Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

이 기술의 전반적인 목표는 지루한 수동 측정을 자동화하는 것입니다. 이 방법은 캡슐 또는 세포체 크기 간의 관계, 독성의 다양한 측면과 같은 크립토코커스 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 피로 없이 방대한 양의 시료를 분석할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 크립토콕시스 치료로 확장되는데, 캡슐과 세포체 크기가 병원체의 중요한 측면이기 때문입니다. India Ink Slide를 준비하려면 먼저 10마이크로리터의 크립토코커스 샘플을 슬라이드에 피펫팅합니다. 작업이 필요한 모든 원형 yi 변형률이지만 이 실험에서는 H99가 사용된 유일한 변형자였습니다.

2마이크로리터의 인도 잉크를 시료에 얼룩진 피펫으로 만든 후 피펫 팁을 시료에 물리적으로 밀어 넣고 인도 잉크가 고르게 분포될 때까지 원을 그리며 움직여 혼합합니다. 커버 슬립의 왼쪽 가장자리를 슬라이드 표면에 대고 눌러 샘플 위에 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립의 반대쪽을 샘플 위로 부드럽고 균일하게 내립니다.

슬라이드를 5분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 커버 슬립 테두리에 매니큐어를 살짝 바르면 밀봉을 형성하고 인도 잉크 얼룩을 보존할 수 있습니다. 샘플을 이미지화하려면 카메라 부착물과 알려진 픽셀에서 미크론으로의 변환이 있는 명시야 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다.

필터, 대물렌즈 및 대비를 조정하고, 시야가 조밀하되 과도하게 채워지지 않도록, 세포 캡슐과 배경 사이의 대비가 뚜렷한 크립토코커스 세포로, 어두운 띠로 시각화된 세포체에 적절하게 초점을 맞춥니다. 이미지를 촬영한 후에는 측정 알고리즘이 단일 디렉토리의 이미지에 대해 실행되고 출력 데이터가 이미지 파일의 이름에 따라 구성되므로 명확한 제목이 있는 단일 디렉토리에 저장합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 알고리즘을 설정한 후 QCA.py 두 번 클릭하여 응용 프로그램을 실행합니다.

프로그램에 설명된 단계를 수행하는 동안 이미지 파일의 확장자 유형을 입력하고 앞에 마침표가 오고 세미콜론으로 구분됩니다. 그런 다음 Enter 버튼을 클릭합니다. Select Directory(디렉토리 선택) 버튼을 클릭하여 이미지 파일이 있는 디렉토리를 선택하고 이미지가 포함된 폴더를 선택합니다.

Generate Image List 버튼을 클릭하여 디렉토리의 이미지 파일 목록을 생성합니다. 이미지는 오른쪽의 텍스트 상자에 나열됩니다. 목록을 검토하고 목록이 정확하고 완전한지 확인합니다.

그런 다음 Select Random Image 버튼을 클릭하여 목록에서 미리보기로 사용할 임의의 이미지를 선택합니다. 그런 다음 현미경 대물렌즈와 비닝 설정을 입력합니다. 기본 설정이 사용된 현미경과 일치하지 않으면 사용자 지정 픽셀 변환을 선택하고 이미지에 대한 픽셀에서 마이크로미터로의 변환을 입력합니다.

선택했으면 Calculate Conversion(전환 계산) 버튼을 클릭하고 오른쪽의 텍스트 상자에 따라 변환이 올바른지 확인합니다. 원 감지를 위한 알고리즘 파라미터를 입력하려면, 외부 캡슐 감지를 위해 감지할 수 있는 최소 및 최대 반경을 최소 및 최대 캡슐 반경 항목으로 입력합니다. 그런 다음 cell body detection을 위해 검출할 수 있는 최소 및 최대 반경을 min 및 max cell body radius 항목으로 입력합니다.

이제 캡슐 및 세포체 감도 슬라이더를 이동하여 알고리즘의 감도 임계값을 조정합니다. 민감도가 낮으면 엄격해지고 가양성 원 감지가 감소하지만 실제 원을 더 적게 감지할 수도 있습니다. 반대로, 민감도가 높으면 탐지율이 증가하지만 거짓 긍정 원이 발생할 수도 있습니다.

감지된 시체와 캡슐의 수를 최대화하고 원이 올바르게 맞는지 육안으로 검사합니다. 감지된 캡슐 내의 시체 수는 오른쪽의 텍스트 상자에 표시됩니다. 그렇지 않으면 결과가 정확해질 때까지 알고리즘 매개변수를 조작합니다.

Begin Analysis 버튼을 클릭하여 이미지 파일의 전체 디렉토리에서 감지 알고리즘을 실행합니다. 각 이미지가 분석되고 모든 이미지가 분석되면 프로그램의 오른쪽 텍스트 상자에 완료가 표시됩니다. 그런 다음 일치 및 정리 버튼을 클릭합니다.

이렇게 하면 감지된 세포체를 세포가 들어 있는 감지된 캡슐과 일치시키고 캡슐에서 몸체를 빼서 실제 캡슐 반경을 계산합니다. 이미지 디렉터리의 CleanedOutput에서 완료된 데이터를 찾습니다. CSV 파일.

데이터를 하나만 선택한 경우 파일에 CleanedBodies. csv 또는 CleanedCapsules.csv 레이블이 지정됩니다. 여기 인도 잉크 슬라이드의 현미경 이미지에서 볼 수 있듯이 세포는 분리되어 있으며 시야를 압도하지 않을 만큼 충분히 낮은 밀도로 되어 있습니다.

세포와 배경 사이의 대비를 만들기 위해 충분한 얼룩도 사용되었습니다. 알고리즘은 평균 강도 값을 취하고 표준 편차를 더하여 각 이미지에 고유한 임계값을 결정합니다. 강도가 임계값보다 높은 픽셀 강도는 흰색으로 간주되고 강도가 낮은 픽셀 강도는 검은색으로 간주됩니다.

세포체는 캡슐의 흰색 배경에 있는 견고한 검은색 원으로 시각화되어야 합니다. 사용하기에 가장 좋은 초점면은 세포체가 어둡고 집중된 띠로 나타나는 초점면입니다. 이 초점면은 세포의 초점을 적절하게 맞추기 때문에 표준으로 허용됩니다.

이것은 UVITEX로 세포벽을 시각화하여 확인되었는데, UVITEX는 중앙에 약한 신호가 있는 선명하고 집중된 세포벽이 분명한 일종의 염색입니다. 프로토콜을 정확하게 따르고 최적의 이미지를 얻을 때 알고리즘은 정확하고 신뢰할 수 있습니다. 그러나 프로토콜을 잘못 따르고 잘못된 염색, 과밀 또는 이전에 언급한 기타 매개변수로 인해 최적이 아닌 이미지를 얻을 경우 알고리즘은 정확도를 잃고 사람의 측정을 다시 요약할 수 없습니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 약 10분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실제 샘플을 획득할 때 준비할 수 있도록 최적의 이미지를 획득하기 위한 느낌을 미리 익히는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 크립토코커스 연구 분야의 연구자들이 캡슐과 세포체가 명확하게 시각화된 모든 이미징 시스템에서 캡슐과 세포체 크기를 탐색할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 크립토코커스 캡슐과 세포체를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 크립토코커스로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 기본 BSL2 안전과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.