Name: 큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 광역 스캐닝 프로브 나노리소그래피를 이용하여 균일한 단백질 어레이를 제작하고 간엽줄기세포와 나노구조 표면의 상호작용을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 생체재료 설계에 중요한 기준을 제공합니다.

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저자 인정 소스는 영국 공학 및 물리 과학 연구 협의회 (부여 심판 등의 다양 한 금융 지원. EP/K011685/1, EP/K024485/1)와 JH;에 대 한 대학원 재학 Leverhulme 트러스트 (롤플레잉-2014-292); Wellcome 신뢰 기관 전략적 지원 기금 (105610/Z/14/Z); 영국 문화원 (216196834); 그리고 맨체스터 대학의 맨체스터 연구소 (하루 펌프 못쓰게 기금)와 박사 안드레아스 리브 (Nanosurf AG)에 의해 남서 기술 원조에 대통령 박사 장학금 대학에 대 한 또한 기꺼이 인정 했다.

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</ol>

정렬 알고리즘 및 소프트웨어에 의해, 개발 되었다 고 독점, 맨체스터 대학. 그것은 http://www.click2go.umip.com/에서 다운로드할 수 있습니다.

이 프로토콜 nanolithographic 대형에 높은 균일성 및 제어 기능 크기 패턴화 빠르게 수행 하기 위해 편리한 방법을 사용자에 게 제공 하는 역할 (cm2) 지역. 이러한 큰 지역 nanopatterns 베어링 기판 다양 한 응용 프로그램에 대 한 더 정교 수 다음. 이 기술의 주요 응용 프로그램 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 nanofabricated 표면에의 세대입니다. 이 보고서는 nanofabricated 기판에 의해 hMSC 형태학의 제어를 보여주는 이러한 자료에 세포 배양의 몇 가지 설명을 예를 보여줍니다.
이 프로토콜의 주요 원동력은 허용 매우 균일 하 고 높은 처리량 생산 기능의 표면, 세포 배양 실험의 급속 한 회전율을 가능 하 게 나노 해상도 아래에 정렬 절차 (4 단계)의 자동화. 이 정렬 알고리즘을 사용 하 여 실시 하는 폴리머 펜 리소 약 30 분 이내 나노 기능을 생성 할 수 있다. 그러나 재현성 및 자동된 정렬의 정확도 그리고 이렇게 꽃무늬 기능의 균일성은 프로브 배열의 품질에 따라 (단계 1 및 2)를 생산 하는 비판적 이다. 무딘, 손상 또는 누락 된 프로브; 귀착되는 그들의 준비에 어떤 결함 갇힌된 공기 등 거품 (1.5 단계) 또는 마스터 (단계 1.8)에서 프로브의 부적절 한 분리는 부정확 한 정렬 및 품질이 리소 그래피에서 발생할 수 있습니다.
이 포스 피드백에 의존 하는 다른 정렬 방법 함께 제한을 공유 하는 방법 보고. 표면 접촉 프로브는 때의 정확한 결정은 주변 환경 및 샘플 무대의 움직임으로 인 한 배경 진동에 대 한 계정이 필요에 의해 제한 됩니다. 일반적으로 센서 µN 정권 (이 경우 2 µN)에 있는 힘 감도 있지만 정렬 알고리즘은만 어떤 '오판' resul 피하기 위해 프로브, 표면 사이의 확실 한 접촉으로 적어도 490 µN의 힘을 등록 하도록 배경 잡음 으로부터 ting 보통. 13 따라서,이 메서드는 큰 특징 (1-2 µ m)를 생산 하 경향이 있다. 프로브 z에 큰 거리를 확장 해야 합니다 이후-축 (결과 높은 힘)와 연락처를 등록 하기 위하여. 보상 하기 위하여 더 작은 기능 z를 줄임으로써 생성 될 수 있습니다-축 거리 여행 단계에서 리소 그래피 (예를 들어, 5 µ m 대신 3 µ m로 '검은' 설정 단계 5.2.3.2에서에서 입력).
그럼에도 불구 하 고, 심지어이 제한 자동화 알고리즘은 병렬화 스캐닝 프로브 리소 그래피 방법의 응용 프로그램에서 중요 한 측면을 해결할 수 정렬 가장 시간을 요구 하 고 부정 확 한 단계에 이전 되면서는 이러한 기술 구현 합니다. 지금이 자동화 석판 작성 자체는 정렬에서 제조 프로세스의 속도 제한 단계를 이동 합니다. 이 프로토콜은 ppl이 정렬 절차의 응용 프로그램을 보여 줍니다, 하는 동안 프레임 워크 다양 한 지질 DPN26 매트릭스를 이용한 리소 그래피27 뿐만 아니라 잠재적인 미래 촉매 SPL 기법에 적용 될 수 있습니다. 프로브 시스템입니다. 28

나노기술에서 발전 기술 효율적이 고 안정적으로 표면에 나노 기능 조작 능력의 개발에 따라 달라 집니다. 1 , 그러나 2 , 등을 생성 하는 것은 큰 지역 (여러 cm2) 안정적으로 기능과에서 상대적으로 저가 아닌 사소한 것은 노력 이다. 대부분 기존 기술, 반도체 산업에서 파생 된 '하드' 자료 조작 하 절제 사진 평판에 의존 합니다. 더 최근에, 스캐닝 프로브 현미경 (SPM)에서 파생 된 석판 기법 나노 디자인의 신속한 프로토 타입에 대 한 편리 하 고 다양 한 방법으로 떠오르고 있다. 3 SPM 기반 기술을 편리 하 고 빠르게 '쓰기' 어떤 사용자 정의 패턴 수 있습니다. 이들 중 가장 유명한 딥 펜 나노리 (DPN) Mirkin 외.,4 스캐닝 프로브 패션 글을 유사한 기능을 생산 하는 표면에 분자 '잉크'를 전송 하는 '펜'으로 사용 됩니다 어디에 의해 개척 이다. 주위 조건 하에서 조사는 표면에 걸쳐 스캔으로 '잉크' 분자는 표면를 통해 에 전송 됩니다 프로브 및 표면 (그림 1) 사이 형성 하는 물 초승달 모양. DPN 따라서 다양 한 자료를 포함 한 '부드러운' 생체 고분자 등의 nanolithographic 증 착을 수 있습니다. 5 관련된 기술 공학 유체 배달 채널 프로브를 사용 하 여 각종 라고도 'nanopipettes'와 '나노-만년필' 또한 보고 되었습니다. 6 , 7 , 8
SPM 파생 리소 그래피의 광범위 한 응용 프로그램에 주요 장애물은 처리량, 단일 프로브 패턴 센티미터 규모 영역에 지나치게 오랜 시간이 필요 합니다. 이 문제를 해결 하려면 초기 노력 ' 한-차원 '과 '2 차원' (2D) 프로브 배열 센티미터 크기의 지역의 리소 그래피에 대 한 보고 되 고 캔틸레버 기반 DPN의 병렬화에 집중 했다. 5 , 그러나 9 , 이러한 캔틸레버 어레이 상대적으로 복잡 한 다단계 제조 방법을 통해 생산 되며 상대적으로 깨지기 쉬운. 폴리머 펜 리소 그래피 (PPL)의 발명 소프트 실록 탄성 프로브는 유리 슬라이드에 보 세의 2D 배열 표준 SPM 캔틸레버를 대체 하 여이 문제를 해결. 10 비용 및 나노리 애플 리 케이 션의 넓은 범위를 개방, 넓은 영역을 패턴화의 복잡성이 간단한 프로브 설치는 크게 감소 합니다. 이 외팔보 무료 아키텍처 또한 하드 팁 소프트 봄 리소 그래피,11 하드 실리콘 팁 주는 소프트를 사용 하 여 생산 하는 패턴에 비해 향상 된 해상도와 부드러운 탄성 지지의 하이브리드를 제공 하도록 확장 되었습니다. 고무 팁입니다.
이러한 2D 배열 기술의 실행에 중요 한 요소는 프로브 배열 정확 하 게 평행 해야 표면 기판 리소 그래피를 활용 하면 모든 프로브 표면 접촉 되도록 동시에입니다. 심지어 작은 오차 발생할 수 있습니다 기능 크기에서 큰 차이 배열의 1 개의 측에서 다른, 이후 일부 프로브 것 이다 접촉 표면 배열, 하강 하는 동안 이전 이후 또는 전혀 다른 접촉으로 올 것 이다 하는 동안. 12 이전 표면 접촉 프로브 압축 될 정확한 맞춤 부드러운 탄성 중합체 프로브 deformability 때문 PPL로 특히 중요 하다 표면에 큰 발자국을 떠나.
PPL에 대 한 초기 작업 정렬 프로세스, 그들은 표면에 접촉으로 주어졌다 피라미드 프로브 변형의 관찰을 배열 위에 장착 된 카메라를 사용 하 여 순전히 시각적인 검사를 고용. 10 맞춤 프로브의 측면을 먼저, 표면 접촉으로 온 관찰 하 고 다음 각도 조정 하 고 접촉 프로브 양쪽에 차이 때까지 반복 방식으로 절차를 반복 하 여 판단 했다 눈에 구별. 이 정렬 프로시저 연산자에서 주관적인 육안 검사에 의존, 재현성이 낮습니다.
그 후, 좀 더 객관적인 접근 개발 되었습니다, 기판의 표면에 프로브 접촉 시 적용 되는 힘 측정 아래 장착 힘 센서의 구성. 12 맞춤 따라서 모든 프로브 동시에 접촉에 지적 발휘, 힘을 최대화 하기 위해 경사 각도 조정 하 여 달성 되었다. 이 방법은 표면 병렬의 0.004 ° 이내에 맞춤 가능 했다 보여주었다. 이 '힘 피드백 평등 화'는 지금 두 개의 독립적인 보고서에 완전 자동화 된 시스템으로 구현 되었습니다. 13 , 14 모두 탑재 기판 아래 또는 위에 배열 하는 힘 센서의 트라이 어 드를 사용 하 고 프로브 배열 및 표면 사이의 접촉 시가 해지는 힘의 양을 측정. 이러한 시스템 제공 높은 정밀도, 1cm 길이 규모,14 또는 ≤ 0.0003 ° 1.4 cm.13 이러한 자동된 맞춤 시스템 제공을 통해 주요 절감 연산자 시간과 완료에 소요 된 전체 시간 ≤0.001 °의 부정합을 보고는 리소 그래피 과정입니다.
이 기술에 의해 사용 하는 높은 처리량 표면 제조의 주요 응용 프로그램은 셀 문화 기판의 세대입니다. 지금은 잘 설립 초기 세포 표면 기능, 상호작용을 제어 하 여 그 세포 표현 형을 조작할 수 있습니다 그리고이 나노 크기에서 강화 될 수 있다. 15 특히 스캐닝 프로브 리소 그래피 방법은 표시 되었습니다 다양 한 nanofabricated 표면 같은 세포 배양 실험에 대 한 생산 하는 손쉬운 방법. 16 예를 들어 자기 조립된 monolayers와 세포 외 기질 단백질 PPL와 DPN 템플릿 소재 나노 수정 자료의 가능성을 공부 하 사용 되었습니다의 나노 패턴을 제시 하는 표면 유도의 차별화 줄기 세포입니다. 17
이 프로토콜 수정된 원자 힘 현미경 (AFM) 시스템입니다 큰 지역 PPL의 활용을 설명 합니다. 우리 선발 프로브 표면 접촉, 반복적인 정렬 프로세스를 자동화 하는 함께 결정 하는 수단으로 여러 힘 센서를 사용 하 여 힘의 탐지. 세포 외 기질 단백질 fibronectin 이러한 패턴의 후속 기능화와 인간 중간 엽 줄기 세포 (hMSC)의 문화는 설명, PPL 조작 표면 세포 배양에 대 한 적용의 데모.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexAFM은 전동 5축(XYZ&Theta; &파이;) 번역 및 측각계 단계</td><td>NanoSurf</td><td>P40008</td><td></td></tr><tr><td>AFM 제어 소프트웨어</td><td>NanoSurf</td><td>C3000</td><td></td></tr><tr><td>조각 펜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225568</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick 플라즈마</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>PlasmaFlo</td><td>Harrick 플라즈마</td><td>PDC-FMG-2</td><td></td></tr><tr><td>이코노미 건조 산소 서비스 펌프</td><td>Harrick 플라즈마</td><td>PDC-OPE-2</td><td></td></tr><tr><td>튜브 로테이터</td><td>스튜어트</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>진공 데시케이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 정수 시스템</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ015WW</td><td></td></tr><tr><td>모듈식 습도 발생기</td><td>proUmid</td><td>MHG32</td><td></td></tr><tr><td>Proline Plus Pipette 100-1000 &micro; L</td><td>Sartorius</td><td>728070</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 마스터</td><td>NIL 기술</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>직립 스냅샷 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>현미경 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>10x 및 60x UPlan FLN &infin;/-/FN 26.5</td><td></td></tr><tr><td>정립 명시야 현미경</td><td>Leica</td><td>DM 2500M</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>주식회사 울트라웨이브</td>자동 정렬 결과 기록 및 침투를 위한 <td>U95</td><td></td></tr><tr><td>스프레드시트</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34863</td><td>가연성</td></tr><tr><td>현미경 실드, 투명, 지상</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>451000</td><td></td></tr><tr><td>(7&ndash; 8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane 공중합체, 트리메틸실록시 말단</td><td>Gelest</td><td>VDT-731</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5,7-테트라메틸-1,3,5,7-테트라비닐시클로테트라실록산</td><td>Gelest</td><td>SIT7900.0</td><td></td></tr><tr><td>Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>479527</td><td>HARMFUL, TOXIC</td></tr><tr><td>(25&ndash; 35% 메틸히드로실록산)-디메틸실록산 공중합체, 트리메틸실록산 말단</td><td>Gelest</td><td>HMS-301</td><td></td></tr><tr><td>계량 보트 100mL</td><td>과학 실험실 용품</td><td>BALI828</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Appleton Woods</td><td>KS230</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ST10-031T</td><td></td></tr><tr><td>접착 탄소 테이프</td><td>Agar scientific</td><td>AGG3939</td><td></td></tr><tr><td>16-Mercaptohexadecanoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448303-1G</td><td>유해하고 독성이 있는</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td>가연성</td></tr><tr><td>금 코팅 현미경 슬라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>643203</td><td>한 번 개봉하면 금은 최소 1개월</td></tr> <tr><td></td><td>동안 티올에 반응성을 유지합니다.Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>유해한, 독성</td></tr><tr><td>철(III) 질산염 비수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529303</td><td>유해한, 독성</td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84415</td><td>유해한, 독성</td></tr><tr><td>(11-Mercaptoundecyl)hexa(에틸렌 글리콜)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675105</td> 인간 혈장에서 유<td>해하고 독성이 있는</td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>코발트(II) 질산염 육수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>203106</td><td>유해하고 독성이 있는</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM 중간엽 줄기세포 성장 매체</td><td>Lonza UK</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>인간 중간엽 줄기</td>세포 <td>Lonza UK</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>헤레우스 멀티퓨지 X1 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td>유해하고 독성이 있는</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td> <td>원고의 "세제"</td></tr><tr><td>VECTASHIELD DAPI 벡터를 사용한 안티페이드 마운팅 배지</td><td> 실험실</td>: <td>H-1200</td><td></td></tr>, <tr><td>토끼, 항피브로넥틴 항체</td>, <td>Abcam</td>, <td>ab2413</td><td></td></tr>, <tr><td>염소, 항토끼, IgG(H+L), 2차 항체, Alexa, Fluor 594</td>, <td>Thermo, Fisher Scientific</td>, <td>R37117</td><td></td></tr>, <tr><td>소 혈청, 알부민</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>A3912</td><td></td></tr>, <tr><td>12웰 플레이트</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>, 10253041</td><td></td></tr>, <tr><td>T75 조직 배양 플라스크</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790113</td><td></td></tr><tr><td>캔틸레버</td><td>BudgetSensor</td><td>ContAl-G</td><td></td></tr></tbody></table>

큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

스캐닝 프로브 현미경 다양 한 나노미터 스케일 기능 건설 ('첨가제') 하향식 제조 방법의 창조를 수 있게 되었습니다. 역사적으로, 스캐닝 프로브 리소 그래피의 주요 단점은 단일 프로브 시스템의 본질적으로 낮은 처리량 되었습니다. 이 배열의 증가 나노리 처리량 수 있도록 여러 개의 프로브를 사용 하 여 태 클 되어 있다. 이러한 병렬된 나노리를 구현 하기 위해 기판 표면 프로브 배열의 정확한 줄 맞춤은 중요 한, 모든 프로브 있도록 리소 그래피 패터 닝 시작 하는 때에 동시에 표면에 접촉. 이 프로토콜 센티미터 크기의 지역, 프로브 배열, 정확, 신속 하 고 자동 맞춤 알고리즘의 사용에 의해 촉진 된 나노미터 스케일 기능을 생산 하기 위해 폴리머 펜 리소 그래피의 활용을 설명 합니다. 여기, 나노리 골드 기판에 thiols의 높은 균등 성에 생성 기능을 보여 줍니다. 이러한 패턴은 다음 기능성 표면 감독 셀 형태학 연구의 맥락에서 사용 하기 위해 fibronectin 함께.

자동된 맞춤 성공 했다 여부 확인, (단계 4.8에서에서 스프레드시트)의 맞춤 데이터에서 플롯 그래프 시험 되었다. 맞춤 과정 성공 했다 어디에 해당 하는 샘플 단계 θ와 φ 축 따라 기울어져 되었습니다 있다 각도 두 개의 플롯 일련의 상승 및 하강 하는 데이터 요소를 보여주었다. 음모의 각 데이터 포인트의 2 개의 선형 맞는 보였다 "피크" 최대 z를 나타내는 잘 정의 된 교차-확장 및 해당 각도를 맞춤은 달성 (그림 4A 및 4B). 이 과정은 반복된 4 시간 (즉, 각 축에 대 한 두 번)와 4 개의 좌표 집합으로 꾸몄다. 좌표의 각 쌍의 교차로 따라서 전반적으로 최적의 각도 (그림 4C)을 보여 줍니다. 13 경우 맞춤은 성공 하지, 그것은 관찰할 수 있습니다 그들의 해당 θ와 φ 각도 플롯 좋은 품질 선형 적합에 영향을 주지 않는다 또는 (그림 5) 교차 하지 않습니다. 같은 실패 한 정렬 잘못 손질 또는 프로브 홀더 (단계 1.7, 1.8, 2.2)에 장착 되 고 배열 결과로 일반적으로 있다. 이 경우 배열 삭제 된 새로운 하나를 준비 하 고 (단계 1 및 2)를 탑재, 그리고 맞춤 과정 (4 단계)를 반복.
성공적인 정렬 및 ppl MHA와 리소 그래피, 패턴된 골드 기판 했다 다음 측면 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 증 착 했다 자리를 차지 하 고 있다 여부를 확인할 하 몇 군데. 인쇄 표면의 더 큰 지역 시험 또한 입금된 thiol (그림 6 및 그림 7)에 의해 보호 되지 골드의 에칭 후는 기판의 광학 현미경에 의해 실시 되었다. 그러나, 에칭된 패턴 추가 기능화에 사용할 수 없습니다 그리고만 인쇄 표면 기판의 배치의 대표 샘플에 패턴을 확인 하는 데 사용 한다. 에칭된 패턴 개별 펜 (그림 8)에 해당 하는 빈 영역을 표시,이 결과 프로브 배열의 생산 성공적으로 완료 하지 않은 그리고 몇몇 프로브는 손상 되거나 손실 된 나타냅니다. 프로브의이 이질성이 어디 perfluorinated 코팅은 마모 (1.3 단계)는 옛 마스터의 사용 될 수 있습니다 일부 프로브 배열 마스터에서 분리 될 때 멀리 찢어진 되 고 그 결과. 이러한 경우에는 새 마스터를 사용 해야 합니다. 거품 유리 백업 및 마스터 (1.5), 단계 사이 갇혀 또는 경우 프로브 배열 하지 완전히 분리 된 마스터에서 (단계 1.8) 치료 후 결과 공기의 존재로 인해 수도 있습니다.
Fibronectin 기능성된 표면 incubated hMSCs는 또한의 형광 현미경 이미지 수집 (그림 9). 일반적으로, 모든 기판 했다 생체 외에서 문화 환경 내에서 안정 하 고 셀 준수 작은 고립 된 20 x 20 배열 기능의 경우 인쇄 패턴에 그들의 형태를 적응.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> 그림 1입니다. 프로브 팁에 물 초승달 모양 분자 잉크 전송 통해 보여주는 폴리머 펜 리소 그래피의 도식 대표. (A) 측면도 및 (B) 고분자 펜 배열 평면도 프로브 배열 및 표면 기판 완벽 하 게 정렬 하 고 때 모든 프로브 접촉 표면 동시에 병렬된 리소 그래피 결과 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> 그림 2입니다. 폴리머 펜 리소 그래피의 회로도 설정 최대 (A) 확장된 측 준비 조사 배열 홀더 프로브에 연결 되 고 AFM 스캐너에 장착 되 실험 설정 보기 기판에 스테이지에 배치, 위치는 아래 3 개의 힘 센서. (샘플 단계 상대적인 AFM 스캔 헤드를 보여주는 조립된 계측 B) 한 표현입니다. (C) 아래 보기 힘 센서 위치를 보여주는. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> 그림 3입니다. 회로도 표현을 정렬 절차에 대 한 분광학 프로그램 묘사. AFM 스캐너는 10 µ m 100 ms 이내 250 ms에 대 한 위치에서 개최 100 ms 이내 10 µ m의 철회 및 끌어 넣어진된 위치에서 250 ms에 대 한 개최의 거리에 의해 샘플을 향해 프로브를 이동 하도록 설정 됩니다. 모션 다음 맞춤 과정을 통해 반복 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> 그림 4입니다. 그래프 보여주는 성공적인 정렬. ● 실제 값 측정 및 + 최고를 나타냅니다을 나타냅니다에 대 한 기울기 각도 (A) θ 그리고 φ (B) 성공적인 정렬에 대 한 z 위치의 그래프 최소 제곱법과 적합. (C) φ θ에 대 한 그래프 장착 각도 4 점 최대 z 위치에 도달 했다. 교차점 표시 두 축에 걸쳐 최종 최적 기울기 각도입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> 그림 5입니다. 실패 한 줄 맞춤을 설명 하는 그래프. ● 실제 값 측정 및 + 최고를 나타냅니다을 나타냅니다에 대 한 기울기 각도 (A) θ 그리고 φ (B)는 실패 한 정렬에 대 한 z 위치의 그래프 최소 제곱법과 적합. (C) φ θ에 대 한 그래프 장착 각도 4 점 최대 z 위치에 도달 했다. 아니 분명 옵 티 마 또는 교차점 관찰 되 고 따라서 최적의 정렬 각도 확인 되지 않습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> 그림 6입니다. 설명 광학 현미경, 원자 힘 현미경 이미지 MHA 패턴 정렬된 PPL 배열 하 여 되었고 다음 에칭 골드 기판의. (A)와 (B)는 순차적으로 확대 광학 현미경 이미지 에칭 패턴; (C)는 패턴의 단일 격자의 AFM 지형 이미지. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> 그림 7입니다. MHA 패턴 정렬된 PPL 배열 하 여 되었고 다음 에칭 골드 기판의 설명을 광학 현미경 이미지. (A) (B)는 순차적으로 확대 광학 현미경 에칭된 패턴의 이미지와 (C)는 낮은 확대 이미지 균질 패턴 큰 영역 표시입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> 그림 8입니다. 하 여 균등 하지 MHA 패턴 다음 에칭 골드 기판의 설명을 광학 현미경 이미지. (표시는 삽입) 의도 패턴 z증가 제작한 모든 두 라인 20 줄 정렬 20 도트 라인의 격자를 반복 했다-1 µ m (5에서-5 µ m에 배열 되는)에 의해 축 확장. 그것은 그 일부 지역에서 아무 패턴 생성 되, 그 위치에 누락 된 프로브 때문 볼 수 있습니다. 점의 두 라인은 생산 영역에서이 결과 나타냅니다 프로브는 존재 하지만 그것은 완벽 하 게 작동 프로브와 같은 높이의 유일한 예금 배열의 전체 z확장 기능-축 거리. 이 이미지에서 대비 의도적으로 부분적으로 인쇄 영역의 관찰 수 있도록 변경 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> 그림 9입니다. PPL에 의해 템플릿 fibronectin 배열에 경작 하는 hMSCs의 Epifluorescence 현미경 이미지. (A)와 (B)는 고배율 이미지 표시 개별 셀. (C) 셀와 (D)은 (인쇄 된 패턴의 회로도 속지에도 표시) 그리드 배열에서 경작 하는 세포의 넓은 필드 이미지를 부착 하지 않고 fibronectin 배열의 예제 패턴 보여준다. 셀은 fibronectin (빨강), F-말라 (녹색)으로 표시 하 여 세포 핵 (블루) 얼룩이 있습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 선물이 광역 스캐닝 프로브 나노리 프로브 배열의 반복 정렬 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 리소 그래피 패턴의 활용에 의해 사용에 대 한 프로토콜.

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

나노미터 크기의 특징과 물체를 생성하기 위한 편리한 도구가 많이 필요하며, 특히 나노 구조 물질 및 표면과의 생물학적 상호 작용 연구에서 그렇습니다. 이 프로토콜은 나노 단위 분해능으로 센티미터 규모의 영역에서 단백질 어레이를 빠르고 균일하게 복제할 수 있습니다. 이를 통해 이러한 표면에서 중간엽 줄기 세포의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.이러한 모델 표면을 통해 특정 재료 변수와 중간엽 줄기 세포 간의 제어된 상호 작용을 검사할 수 있으며, 이는 향후 생체 재료 설계에 영향을 줄 기본 재료 설계 기준을 제공합니다. 절차를 시작하려면 계량 보트에서 PDMS 프리폴리머의 구성 요소를 철저히 혼합하십시오. 진공 데시케이터에서 20분 동안 또는 모든 가스 기포가 사라질 때까지 혼합물의 가스를 제거합니다.그런 다음 PPL 어레이용 실리콘 마스터를 4cm 페트리 접시에 놓습니다. 가스가 제거된 PDMS 프리폴리머 혼합물을 완전히 덮일 때까지 마스터 위에 붓습니다. 다시 5분 동안 마스터를 덮고 있는 PDMS의 가스를 제거합니다.가스를 제거하는 동안 1분 동안 산소 플라즈마로 유리 슬라이드를 처리합니다. 탈기 후 처리된 면이 아래를 향하도록 슬라이드를 PDMS에 조심스럽게 놓습니다. 슬라이드를 실리콘 마스터에 부드럽게 눌러 갇힌 공기를 제거하고 마스터와 슬라이드 사이에 PDMS의 균일한 층이 끼워지도록 합니다.샌드위치된 PDMS 어레이를 실리콘 마스터가 바닥에 있는 다른 페트리 접시로 옮깁니다. PDMS를 섭씨 70-80도의 오븐에서 24-48시간 동안 경화시킵니다. 그런 다음 오븐에서 경화된 PPL 어레이를 제거하고 15분 동안 식히십시오.면도날을 사용하여 유리 슬라이드의 뒷면과 측면에서 과도한 PDMS를 조심스럽게 다듬습니다. 건조 질소 가스 흐름으로 느슨한 PDMS 파편을 불어냅니다. 정확한 정렬을 위해 어레이의 뒤쪽과 가장자리에서 과도한 PDMS를 잘라내는 것이 중요합니다.이는 또한 사용자가 리소그래피 중에 AFM에서 프로브의 상태를 더 잘 관찰하는 데 도움이 됩니다. 면도날을 1mm 깊이의 어레이 모서리에 끼우고 한 번의 연속 리프팅 동작으로 실리콘 마스터에서 어레이를 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음 면도날로 어레이 가장자리에서 PDMS를 0.5mm 조심스럽게 자르고 긁어냅니다.사용자는 마스터에서 어레이를 들어 올릴 때 양호한 분리를 보장하고 프로브 손상을 방지하기 위해 매우 주의해야 합니다. 이것은 어레이가 실리콘 마스터로 다시 떨어지지 않고 하나의 부드러운 동작으로 수행되어야 합니다. PPL 어레이를 산소 플라스미드로 30초 동안 처리한 다음 20마이크로리터의 탈이온수를 어레이 표면에 떨어뜨립니다.물이 전체 어레이에 고르게 퍼지지 않으면 플라즈마 처리를 반복하십시오. 플라즈마 처리된 어레이를 완전히 건조시킨 다음 양면 탄소 테이프를 사용하여 어레이를 원자력 현미경 프로브 홀더에 부착합니다. 프로브 홀더를 AFM 운동학 홀더에 장착합니다.어레이에 잉크를 칠하려면 에탄올에 든 1밀리몰 MHA 용액을 20마이크로리터 방울 떨어뜨려 파이펫 팁과 어레이 표면 사이의 접촉을 피합니다. MHA 솔루션이 어레이 전체에 퍼질 수 있도록 합니다. 에탄올이 증발할 때까지 기다립니다.PPL 어레이가 있는 프로브 홀더를 AFM에 장착한 다음 AFM 샘플 스테이지 중앙에 금 기판을 놓습니다. 접착 테이프로 기판을 제자리에 고정합니다. 정렬을 시작하려면 스테이지 컨트롤러 설정 프로그램을 실행하여 모든 축과 각도를 사전 보정된 영점으로 재설정합니다.AFM 샘플 스테이지 X 및 Y축 제어 콘솔을 사용하여 기판을 원하는 인쇄 위치로 이동합니다. 스테이지 릴리스 레버를 전환하여 샘플 스테이지를 해제하고 힘 센서를 활성화합니다. 센서가 최소 15분 동안 평형을 이룰 때까지 한 다음 Z축 컨트롤러를 사용하여 어레이가 시각적으로 기판에 최대한 근접할 때까지 샘플 스테이지를 올립니다.어레이가 기판에서 1mm 이내에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 자동 정렬 프로그램을 엽니다. 각도 단계, 거친 단계 거리 및 미세한 단계 거리를 입력합니다.스프레드 시트 파일 경로를 설정하고 스프레드 시트 템플릿을 첨부합니다. 그런 다음 AFM 제어 소프트웨어를 열고 분광학 섹션으로 이동합니다. 스캔 헤드 Z축 진동을 100밀리초 동안 10마이크로미터 확장하고, 250밀리초 동안 유지하고, 100밀리초 동안 10마이크로미터 후퇴하고, 250밀리초 동안 유지하도록 구성합니다.스캔 헤드 진동을 시작하고 자동 정렬을 실행합니다. 소프트웨어에 정렬이 완료되었다고 표시되면 정렬 프로세스를 종료합니다. 정렬 데이터의 자동 생성된 선형 맞춤을 검사하여 정렬이 성공적이었는지 확인하고 전반적인 최적 각도를 식별한 다음, AFM 탑뷰 카메라로 어레이와 기판 간의 접촉이 관찰될 때까지 샘플 스테이지를 500나노미터 단위로 올립니다.AFM 제어 소프트웨어에서 Stop을 클릭하여 어레이를 10마이크로미터 후퇴시킵니다. PPL 프로세스를 시작하려면 AFM 제어 소프트웨어의 리소그래피 섹션을 엽니다. Z-modulation 작동 모드를 선택하고 가져올 리소그래피 패턴으로 이동합니다.생성할 패턴의 크기를 입력합니다. X축과 Y축 모두에서 원점 오프셋을 25마이크로미터로 설정한 다음 Modulation Absolute Z 위치를 선택하고, 계측기를 두 개의 레이어로 단순화하도록 설정하고, 검은색 및 흰색 값을 각각 5 및 음수 5마이크로미터로 설정합니다. 확인을 클릭하여 설정을 적용하고 창을 닫습니다.리소그래피 창에서 레이어 편집기를 열고 일시 정지 시간을 설정합니다. 다음으로, 대기 격리 챔버를 AFM으로 낮추고 제어 소프트웨어를 엽니다. 상대 습도 45%, 온도 25°C, 대기 교환 유량 500밀리리터로 설정합니다.설정을 구현하고 원하는 습도 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 그런 다음 리소그래피 시퀀스를 시작합니다. 리소그래피가 완료되면 스테이지를 500마이크로미터 후퇴시킵니다.대기 격리 챔버를 제거합니다. 샘플 스테이지를 잠궈 힘 센서를 비활성화합니다. 마지막으로, 시각화 또는 추가 처리를 위해 스테이지에서 기판을 제거합니다.PPL은 미세 어레이 그리드 또는 상세 이미지의 대규모 균질 패턴을 생성하는 데 사용되었습니다. 패턴은 증착된 티올로 보호되지 않는 금을 에칭하여 광학 현미경을 위해 시각화되었습니다. 불규칙한 패턴은 프로브가 손상되었거나 누락되었음을 나타냅니다.PPL이 함유된 금에 프린팅된 MHA 어레이는 피브로넥틴으로 기능화되고 인간 중간엽 줄기세포로 배양되었습니다. 개별 세포는 피브로넥틴 기능화 배열을 고수하여 필요할 때 패턴에 맞게 형태를 조정했습니다. 이 PPL 기술은 세포 생물학 실험을 위한 광범위한 단백질 패턴을 증착하는 데 사용할 수 있습니다.능숙한 사용자는 약 3시간 안에 표시된 것과 같은 패턴을 생성할 수 있습니다. 꼼꼼한 어레이 준비가 성공의 열쇠라는 것을 기억하십시오. PPL 기술은 매우 일반적이며 소분자에서 고분자 및 생체 분자에 이르는 화합물의 증착에 사용할 수 있어 화학, 생물학 및 재료 과학 분야의 다양한 연구를 위한 길을 닦습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

이 비디오는 단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 영상을 보여줍니다. 미세유체 설정과 펩타이드 결합 플라즈몬 나노구조 칩을 사용하여 공명 각도에서 반사광 강도의 변화는 단일 세포에서 분비된 단백질과의 상호 작용을 보여줍니다.

단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 이미징

이 프로토콜에서는 모세관 힘 리소그래피를 사용하여 두 개의 별개의 고분자 재료로 만든 생체 모방 심장 세포 배양 하층의 제작을 보여줍니다.  설명된 방법은 in vitro 및 in vivo 응용 프로그램을 위해 거시적 심장 조직의 구조와 기능을 엔지니어링할 수 있는 확장 가능하고 비용 효율적인 기술을 제공합니다.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

콜로이드 프로브 나노스코피는 다양한 분야에서 사용하여 콜로이드 시스템의 물리적 안정성과 응고 역학에 대한 통찰력을 얻고 생물학적 시스템을 사용하여 약물 발견 및 제형 과학을 지원할 수 있습니다. 에 설명된 방법은 이러한 시스템을 연구하기 위한 양적 및 질적 수단을 제공합니다.

콜로이드 프로브 Nanoscopy을 사용하여 입자 간 상호 작용의 양적 및 질적 시험

우리는 표면 패터닝을 위한 스캐닝 터널링 현미경의 원자 계측과 선택적 원자층 증착 및 반응성 이온 에칭을 결합하기 위한 프로토콜을 보고합니다. 수많은 대기 노출 및 운송을 포함하는 견고한 프로세스를 사용하여 원자 계측을 갖춘 3D 나노 구조를 제작합니다.

원자 추적 가능한 나노 구조 제작

간 셀룰러 통신은 내부와 세포 외부의 각종 생리 활성 조절에 중요​​하다. 이 논문은 단일 세포 분비물의 시공간적 특성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이를 달성하기 위해, 종합 접근법 생균 이미징 감지 라벨없는 nanoplasmonic을 통합하는 데 사용된다.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

세포 거동의 나노 지형학적 조절을 연구하기 위해 작은 나노 패턴 주형에서 넓은 면적의 나노 패턴 기판을 생산하는 프로토콜이 제시됩니다.

셀 동작의 Nanotopographical 변조를위한 나노 패턴 기판 사용 스티치 기법을 확장

우리는 두 개의 널리 사용 전자 빔 레지스트에 자리 나노미터의 패턴을 정의 하는 수 차 수정 스캐닝 전송 전자 현미경 사용: 폴 리 (메 틸 메타 크리 레이트)와 수소 silsesquioxane. 저항 패턴 자리 나노미터 충실도 발사, 플라즈마 에칭를 사용 하 여 선택의 대상 재료에 복제 될 수 있습니다 및 저압에 의해 침투를 저항.

자리 나노미터 전자 빔 리소 그래피는 수 차 수정 스캐닝 전송 전자 현미경으로

우리는 나노 아키텍처를 피질 내 미세 전극 장치로 에칭하면 염증 반응을 감소시킬 수 있으며 전기 생리학적 기록을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었습니다. 본 명세서에 기재된 방법은 나노-아키텍처를 비기능적이고 기능적인 단일 생크 실리콘 의 표면에 에칭하는 접근법을 설명한다.

마이크로 전극에 에칭 나노 아키텍처에 초점을 맞춘 이온 빔 리소그래피

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

나노 단위 분해능의 대규모 샘플 검사는 특히 나노 가공 반도체 웨이퍼의 경우 광범위한 응용 분야에 사용됩니다. 원자력 현미경은 이러한 목적을 위한 훌륭한 도구가 될 수 있지만 이미징 속도에 의해 제한됩니다. 이 작업은 AFM의 병렬 액티브 캔틸레버 어레이를 활용하여 높은 처리량과 대규모 검사를 가능하게 합니다.

고처리량 대규모 시료 검사를 위한 Quattro-Parallel Cantilever 어레이를 사용한 Active Probe Atomic Force Microscopy

배우세요 광역 스캐닝 프로브 나노리소그래피를 이용하여 균일한 단백질 어레이를 제작하고 간엽줄기세포와 나노구조 표면의 상호작용을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 생체재료 설계에 중요한 기준을 제공합니다.

큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진

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