Name: 단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 단일 세포 인덱스 정렬과 내피 세포 공동 배양을 활용한 배아 조혈 줄기 세포 전구체의 클론 분석 방법입니다. 이 기술은 희귀한 HSC 전구체의 특이적 표현형과 이식 가능성을 규명하여 발달 조혈 연구에 기여합니다.

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우리는 프레드 허 친 슨 흐름 Cytometry 코어에 FACS에 앤드류 버거, 스테이 시 Dozono, 그리고 브라이언 라덴을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 보조 공동 그랜트 #HL099997, 그리고 NIDDK 부여 #RC2DK114777 #HL100395, 건강 NHLBI UO1의 국가 학회 교부 금에 의해 지원 되었다. 브랜든 Hadland 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단 희망과 현대 바퀴 기초에 의해 지원 됩니다.

<ol><li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li>
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<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origin+of+the+HSC+hierarchy+reveals+an+SCF-dependent%2C+IL-3-independent+CD43%28-%29+embryonic+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+progenitor+emergence+in+the+murine+embryo+and+yolk+sac+precedes+stem+cell+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection.</a> Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li>
<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li>
<li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+developmental+stage+of+HSC+and+recipient+on+transplant+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes.</a> Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).</li>
<li>Butler, J. M., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+vascular+niche+for+studying+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis.</a> Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).</li>
<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Common+Origin+for+B-1a+and+B-2+Lymphocytes+in+Clonal+Pre-+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).</li>
<li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Single-Cell+Functional+and+Gene+Expression+Analysis+Resolves+Heterogeneity+within+Stem+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li>
<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
<li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li>
<li>Lorsbach, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RUNX1+in+adult+hematopoiesis%3A+analysis+of+RUNX1-IRES-GFP+knock-in+mice+reveals+differential+lineage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression.</a> Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).</li>
<li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf%CE%B2+for+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li>
<li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li>
<li>Inlay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+progenitors+that+emerge+prior+to+hematopoietic+stem+cells+in+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).</li>
<li>Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell-independent+hematopoiesis%3A+emergence+of+erythroid%2C+megakaryocyte%2C+and+myeloid+potential+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo.</a> FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

배아 개발 HSC 창세기 연구 HSC hemogenic 선구자 아직 이식 성인 받는 사람의 장기 multilineage 조 혈 재구성을 제공 하기 위해 능력 부족에서 가능성을 감지 하는 수단을 필요로 합니다. 이 프로토콜에서 선물이 배아 hemogenic 선구자의 클론 분석 결과 혈관 틈새 ECs stromal 공동 문화 지원 HSC에 선구자의 성숙, AGM에서 이식 분석 실험에서 후속 기능 분석. 허가 정렬 하는 인덱스의 phenotypic 매개 변수 사전-HSC 표면 표식으로 정의 된 속성 특성의 회고전 분석 분석 결과에 포함 됩니다. 이 방법은 효율적인 잠재적인 표식에 대 한 검사 수 있도록 다시 aggregation 기반 HSC 분석 실험4,5,10, 전조 인구의 대량 정렬에 의존 하는 다른 방법에 비해 이점을 제공합니다 사전-HSC 각 개별 셀에 대 한 ...

클론 연구 노화1동안 HSC 하위 및 HSC 행동의 변화에 새로운 통찰력을 제공 하는 성인 HSCs의 장기 engraftment 속성에서이 밝혀졌다. 그러나, 배아 HSCs의 비슷한 연구와 그들의 선구자 되었습니다 더 많은 도전. HSCs 과도 과정에서 내 피 hemogenic 라고 알려진 선구자의 인구에서 발생 하는 초기 배아 개발 중으로 조 혈 전환2내 피. 강력 하 고, 장기 이식 조건된 성인 받는 사람에 따라 multilineage engraftment를 제공 하는 그들의 능력에 의해 정의 된 첫 번째 HSC 배아 이날 10.5 (E10.5) murine 태아에 매우 낮은 주파수3 이후까지 검색 되지 않습니다. . 그들의 발전 동안 3300 HSC (pre-HSC) hemogenic 피에서 발생 하는 이식 분석 실험4,5 에서 효율적인 engraftment 허용 성인 HSC의 속성을 획득 하기 전에 성숙 겪어야 한다 , 6. 희귀 HSC 기원, 다양 한 erythroid와 조 혈 창시자의 연구를 왜곡 골수성, 림프 잠재력 사전-HSC7,8에서 HSC의 출현 전에 이미 감지는. 따라서, 다른 조 혈 창시자에서 사전-HSC 구별 방법 clonally 세포를 분리 하 여 이식 분석 실험에서 engraftment 속성을 검색 하기 위해 HSC에 그들의 성숙에 대 한 충분 한 신호를 제공 필요 합니다.
다양 한 접근 HSC에 비보 전 또는 vivo에서 성숙 하 여 사전-HSC의 검출을 허용 하는 기술 되었다. 방법을 ex vivo는 첫 번째 HSC 개발9에서 감지 되는 AGM 지역과 같은 배아 조직의 문화에 달려 있었다. 이 방법, 분리, 통합 하는 프로토콜에 정렬, AGM 조직의 재 집계는 허용 파라 대동맥에 E11.5 E9.5에서 개발 하는 동안 HSC 선구자를 포함 하는 정렬 된 인구의 특성 splanchnopleura (P-Sp) / 관련해 지역4,,510; 그러나, 이러한 방법 클론 분석에 필요한 단일 세포 수준에서 일어나 높은 처리량 분석에 순종 하지 않습니다. 마찬가지로, 신생아 쥐에 이식 하 여 성숙 vivo에서 어디는 microenvironment HSC 선구자의 초기 단계 지원을 위해 더 적합 한 것으로 추정 되는 또한 활성화 노른자위 sac 및 AGM에서 정렬 된 인구의 연구 / P-Sp (P-Sp는 AGM에 선구자 지역) 사전-HSC, 하지만이 방법의 특성을 가진 또한 단일에 대 한 강력한 플랫폼을 제공 하는 실패 세포 분석11,12.
Rafii 외 에서 연구 보여주었다 그 내 피 세포 Akt 활성화 (EC) 기질 성인 HSC 자체 갱신 생체 외에서13,,1415의 지원에 대 한 틈새 기질을 제공할 수 있습니다. 우리는 최근 Akt 활성화 EC 관련해 지역 (AGM-EC)에서 파생 된 hemogenic 선구자, E9 성인 engrafting HSC 개발에서 뿐만 아니라 후속 빠르면 절연의 성숙에 대 한 적합 한 생체 외에서 틈새를 제공 한다 결정 생성 된 HSC16의 자체 갱신. 감안할 때이 시스템 사용 간단한 2 차원 공동 문화, 그것은 개별적으로 고립 된 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력의 클론 분석을 위해 쉽게 적응.
우리는 최근 클론 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력 AGM-EC 공동 문화 및 이식에서 이후의 기능 분석 murine 배아에서 개별 hemogenic 선구자의 인덱스 정렬 결합 하 여 분석 결과에 대 한 접근을 보고 17분석 실험. 인덱스 정렬 세포 형광 활성화의 모드 phenotypic의 모든 매개 변수 (즉, 앞으로 분산형 (FSC-A), 측면 살포 (SSC-A), 형광 매개 변수) 각 개별적으로 정렬된 셀 같은 정렬 (FACS) (인덱스)를 기록 하는이 기능 소급 정렬 다음 후속 기능적 분석 상관 될 수 있다. FACS 소프트웨어 위치/잘 두었다는 96 잘 접시의 각 셀에 대 한 두 phenotypic 정보를 기록 합니다. 이 기술은 이전 우아하게 사용 되었습니다 성인 HSC에서이 확인, 추가 HSC, 장기 engrafting 하위 집합에 대 한 풍부 하 고 연관 HSC의 phenotypic 매개 변수 transcriptional phenotypic 매개 변수 결정 단일 속성 셀 레벨18,19. 여기, 우리는 배아 개발의 초기 단계 동안 독특한 phenotypic 매개 변수 식별 및 사전-HSC의 혈통 기여를 가능 하 게이 방법의 상세한 방법론을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>AGM-EC 배양 배지 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 배양을 위한 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>AGM-EC 단층</td></tr><tr><td>젤라틴 0.1%를 물에서</td> 해리하는 데 사용 <td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>AGM-EC 단층을 플라스틱</td></tr><tr><td>에 접착하는 데 사용96웰 조직 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>AGM-EC 단층 및 인덱스 정렬된 클론</td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS(Phosphate Buffered Saline)</td>를 공동 배양하는 데 사용 <td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>해부 및 FACS 염색에 사용</td></tr><tr><td>500ml 필터 병</td><td>Fisher Scientific</td><td>9741202</td><td>내피 배지</td></tr><tr><td><강력한>AGM-EC 배양 배지(500mls)</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 변형 된 Dulbecco의 매체 (IMDM)</td> <td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 mls</td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 mls</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토 마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마</td><td>H3149</td><td>50 mg을 10 mls 배지</td></tr><tr><td>L- 글루타민 (200 mM)</td><td>에 용해StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>내피 미토겐 (ECGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>10 mls 매체를 추가하여 용해 및 추가</td></tr><tr><td>AGM 인덱스 정렬용 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase(0.25%)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>배아 조직 해리에 사용</td></tr><tr><td>3ml 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td> FACS 0.22 &micro<td>에 대한 필터 항체 용액을 멸균하는 데 사용합니다</td></tr><tr><td>. M 주사기 구동 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td> 세포 여과기 캡이 있는 FACS 5ml 폴리스티렌 튜브<td>용 항체 용액을 멸균하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>352235</td><td>FACS DAPI 이전에 세포 덩어리를 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>(H2O에서 1mg/ml 재고로 준비)</td><td>Millipore</td><td>268298</td> 마우스 CD16/CD32(FcR 블록) <td>정렬에서 죽은 세포를 제외하는 데 사용</td></tr><tr><td>BD</td> <td>Biosciences</td><td>553141</td><td>Fc 수용체에 대한 비특이적 염색을 차단하는 데 사용</td></tr><tr><td><AGM 지수 정렬을 위한 강력한>항체</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD144 PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG1 카파 이소타입 대조군, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>CD144용 이소타입 대조군 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td><td>eBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>CD201 PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG1 카파 이소타입 제어, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>CD41</td></tr><tr><td>PE 안티 마우스 CD45 FITC</td><td>용 이소타입 제어eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>CD45 FITC</td></tr><tr><td>AGM-serum free media(10mls)용 이소타입 제어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10mls</td></tr><tr><td>재조합 쥐 줄기 세포 인자(SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 100 ng/ml</td></tr><tr><td>재조합 human FLT3 리간드 (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 100 ng/ml</td></tr><tr><td>재조합 human thrombopoietin (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 20 ng/ml</td></tr><tr><td>재조합 쥐 인터루킨-3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 20 ng/ml</td></tr><tr><td> 공동 배양 세포 염색용 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트, V-bottom</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>FACS 분석에 사용</td></tr><tr><td>항체 내피 세포와 공동 배양된 인덱스 정렬 클론 분석을 위한 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PE-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>CD45 PerCP-Cyanine5.5</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD201 (EPCR)</td>에 대한 이소타입 제어 PE <td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>CD201 PE</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1)에 대한 이소타입 제어 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Ly-6A/E</td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>F4/80 FITC</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly-6G/C(Gr1) FITC</td>용 이소타입 제어<td>BD Biosciences</td><td>553127</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2b 카파 이소 타입 제어, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Ly-6G / C 및 CD3 용 이소 타입 제어 FITC</td></tr><tr><td> 이식 용 꼬리 정맥 주사 용 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 / 2 ml 인슐린 주사기, 29G 1 / 2 "바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>309306</td><td>이식을위한 꼬리 정맥 주사에 사용</td></tr><tr><td><>translant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td><td>Biolegend</td><td>108426</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP</td><td>Biolegend</td><td>400629</td><td>Isotype Control</td></tr> 후 말초 혈액 분석을 위한 항체 PerCP <tr><td>Anti-mouse F4/80 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>Staining</td></tr><tr><td>쥐 IgG2a 카파 이소 타입 제어, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>F4 / 80 PE</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td>염색</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550992</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2a 카파 이소 타입 제어, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>CD19 APC</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 용 이소 타입 제어</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>CD45.1 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45.2 (104) APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td>염색</td></tr><tr><td>쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-4321-80</td><td>CD45.2 APC-eFluor780에 대한 이소타입 제어</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II with DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II with plate reader</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>세포 계수용</td></tr><tr><td>다중 채널 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td>용 디스펜싱 셀</td></tr><tr><td>FACS 분석 소프트웨어</td><td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 (HSC) 창세기를 공부 하는 능력은 초기 배아에 HSC 선구자의 희귀 한 고 기능의 장기 multilineage engraftment 잠재력을 식별 하는 분석 실험의 부족에 의해 제한 되어 개별 putative HSC 선구자입니다. 여기, 우리가 격리와 단일 세포 수준에서 기능적으로 검증된 HSC 선구자의 방법론을 설명 합니다. 첫째, 우리 활용 개별적으로 정렬 된 각 셀의 정확한 phenotypic 매개 변수 카탈로그 인덱스 정렬 phenotypic 감 적의 조합 실험 분석에 대 한 추가 마커 HSC 선구자에 대 한 풍부 하 게 사용 하 여. 둘째, 각 인덱스 정렬 셀이 공동 지 원하는 multilineage, 장기 engraftment에서 가능성과 기능성 HSC에 HSC 선구자 비 engrafting의 성숙 대동맥-생식-mesonephros (AGM) 지역에서 혈관 틈새 기질과 교양 이식 분석 실험입니다. 이 방법을 수 있도록 그들의 기능적인 engraftment 잠재력 클론 hemogenic 선구자의 phenotypic 속성 또는 HSC 전조의 상세한 분석을 위한 수단을 제공 하는 transcriptional 프로필 등의 다른 속성의 상관 관계 단일 세포 수준에서 개발입니다.

그림 1A 는 실험적인 디자인의 회로도 보여준다. P-Sp/관련해 조직 해 부, 풀링, 그리고 콜라에 해리, 일단 그들은 인덱스 정렬에 대 한 VE Cadherin와 EPCR 항 체와 얼룩이 있습니다. 사전-HSC VE Cadherin+EPCR높은 (그림 1B)에 정렬 셀 농축 됩니다. 다른 형광 색소 활용 된 항 체는 소급 인덱스 정렬 하는 동안 각 셀에 대 한 기록 되는 추가 phenotypic 매개 변수를 분석에 포함 될 수 있습니다. E11 AGM에서 대표적인 실험에서 세포는 또한 FITC 활용 된 안티-CD45와 안티-CD41 PE 활용 된 항 체 얼룩이 진다. 이러한 조 혈 특정 표식에 대 한 VE Cadherin+EPCR높은 인구 내의 (...

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

이 방법의 전반적인 목표는 쥐 배아 발달 중 클론 조혈 줄기 세포 또는 HSC 전구체의 표현형 특성과 생착 가능성을 확인하는 것입니다. 이 방법은 배아 발달 중 클론 HSC 전구체의 고유한 계통 기여에 대한 발달 조혈 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 혈원 전구체가 단일 세포 수준에서 분석된다는 것입니다.이를 통해 희귀 HSC 전구체를 구별하는 고유한 표현형 특성을 식별할 수 있습니다. 먼저 성교 후 9.5일에서 11.5일 사이에 배아에서 절개된 조직인 대동맥-생식선-메소네프로스(AGM)를 얼음 위에 10%FBS가 보충된 10밀리리터의 PBS가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 추가합니다. 조직이 튜브 바닥에 가라앉으면 상등액을 흡인하고 즉시 샘플에 0.25% 콜라겐분해효소 1ml를 첨가합니다.섭씨 37도의 수조에서 25분 후 1ml의 PBS와 FBS로 반응을 중지하고 1mL 피펫 팁을 사용하여 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 조직을 20-30회 분쇄합니다. 그런 다음 PBS와 FBS를 8 밀리리터 더 희석하고 원심 분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 500마이크로리터의 차단 버퍼에 얼음 위에서 5분 동안 재현탁합니다.그런 다음 관심 항체 칵테일 500마이크로리터를 추가합니다. 얼음에서 15-20분 동안 배양한 후 8ml의 PBS plus FBS로 세포를 세척하고 1ml의 새로운 PBS plus FBS에 펠릿을 재현탁합니다. 35마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 5ml 튜브로 여과하고 추가로 3ml의 PBS와 FBS로 여과기를 세척하여 모든 세포를 수집하고 세포를 다시 원심분리합니다.그런 다음 펠릿을 500마이크로리터의 PBS와 FBS에 재현탁시키고 세포를 얼음 위에 놓습니다. 단일 세포 및 인덱스 정렬 모드에서 정렬을 위한 게이트를 설정하려면 작은 세포 분취량을 유세포 분석기에 로드하고 획득을 가장 낮은 유속으로 설정합니다. 전방 산포 영역 대 측면 산포 영역 플롯을 열고 다양한 크기의 셀을 포함하도록 게이트를 설정합니다.전방 산포 영역 대 전방 산포 너비 플롯과 측면 산포 영역 대 측면 산포 너비 플롯을 열고 각 플롯에 게이트를 설정하여 이중선을 제외합니다. 살아있는 세포를 게이트하기 위해 전방 산란 영역 대 DAPI 플롯을 설정합니다. 그런 다음 항혈관 내피 Cadherin 대 항 내피 단백질 C 수용체 플롯을 만들고 혈관 내피 Cadherin 양성 및 고

clonal-analysis-embryonic-hematopoietic-stem-cell-precursors-using

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 동영상은 골수에서 HSPC를 분리하고 단일 정렬된 HSPC를 얻는 방법인 형광 활성화 세포 분류 기술을 사용하여 HSPC를 분류하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이렇게 분류된 세포를 배양하여 HSPC 클론을 얻습니다.

HSPC 클론의 배양 및 수확: 단일하게 분류된 HSPC 클론을 얻는 방법

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 원발성 종양 특이적 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있는 방법을 보고합니다.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

이 프로토콜은 단일 세포 분류 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 방법을 설명합니다. 특히, 단일 세포 분류를 사용하면 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합할 때 이종 집단에서 면역표현형 세포의 99% 순도를 달성할 수 있습니다.

인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류

배우세요 단일 세포 인덱스 정렬과 내피 세포 공동 배양을 활용한 배아 조혈 줄기 세포 전구체의 클론 분석 방법입니다. 이 기술은 희귀한 HSC 전구체의 특이적 표현형과 이식 가능성을 규명하여 발달 조혈 연구에 기여합니다.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

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