Name: 인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 학습하세요 인간 장 오가노이드를 이용한 상피 장벽 투과성 실시간 측정 방법입니다. FITC-dextran 미세주입과 라이브 이미징으로 약물 처리에 따른 투과성 변화를 정량 분석할 수 있습니다.

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저자 박사 스테파니 Spohn과 바젤 Abuaita organoid microinjection에 많은 유용한 토론에 감사 하 고 싶습니다. 주니어 장 줄기 세포 컨소시엄 (U01DK103141), 공동 연구 프로젝트는 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신장 질병 (NIDDK) 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID)에 의해 자금 지원 됩니다. 주니어 및 VBY NIAID 소설, 장의 질병 (NAMSED) 컨소시엄 (U19AI116482)에 대 한 대안 모델 시스템에 의해 지원 됩니다. DRH 지원 메커니즘의 미생물 병 인 교육 부여 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID, T32AI007528)와 임상, 번역 상 과학 상 미시간 연구소 임상 및 건강에 대 한 연구 (UL1TR000433)입니다.
완전 한 데이터 파일 및 데이터 분석 코드가이 원고에 사용 된 https://github.com/hilldr/HIO_microinjection에서 사용할 수 있습니다.

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저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 공개할 수 있다.

이 프로토콜 실시간으로 hPSC 파생 HIOs 및 조직 파생 장 organoids의 microinjection 및 상피 장벽 침투성의 측정을 위한 범용 메서드를 설정합니다. 우리는 또한 우리의 접근 방식을 분석 하 고 이러한 메서드를 사용 하 여 생성 하는 데이터의 해석 설명 했다. 준 장 organoids의 성장 채택 모델 시스템16,20,,2128 및 장의 장벽 침투성으로 순수 관련 기능에 오랜 관심 결과3,,45,6, 우리는이 분야에서 일하고 다른 사람 적용 하 고 이러한 방법에 따라 만들 수 있을 것입니다 예상.
이 기술의 응용 프로그램에 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 고품질 hPSC-또는 파생된 HIO 조직 microinjection와 광범위 한 실험 전에 설치 되어야 하는 조직에 접근. HIO macrostructure 조직 정체성과 세포 형태학은 높은 재현성 HIOs24를 생성 하기 위해 설립 된 방법론을 활용 하면 이기종, 크기와 모양, 변형 될 수 있습니다. 구형 HIOs 단일 반투명 루멘 이루어져 고 직경에서 약 1 m m microinjection 및 실시간 luminal 형광의 측정에 이상적입니다. 경우에 따라 microinjection는 하이 오의 붕괴 또는 주입 된 물자의 분명 한 누설의 결과로 실패 합니다. 실패 한 HIOs 표준 micropipette를 사용 하 여 사용자의 판단에 따라 잘 문화에서 제거할 수 있습니다. Microinjection 및 이미징 HIOs 선택할 때 이미징 플랫폼에서 사용할 수 있는 대물 렌즈를 고려 하십시오. 일반적으로 2-4 X 렌즈는 완전 한 HIO 형광 신호 캡처에 이상적 저전력 렌즈는 사용할 수 없거나 사용 가능한 HIOs 10 X 목표 사용할 수 있지만 &#60; 직경에서 1 m m. 이미징 소프트웨어 시간이 지남에 정의 된 지점에서 형광 이미지의 자동된 캡처 허용 해야 합니다.
이 프로토콜의 여러 수정 실험 요구 사항에 맞게 하기 위해 수 있습니다. 예를 들어 장벽 기능 테스트 결과 사용43 화합물의 분자 크기에 따라 있을 수 있습니다 그리고 그것은 다양 한 분자량의 dextran 준비를 테스트 하려면 적절 한 수 있습니다. 또한, 명시 이미징 조직25의 전반적인 구조적 무결성의 지표로 서 형광 이미징 뿐만 아니라 수행할 수 있습니다. 그것은 페니실린을 추가 해야 할 수 있습니다 라이브 박테리아25,28,31,32,,3344의 microinjection를 수행할 때와 스 또는 gentamicin HIO 문화 미디어 이전에 또는 microinjection 후에. microcapillary의 외부 세균성 문화 중단 작성 하는 동안 오염 될 것 이다 하 고이 하이 오 미디어에 전송 될 수 있습니다. 또는, microinjection HIOs 미디어 하지 않고, 세포 외 기질 (예를 들어, Matrigel)에 정지에 microinjection 완료 되는 미디어를 추가에 수행할 수 있습니다. 이 기질을 하는 오의 외부 얼굴 오염을 제한할 수 있습니다. 미생물 성장 분석 실험을 계획할 때 그것을 감속 하거나 방지 microinjected 생물의 성장을 피하기 위해 1-2 h 후 미디어에서 항생제를 제거 필요할 수 있습니다.
마지막으로, 모든 연구원 생체 외에서 영상에 적합 한 현미경 장비에 접근이 있을 것을 인식, 그것은 촬영 한 이미지에 형광 데이터를 수집 하기 위해이 프로토콜에서 설명 하는 절차를 적용할 수 있습니다 지적 하는 것이 중요 자동된 이미지 캡처 또는 환경 컨트롤 없이 표준 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 고정된 timepoints에서. 이 방법의 예는 레슬리와 황 외 에 의해 보고서에서 찾을 수 있습니다. 25, 누가 hPSC 파생 장 organoids, 그리고 Karve 및 Pradan 외. C. 남과 어울리지 않는 독 소 활동 검사 44, 유사한 hPSC 파생 장 organoids 라이브 대장균을 microinjected에 상피 장벽 침투성을 검사 들. 이미징 장비의 수동 조작 큰 변화와 어려움 형광 신호를 정상화 될 수 있습니다. HIOs 주입 FITC dextran의 수동 이미징 수행 때 고정된 배율, 형광 흥분 강도, 형광 강도 측정을 왜곡 하지 않도록 하는 실험 내내 노출 시간을 유지 하기 위해 필수적 이다.

장 상피 형성 선택적 장벽 영양소, H2O, 이온, 및 폐기물의 방향 전송 루멘 사이 다른 입자의 일반적인 보급 중재 교환 최소화 하면서 중재 하 고 중간 엽 조직 또는 혈액 공급1,2. 장 상피 방 벽의 일반적인 침투성 오래 간주 되었습니다 건강 및 질병3,,45,6의 속도 반영 하는 주요 기능 매개 변수 작은 분자 paracellular 공간 통해 상피에 걸쳐 확산 상피 장벽 침투성의 측정에서 지휘 될 수 있다 동물 모델7 과 lactulose의 섭취를 통해 인간의 환자8 , 위장, 그리고 이후의 컬렉션에 없는 특정 전송이 그리고 주변 혈액에 있는 농도 lactulose의 측정입니다. 장벽 기능 붙일 레이블된 탄수화물 등의 대체 섭취 마커 사용 가능한9,10도 있습니다. 이 방법은 장 상피 세포 배양 Transwell 지원11, 실험 제어에 대 한만 비보 의 가난한 예언자로 강평 되었다 또한 단순화 된 접근에 대 한 적응 되었습니다. 차별화 된 상피 하위 및 조직 구조12의 부재로 인해 침투성. 챔버를 사용 하 여 또 다른 접근 방식을 나타내고 전체 장 점 막 전 비보13상피 장벽 기능 측정에 대 한 허용. 이 기술의 응용 프로그램은 자주 조직의 가용성 및 조건13,14에 의해 제한 됩니다. 따라서 새로운 방법 생리 관련성 재현성 및 처리량의 균형은 필요 합니다.
Organogenesis 생체 외에서 최근 개발 업과 복잡 한 조직15,16,17의 역학에 대 한 정교한 플랫폼으로 3 차원 조직 배양 모델 시스템의 도입을 이끈 ,18,19,20,21,,2223. 특히, 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 파생 된 인간의 창 자 organoids (HIOs)19,24 호스트 미생물 상호 작용의 연구에 대 한 재현 하 고 실험적으로 세공 모델 시스템으로 등장 하 고 상피 장벽은 역학25,26,,2728. 마찬가지로, 인간의 조직 파생 된 organoids (일컬어 enteroids) 간단한 생 검 절차에서 파생 될 수 있다 고 연구 인간 생리학 및 질병15,,2930세공 시스템으로 사용할 수 있습니다. 인간의 장 organoids의 microinjection 실험적인 화합물25 의 배달에 대 한 허용 또는 미생물25,31,,3233 는 꼭대기에 상피 라이브 organoid 루멘의 표면입니다. 레슬리와 황 외. 25 는 최근 HIOs fluorescein isothiocyanate (FITC) 세균 독 소에 노출 다음 dextran을 표시와 함께 microinjected에 장벽 침투성 측정에이 기술을 적응.
이 프로토콜은 hPSC 파생 HIOs 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 조직 파생 HIOs 상피 장벽 침투성의 측정을 위한 가이드 것입니다. 사소한 수정, 그것은 또한 실험적인 화합물과 HIOs의 microinjection에 대 한 일반적인 입문서로 사용할 수 있습니다. 사용자가 microinjection 후 추가 또는 대체 다운스트림 응용 프로그램이 프로토콜을 보충 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Cell matrix solution (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT live cell imaging system</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>Camera</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Deltavision 시스템</td></tr><tr><td>softWoRx 이미징 소프트웨어에</td> 포함됨 <td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Deltavision 시스템에 포함</td></tr>됨 <tr><td>Biosafety cabinet</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>ENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>B27 supplement (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>ENR 매체의 구성 요소 참조; McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutamine (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>ENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 24 참조</td></tr><tr><td>HEPES 버퍼</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>ENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 참조 24</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>피펫 홀더</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Xenoworks 피펫 홀더</td></tr><tr><td>대체 마그네틱 스탠드</td><td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>해부 스코프</td><td>올림푸스</td><td>SX61</td><td>권장 스코프, 다른 모델도 호환 가능하지만</td></tr><tr><td>올림푸스 IX71 형광 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX71</td><td>Deltavision 시스템에 포함</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>광29065728</td><td></td><td>Deltavision 시스템에 포함</td></tr> 됨 <tr><td>재조합 C. difficile 독소 A/TcdA 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td>ENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>ENR 미디어의 구성 요소; McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& 참조 D Systems</td><td>6057-NG</td><td>ENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 참조 24</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextran (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>유리 필라멘트</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 홀더</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>선호 장치</td></tr><tr><td>아날로그 튜빙 키트</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 in clear</td><td>ferrule Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>1-1.2 mm O-ring</td><td>Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 장 organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

장 조직 생 검을 통해 얻은 또는 감독된 차별화를 통해 만능 줄기 세포에서 생성의 3D 문화 발전 장 점 막의 정교한 생체 외에서 모델에서 이어지고 있다. 이러한 신흥 모델 시스템을 활용 하 여 도구와 2D 문화 시스템 및 동물을 위해 개발 된 기술의 적응이 필요 합니다. 여기, 우리가 실시간으로 인간의 장 organoids에 상피 장벽 침투성을 측정 하기 위한 기술을 설명 합니다. 이것은 붙일 표시 된 dextran 및 epifluorescent 필터를 장착 한 거꾸로 한 현미경에 이미징의 microinjection에 의해 수행 됩니다. 장 organoids에 장벽 침투성의 실시간 측정이이 기술은 고정된 timepoint 이미징 접근에도 적용할 수 있지만 인간의 창 자 상피 조직에서 고해상도 임시 데이터의 생성을 촉진 한다. 이 프로토콜은 쉽게 상피 장벽 침투성 pharmacologic 대리인, 세균성 제품 또는 독 소, 또는 라이브 미생물에 노출 다음의 측정에 대 한 적응력입니다. 약간의 수정이이 프로토콜도 장 organoids의 microinjection에 대 한 일반적인 입문서로 사용할 수 있습니다와 사용자 추가 또는 대체 다운스트림 응용 프로그램 microinjection 다음이 프로토콜을 보완 하도록 선택할 수 있습니다.

HIOs 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 분화 되었다 고 설명한19,24셀 매트릭스 솔루션으로 이전에 양식. 4 주 후에 문화, 여 HIOs microinjection 수 있도록 충분히 확장 했다. HIOs 4 kDa FITC 활용 된 dextran PBS 또는 Clostridium 남과 어울리지 않는 독 소 TcdA를 포함 하는 PBS에와 microinjected 했다. C. 남과 어울리지 않 는 HIOs25독 소 중재 상피 독성을 전시 하는 기회 위장 병원 체 이다. 긍정적인 컨트롤로 EGTA HIOs PBS와 FITC dextran 주입의 하위 집합에서 하이 오 문화 미디어에 추가 되었습니다. EGTA 말라 골격42의 급속 한 탈 중 합을 일으키는 칼슘 chelator입니다. FITC 형광은 제어 환경 챔버 내에서 라이브 영상 현미경에 실시간으로에서 모니터링 하 고 이미지에서 10 분 간격으로 체포 되었다.
영상 데이터의 post hoc 분석 FITC 형광 (그림 5)의 보존에 상당한 차이 밝혔다. 그러나 HIOs PBS와 주입 거의 모든 t 에 형광 신호 유지 = 0, 또한 주입 했다의 TcdA와 EGTA 치료 HIOs 8 시간 후 microinjection (그림에 의해 형광 강도에 상당한 감소를 전시 5A). 영상 데이터는 각 실험 조건 (그림 5B) 시간이 지남에 형광 강도 상대적인 변화를 나타내는 고해상도 데이터 집합을 생성 하는 모든 시간 지점에서 모든 HIOs에 대 한 계량 했다. 상피 침투성에 차이 각 치료 그룹 (표 1) FITC의 평균 제거 시간 (t1/2 )를 계산 하 고 t t1/2 그룹 간의 차이 비교 하 여 평가 했다 학생의 t를 사용 하 여-테스트. 제어 처리 HIOs 유지 16 시간 이상 FITC 형광 신호의 대부분 (t1/2 = 17 ± 0.3 h). EGTA 치료 크게 제어 HIOs 상대적인 FITC dextran 제거 시간 감소 (1/2 t = 2.6 ± 0.2 h; P = 10-8x 1.3). 일치 결과 이전에 게시25, TcdA의 microinjection 크게 증가 제어 치료 기준으로 상피 장벽 침투성 (t1/2 = 7.6 ± 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). 따라서, 외부 (EGTA) 및 microinjected (TcdA) 화합물 HIOs에서 상피 장벽 침투성에 유도 하는 중요 한 변경 할 수 있다. 이러한 결과 상피 장벽 기능에 다양 한 약리학 적인 대리인, 대사 산물, 세균성 제품, cytokines, 성장 요인, 및 다른 화합물의 효과 평가 될 수이 접근을 사용 하 여 것이 좋습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>치료</td>
			<td>반감기 (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>낮은 95 %CI (h)</td>
			<td>위 95 %CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>제어</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0.63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 제거 시간을 의미 (t1/2) FITC-dextran HIOs에서 EGTA 또는 TcdA 치료에 대 한. 단위는 시간 후 microinjection.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
그림 1: microinjector와 micromanipulator HIO microinjection에 대 한 기본 레이아웃. 이 이미지는 장비 HIOs의 microinjection를 수행 하는 데 사용의 완전 한 보완을 보여줍니다. 주요 구성 요소는 표시 하 고 주문 정보 자료 테이블에서 찾을 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
그림 2: Micropipette 끌어당기는. 구리 난방 코일 hc, 탑 클램프 c1, 하단 클램프 (c2), 끌어당기는 팔 (pa), 열 선택 토글 (ht) 화살표로 식별 됩니다. 열 1과 풀에 대 한 올바른 설정은 빨간색 텍스트로 표시 됩니다. 삽입 된 난방에 대 한 준비가 제대로 탑재 유리 필 라 멘 트를 보여 줍니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
그림 3: 조직의 파생 HIO FITC dextran 주사의 대표 이미지. (A) 이미지 하이 오와 microinjection에 삽입 직전 유리 microcapillary의 위치를 보여주는. (B)는 조직에서 파생 된 인간 창 자 organoids FITC dextran의 microinjection 후의 명시 이미지. 형광 신호는 특정 필터 집합의 사용 없이 명백한 참고. 이 채색 microinjection 정밀 에이즈. 3 배 확대 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
그림 4: 라이브 이미징 워크플로. (A) 스크린샷 현미경 매개 변수를 설정, 슬라이드에는 HIOs 찾을 이미지 수를 각 하이 오에 대 한 무대의 위치를 저장 하는 데 필요한 단계를 설명. 각 위치에서 일정 한 간격 FITC 채널 캡처에 대 한 (B) 사전 영상 설정을 DV 포맷 데이터의 대답 (C) 후 이미징 수출에 시간 포인트 당 HIO 당 한 TIFF 이미지를 TIFF 이미지 파일 지정.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
그림 5: 대표적인 결과. (A) 줄기 세포 파생 인간의 창 자 organoids (HIO) 2 mg/mL FITC dextran와 microinjected (4 kDa) 20 시간에 대 한 군데. HIOs 했다 또한 PBS (제어) 또는 Clostridium 남과 어울리지 않는 독 소 TcdA microinjected (12.8 ng / µ L) 2mm EGTA 외부 문화 미디어에 추가 된 취급. 4 X 확대입니다. (B) 줄거리 HIOs에서 시간이 지남에 의미 정규화 FITC 강도의 PBS (제어), TcdA, 또는 EGTA 취급. 오차 막대를 나타내는 S.E.M.과 n = 11 HIOs (제어), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

이 절차의 전반적인 목표는 시간이 지남에 따라 인간 장 오가노이드의 상피 장벽 투과성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 특정 독소, 박테리아 제품 또는 약물 치료가 상피 장벽 투과성을 어떻게 변화시킬 수 있는지와 같은 위장병학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간의 장 상피 조직을 사용하여 실시간으로 시각화하고 상피 장벽 투과성을 정량적으로 측정할 수 있다는 것입니다.인간 장 오가노이드를 마이크로 주입하기 전에 마이크로 인젝터를 설정하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미세 모세혈관을 준비, 설치 및 테스트해야 합니다. 마이크로 모세관을 주입 재료로 채우려면 유리 마이크로 모세관의 끝을 FITC-dextran 주입 현탁액에 담그고 마이크로 모세관의 끝이 튜브의 측면이나 바닥에 부딪히지 않도록 주의하십시오. 미네랄 오일 주사기를 뒤로 당겨 약 10마이크로리터의 FITC-dextran 현탁액을 미세 모세관으로 끌어들입니다.미세 주입 현탁액이 유리 미세 모세관 길이의 90%를 채우면 미세 모세관 채우기를 중지하십시오. 마이크로 주입 용액에서 마이크로 캐필러리를 빼내기 전에 주사기를 약간 눌러 마이크로 모세관의 끝에 공기 주머니가 포함되지 않도록 합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 인간 장 오가노이드 배양 플레이트를 제거하고 마이크로인젝터를 사용하여 바이오 안전 캐비닛으로 옮깁니다.배양 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 첫 번째 웰을 현미경 스테이지의 중앙에 배치하여 가장 낮은 배율 설정에서 스코프의 접안렌즈를 통해 명확하게 볼 수 있도록 합니다. 미세 모세관이 현미경 스테이지에 대해 45도 이상의 각도로 배양 웰을 향하도록 미세 매니퓰레이터 암을 돌립니다. 미세모세관의 끝을 매체 표면에서 약 1cm 위에 있는 첫 번째 배양 웰 위에 배치합니다.유리 필라멘트의 끝과 인간의 장 오가노이드가 접안렌즈를 통해 모두 보이는지 확인합니다. 성공적인 미세주입의 핵심은 미세주입을 시도하기 전에 미세모세관을 오가노이드와 조심스럽게 정렬하는 것입니다. 그리고 저는 항상 새로운 사용자가 중요한 실험을 시도하기 전에 여분의 조직으로 연습할 것을 권장합니다.z축 조절 손잡이를 시계 방향으로 돌려 미세모관을 천천히 전진시킵니다. 미세모세관 끝으로 인간의 장 오가노이드를 뚫습니다. 인간 장 오가노이드의 외부 표면은 미세모세관이 압력을 가하기 시작하면서 약간 눌려지고 팁이 내강을 관통하면 다시 모양으로 튀어나옵니다.루멘 내에서 미세모관의 끝을 보는 데 어려움이 있는 경우 해부 현미경의 조명 또는 배율 설정을 조정하십시오. 미세모세혈관이 미세모세관의 끝부분과 함께 인간 장 오가노이드의 중앙 근처에 올바르게 배치되면 미세조종기 제어장치에서 손을 뗍니다. 미네랄 오일이 채워진 주사기를 약간 눌러 미세 주입 용액을 미세 모세관에서 인간의 장 오가노이드 내강으로 밀어 넣습니다.인간의 장 오가노이드는 주사의 양을 수용하기 위해 약간 확장될 수 있습니다. 기동 중 인간 장 오가노이드의 우발적인 손상을 방지하기 위해 미세모세관을 배지 위에 배치한 상태에서 다음 인간 장 오가노이드 타겟으로 이동합니다. 치료 사이 또는 파손된 경우 미세 모세혈관을 교체하십시오.micromanipulator arm의 끝에 있는 cl을 풀고 마이크로 피펫 홀더에서 microcapillary를 제거합니다. 정점 상피에 전달되는 화합물을 테스트하려면 밀리리터 FITC-덱스트란당 2밀리그램을 함유하는 멸균 PBS에 화합물을 다시 현탁해야 합니다. 이 대표적인 실험에서는 Clostridium difficile toxin TcdA를 다시 현탁시키고 미세주입 전에 FITC-dextran을 함유한 PBS에 마이크로리터당 12.8나노그램을 첨가합니다.이전 섹션에서 설명한 것처럼 화합물을 인간 장 오가노이드 내강에 미세주입합니다. FITC-dextran의 미세주입 후 기저 측면 구획으로 전달되는 화합물을 테스트하려면 외부 배양 배지를 양성 대조군으로 2밀리몰 EGTA를 포함하거나, 음성 대조군으로 PBS 비히클 단독 또는 기타 실험 화합물을 포함하는 새로운 배지로 교체합니다. 미세주입 직후 실시간 이미징을 시작합니다.이 대표적인 명시야 이미지는 FITC-dextran의 미세주입 후 조직 유래 인간 장 오가노이드를 보여줍니다. 형광 신호는 특정 필터 세트를 사용하지 않아도 분명합니다. 줄기세포 유래 인간 장 오가노이드에 PBS에 현탁된 4킬로달톤 FITC 복합 덱스트란 또는 클로스트리듐 디피실 독소 TcdA를 함유한 PBS를 미세주입했습니다.양성 대조군으로, EGTA는 PBS 및 FITC-dextran을 주입한 인간 장 오가노이드의 하위 집합에서 인간 장 오가노이드 배양 배지에 추가되었습니다. 인간 장내 오가노이드는 20시간 동안 이미지화되었습니다. 이러한 이미지에서 볼 수 있듯이, PBS를 주입한 인간 장내 오가노이드는 T zero에 존재하는 거의 모든 형광 신호를 유지했습니다.그러나 TcdA를 주사하거나 EGTA로 처리한 인간 장내 오가노이드는 미세주입 후 8시간까지 형광 강도가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 이미징 데이터는 각 실험 조건에서 시간 경과에 따른 형광 강도의 상대적 변화를 나타내는 고해상도 데이터 세트를 생성하기 위해 모든 시점에서 모든 인간 장 오가노이드에 대해 정량화되었습니다. 이 기술을 마스터하면 실험 조건의 수에 따라 약 30분에서 1시간 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 미세주사 전에 인내심을 갖고 인간의 장 오가노이드를 미세모세관과 정렬할 때 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 PCR, 웨스턴 블롯 및 RNA 탐색과 같은 다른 방법을 수행하여 주입된 물질에 대한 인간 장 오가노이드의 반응에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 박테리아 독소, 약리제, 사이토카인, 심지어 살아있는 미생물이 인간 장 오가노이드의 상피 장벽 기능에 미치는 영향을 조사할 수 있었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 형광 표지된 덱스트란 및 기타 실험 물질을 인간 장 오가노이드의 내강에 미세 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 박테리아 독소나 살아있는 유기체로 작업할 때는 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 PPE 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 마지막으로, 미세 모세혈관은 매우 날카롭기 때문에 찔린 상처를 피하도록 특히 주의하십시오.

real-time-measurement-epithelial-barrier-permeability-human

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 장 장벽 기능의 생체 외 모델로 절제된 장 조직 제제 또는 "장 주머니"의 사용을 설명합니다. 이 모델은 소화기 질환의 동물 모델에서 특정 장 부위에서 상피 장벽과 점액 겔 층 모두의 무결성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는

두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 rhodamineB-dextran)은 공초점 현미경검사를 이용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

이 프로토콜은 태아의 장 조직에서 3 차원 장 모델 인 enteroids의 확립을 자세히 설명합니다. 상피 바이오마커의 면역형광 영상화를 모델 특성화에 사용하였다. 박테리아 내독소인 리포폴리사카라이드의 정점 노출은 미세주입 기술을 사용하여 형광 덱스트란의 누출에 의해 측정된 용량 의존적 방식으로 상피 투과성을 유도하였다.

태아 조직 유래 장내 투과성 테스트

본 프로토콜은 장 투과성을 결정하기 위해 정점 엔터로이드 모델에서 루시퍼 옐로우를 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 괴사 성 장염과 같은 염증성 장 질환을 모델링하는 장내 세포에서 세포 투과성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

정점 장내구 모델에서 루시퍼 옐로우를 사용한 장 투과성 측정

이 연구는 오가노이드에서 소 장 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 제시하여 숙주-병원체 상호 작용 연구를 위한 향상된 접근성을 제공합니다. 여기에는 멤브레인 무결성 및 기능을 평가하는 방법이 포함되며, 소의 위장 생리학을 모방하는 in vitro 모델을 발전시킵니다. 이 접근법은 향상된 치료 전략을 포함하여 상당한 생물 의학 및 농업 이점을 약속합니다.

Small and Large Intestinal Monolayer interface를 사용한 소 오가노이드 기술의 발전

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

본 연구에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 이용하여 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 마커의 운동 측정을 통해 프로그래밍 진행의 실시간 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 또한 IPSC 생성시 형태, 마커 또는 기자의 표현의 영상 기반의 평가를 포함한다.

체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화

학습하세요 인간 장 오가노이드를 이용한 상피 장벽 투과성 실시간 측정 방법입니다. FITC-dextran 미세주입과 라이브 이미징으로 약물 처리에 따른 투과성 변화를 정량 분석할 수 있습니다.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

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