정하는 이미지 처리 알고리즘을 사용하는 방법입니다. 이 기술은 대량 샘플 분석을 통해 병원성 연구의 효율성과 정확성을 높입니다.

Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

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