Name: 인간의 우유 샘플의 타겟된 16S 시퀀싱 하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 학습하세요 인간 우유 및 저생물량 샘플에서 16S rRNA를 증폭하는 반자동 프로토콜을 통해 미생물군 연구를 수행하는 방법을. 이 기술은 건강과 질병에 관한 인간 미생물군의 발달을 이해하는 데 도움이 됩니다.

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우리는 프로토콜의 개발에 대 한 Helty Adisetiyo, 박사 Shangxin 양 박사를 감사 하 고 싶습니다. 전반적인 지원에 대 한는 국제 모성 소아 청소년 에이즈 임상 실험 그룹 (IMPAACT) 국립 연구소의 알레르기와 감염 증 (NIAID)의 국립 보건원의 건강 (NIH) 보너스 번호 아래에서 제공한 UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC)와 UM1AI106716 (IMPAACT 액정), 아동 건강과 인간 발달 (NICHD)의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소와 국립 연구소의 정신 건강 (NIMH)에서 공동 자금. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NIH의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

모든 프로토콜 단계에 대 한 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 해야 합니다, 그리고 엄격한 오염 예방 방법을 수행 해야 합니다. 샘플의 오염을 최소화 하기 위해 후 증폭 작업 영역에 영역을 작동 하는 사전 증폭에서 작품의 흐름을 관찰 합니다. 사용 하는 모든 공급은 살 균, RNase, DNase, DNA, pyrogen의 무료 이다. 모든 피 펫 팁 필터링 됩니다. 프로토콜 단계의 순서도 (그림 1)를 제공 됩니다.
1. 샘플 세포
참고: 샘플 세포 및 핵 산 추출 클린 룸 환경에서 DNA/RNA 추출 키트를 사용 하 여 엔지니어링 및 절차적 컨트롤 샘플에 환경 박테리아의 도입을 최소화 하에서는 수행 됩니다.
<ol><li>
작업 영역 준비
	<ol>
<li>깨끗 한 biosafety 내각 (BSC) 핵 산 오염을 제거 하기 위해 적절 한 표면 청소기 영역을 작동 합니다.</li>
		<li>온도 제어 vortexer, 설정 하 고 37 ° c.에 설정</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guanidinium 안산 세포의 용 해 버퍼를 준비 (재료의 표 참조)
	<ol>
<li>침전 물에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 확인 합니다. 37 ° c.에서 온난 하 여 다시 분해 침전</li>
		<li>각 샘플에 대 한 6 µ L β-mercaptoethanol (β-ME)와 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L를 준비 합니다. 샘플 당 추가 20% 볼륨을 고려 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 준비
	<ol>
<li>전체 우유, 냉동 얼음에 녹여. Aliquot 5 mL 전체 15 mL 또는 BSC에 5 mL 무 균 튜브에 우유 하 고 얼음에 그것을 유지.</li>
		<li>작은 셀을 4 ° C에서 5000 x g에서 10 분 동안 aliquot 5 mL 우유를 회전 합니다.</li>
		<li>지방 층을 제거, 튜브, 플라스틱 주걱 또는 큰에 상위 계층 피 펫 팁을 지루하게 하는 지금.</li>
		<li>방해 없이 펠 릿, 100 µ L 제외한 모든 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>워시 1 mL의 멸 균 인산 염에 resuspending에 의해 펠 릿 버퍼링 식 염 수 (PBS).</li>
		<li>5 mL 튜브를 무 균 PBS의 1 mL을 추가 하 여 1 부정적인 제어를 준비 합니다.</li>
		<li>원심 분리기 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 정지를 전송 하 고 1 분 (실 온 (RT)에서 5000 x g)에 대 한 microcentrifuge에 스핀.</li>
		<li>1000 µ L 살 균 필터링 된 피 펫 팁을 사용 하 여 전체 상쾌한/지방산 레이어 삭제.</li>
		<li>같은 날, 스냅인를 추출 하지 고정 셀 에탄올/드라이 아이스 슬러리에 넣어 작은 하 고 즉시-80 ° C 냉동 고로 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 중단 및 균질 (구슬-구타)
	<ol>
<li>Β-ME는 펠 릿을 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L을 추가 하 고 비드 튜브에 정지를 전송.</li>
		<li>12의 각 추출 배치 10 샘플, 1 부정적인 제어 (위의 단계 3.7에서에서 준비), 그리고 1 긍정적인 제어 (다음 단계에서 준비)에 포함 되어 있습니다.<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼와 20 µ L 세균성 모의 샘플 (사용 모의 공동체는, 한 번 추출의 농도 DNA의 약 0.2 ng / µ L)의 1 긍정적인 제어를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>와 동 모든 15에 대 한 적극적으로 튜브 비드 s.</li>
		<li>700-800 rpm에서 떨고와 10 분 동안 37 ° C에서 온도 제어 vortexer에 열 샘플.</li>
		<li>자동화 샘플 방해 어댑터 집합으로 튜브를 로드 합니다.</li>
		<li>구슬 30 Hz에서 1 분이 겼 다.</li>
		<li>어댑터 세트를 분해 하 고 악기의 오른쪽 로봇 팔을 왼쪽된 로봇 팔에서 샘플 접시 세트 어댑터를 수동으로 전환.</li>
		<li>구슬 30 Hz에서 다른 1 분이 겼 다.</li>
		<li>25 ° c.에 3 분 동안 17200 x g에서 원심 분리기 튜브</li>
		<li>200 µ L 피 펫, 샘플 또는 상단에 지방 층의 샘플의 하단에 잔여 고 균질 화기 열에 적용 하지 않도록 주의 되 고와 함께 상쾌한의 모든을 제거 합니다.</li>
		<li>최대 속도, 25 ° c.에 3 분 동안 17200 x g에서 원심 분리기 균질 화기 열</li>
		<li>(다른 튜브를 사용 하지 마십시오) DNA와 RNA의 정화에 대 한 자동화 된 악기와 함께 사용 하기 위해 2 mL 제조업체의 microcentrifuge 튜브에 eluate의 350 µ L를 전송. 조심 하지 어떤 잔여 지방 층을 전송 합니다.</li>
		<li>흐름을 통해 볼륨 보다 350 µ L 이면 350 µ L의 최종 볼륨을 β-ME와 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.</li>
		<li>샘플 실시간 진행 하기 전에 최대 2 h에 대 한 자동화 된 DNA 정화 악기를 사용 하 여 핵 산 격리를 두거나-80 ° c.에 고정</li>
	</ol>
</li>
	<li>
작업 영역을 청소
	<ol>
<li>깨끗 한 모든 표면에 비-효소 오염 제거 솔루션을 사용, 10 분 동안 다음 70% 에탄올 스프레이 두고 닦아 표면.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA/RNA 분리
<ol><li>
작업 영역 준비
	<ol>
<li>열 블록 설정 하 고 설정 온도 70 ° c</li>
		<li>온도 제어 vortexer 설정 하 고 설정 온도 37 ° c</li>
		<li>워밍업-10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 70 ° c 50 mL 튜브에 들어 있는 차입 버퍼 (EB)</li>
		<li>워밍업-350 µ L까지 완전히 37 ° C에서 2 mL 튜브에 냉동된 샘플 lysates의 어떤 침전 (약 10 분) 없이 해 동.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA 정화
	<ol>
<li>소용돌이 원심 분리기 2 mL 튜브 샘플 짧게 (3000 x g 10 s).</li>
		<li>다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 제조 업체의 지시 당 셰이 커에 2 mL 튜브를 삽입 합니다.</li>
		<li>로 터 어댑터를 얻을 하 고 샘플의 수에 따라 용지함에 그들을 설정 합니다.</li>
		<li>각로 터 어댑터 샘플의 식별 (ID)에 따라 분류.</li>
		<li>뚜껑을 잘라내어 DNA와 RNA에 대 한 개별 스핀 열 가장자리를 매끄럽게.</li>
		<li>로 터 어댑터에 컬렉션 튜브 없이 DNA 스핀 열을 삽입 합니다. 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.</li>
		<li>라벨 1.5 mL 컬렉션 튜브, 고로 터 어댑터에 삽입 합니다.</li>
		<li>다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 원심 분리기에로 터 어댑터를 설정 합니다.</li>
		<li>제조업체의 1000 µ L 필터-팁 팁 랙에 삽입 합니다.</li>
		<li>(특정 컴퓨터 프로토콜 명령) 당 샘플 수에 따라 2 mL 제조업체의 microcentrifuge 튜브에 RNase 무료 물을 추가 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브 슬롯의 튜브 슬롯 "A"에 튜브를 삽입 합니다.</li>
		<li>시 약 병에 10 mL의 최소 볼륨으로 채우기 남은 모든 시 약을 삭제 합니다.</li>
		<li>시 약 병 랙 (EB 병)을 제외 하 고 시 약 병을 삽입 합니다.</li>
		<li>시 약 병 위치 6에 50 mL 튜브에서 따뜻한 EB를 추가 합니다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브로 터 어댑터에 단단히 배치 됩니다 확인 하십시오.</li>
		<li>악기의 뚜껑을 닫고 선택: "RNA" → "추출 키트" → "동물, 조직 및 세포" → "키트의 이름 350 µ L 부분 A 사용자 정의 DNA" → 편집 차입 볼륨 100 µ L (기본값) 또는 낮은 바이오 매스 샘플 → 50 µ L을 "시작."</li>
		<li>완료 되 면 회전자는 원심 분리기에서 어댑터를 제거 하 고 용지함에 넣어.</li>
		<li>로 터 어댑터 위치 3에서에서 DNA 스핀 열을 삭제 합니다.</li>
		<li>로 터 어댑터 삭제 하지 마십시오, RNA는 위치 2에.</li>
		<li>3의 위치에 eluted DNA를 포함 하는 1.5 mL 컬렉션 튜브를 제거 하 고 −20 ° C에 저장</li>
		<li>모든 샘플은 남아, 그렇지 않으면 삭제 하는 경우 뿌리와 −20 ° C가 게에서 포함 하는 샘플 튜브를 수집 합니다.</li>
		<li>"키트의 이름 350 µ L 부분 B RNA" 추가 RNA의 정화에 대 한 프로토콜을 계속.</li>
		<li>RNA 정화는 약 350 µ L 자형 회전자 어댑터의 중간 위치에에서 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 정화
	<ol>
<li>로 터 어댑터에 컬렉션 튜브와 뚜껑 없이 RNA 스핀 열을 삽입 합니다.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 컬렉션 튜브 라벨을 설명서에 표시 된 대로 터 어댑터에 그들을 삽입 합니다.</li>
		<li>다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 원심 분리기에로 터 어댑터를 설정 합니다.</li>
		<li>악기의 뚜껑을 닫고 선택: "RNA" → "제조업체의 키트" → "동물, 조직 및 세포" → "표준 부품 B RNA" → "시작."</li>
		<li>완료 되 면, 회전자는 원심 분리기에서 어댑터를 제거 하 고 용지함에 넣어.</li>
		<li>위치 3에서에서 RNA 스핀 열을 삭제 합니다.</li>
		<li>위치 3에서 30 µ L eluted RNA를 포함 하는 1.5 mL 컬렉션 튜브를 제거 하 고 −80 ° C에 저장</li>
		<li>시 약 병을 제거 합니다.</li>
		<li>유해 폐기물을 적절 한 채널을 통해 회전자 어댑터 내용을 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
깨끗 한 작업 역
	<ol>
<li>모든 자동화 된 DNA/RNA 정화 악기의 액세서리, 시 약 선반, 쟁반, 및 다른 표면에 같은 비-효소 오염 제거 솔루션을 사용, 10 분 동안 두고 린스 스프레이 (디) 저온 다음 그들이 말리 면.</li>
		<li>스프레이 자동된 악기 제조업체에 비-효소 오염 솔루션 승인, 사용 중인 모든 표면 함께 원심 분리기의 내부를 닦아, 10 분, 두고 70% 에탄올으로 닦아. 그들은 악기를 손상 시킬 수 있습니다 오염 솔루션의 다른 종류를 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 타겟된 16S PCR 설치
참고: 16 PCR에 대 한 설정 클린 룸 내에 있는 지정 된 사전 증폭 작업 영역에서 수행 됩니다. 시 약 및 샘플은 준비 하 고 3 (30 샘플, 3 중, 96의 총에 진정한 샘플 및 추출 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 플러스 2 PCR 물 컨트롤을 포함 하는 중에 각 샘플에 대 한 PCR을 수행 하는 액체 처리기에 로드 결합 된 샘플 및 컨트롤)입니다. PCR 반응 조립 및 봉인, 일단 샘플 접시 사이클링 후 증폭 지역에 위치한 열 cycler에 전송 됩니다.
<ol><li>
작업 영역 준비
	<ol>
<li>PCR 워크스테이션을 청소. 스프레이 RNase, DNase, DNA와 함께 사용에서 모든 표면 decontaminant, 뒤 디 물에 두 번, 그리고 마지막으로 70% 에탄올.</li>
		<li>16S PCR 워크시트 준비 (타겟 16S PCR 워크시트 참조) 정확한 샘플 목록 및 각 샘플9할당 다른 바코드 뇌관. 인쇄 워크시트 및 플레이트 지도 (접시 1 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR 마스터 믹스 준비 참고: 16 뇌관 선택 특정 연구에 대 한 관심 영역에 따라 그리고 연구 또는 샘플 형식에 의해 변경 될 수 있습니다. 따라서, 주문 하기 전에 프라이 머, 그것은 특정 연구에 대 한 관심의 미생물을 증폭 하는 최고의 16S rRNA의 어떤 영역을 확인 하는 것이 중요. 로 작성 된이 프로토콜 16 V4 영역의 확대입니다. 다른 프라이 머/지역을 선택한 경우 열 사이클링에 어 닐 링 온도 조정을 해야 합니다.<ol>
<li>모든 것을 준비 하는 PCR 워크스테이션에서 작동 합니다.</li>
		<li>-20 ° C에서 DNA 샘플의 50-100 µ L 및 필요한 모든 시 약을 꺼내와 얼음에 녹여. 소용돌이 짧게 스핀 다운.</li>
		<li>뇌관은 미리 20 µ L의 최소 볼륨에서 5 µ M의 작업 농도에 희석 됩니다.</li>
		<li>워크시트에서 계산에 따르면 앞으로 뇌관만 특정 5 mL 튜브에 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
로봇을 이용한 액체 처리기 자동화 된 PCR 설치 준비
	<ol>
<li>샘플에 대 한 32-그럼 악기의 샘플 어댑터를 꺼내 하 고 제조업체의 지침에 따라 96 잘 접시 지도 따라 DNA 샘플의 50-100 µ L를 로드 합니다.<ol>
<li>각 PCR 접시, 깨끗 한 샘플 튜브에 물이 PCR의 30 µ L를 배치 하 여 2 부정적인 컨트롤을 설정 합니다.</li>
			<li>모든 샘플 32 잘 악기의 샘플 어댑터에 뚜껑 열린 위치에서 잠금 넣습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>반전 뇌관9<ol>
<li>특정 바코드와 각 역 뇌관의 모자를 제거 # ' 1 번 (교차 오염을 방지 하는 사이 변화 장갑)에.</li>
			<li>악기의 시 약 어댑터에 최대 32 뇌관을 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>96-잘 PCR 접시 밖으로가 고 연구 이름, 시료 번호, 날짜, 및 기술자의 이니셜 라벨.</li>
		<li>로봇을 이용한 액체 처리기 로드<ol>
<li>위치 지 하 1 층에에서 시 어댑터를 넣습니다. 가장자리 효과 방지 하기 위해 신중 하 게 그립 쪽에 대 한 어댑터의 한쪽 가장자리 놓고 천천히 다른 가장자리를 내리게 합니다. 어댑터의 모든 모서리를 눌러 있는지 확인 하십시오.</li>
			<li>위치 c 1에서 샘플 어댑터를 놓습니다. 어댑터의 모든 모서리를 눌러 있는지 확인 하십시오.</li>
			<li>소용돌이 5 mL 마스터 믹스, 뚜껑을 열고 하 고 악기의 마스터 믹스 및 시 약 블록에 위치 A에 그것을 배치.</li>
			<li>반 치마를 입은 PCR 접시를 위한 96-잘 악기의 어댑터에 PCR 접시를 놓습니다.</li>
			<li>실행을 시작 하 고 새 파일로 저장 합니다.</li>
			<li>나타나는 메시지에 따라 그리고 각 프롬프트를 표시 하는 확인: 1, 팁을 사용할 수 있습니다, 2, 폐기물 상자는 사용할 수, 그리고 3, 시작.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실행 완료 되 면 확인 오류 메시지에 대 한 컴퓨터를 검사 하 여 오류가 있었습니다.</li>
		<li>적극적으로, 12 또는 8 스트립 모자, 소용돌이와 접시를 봉인 하 고 96 잘 접시 회전자를 사용 하 여 1 분 동안 스핀 다운 얼음 이나 냉장고에 그것을 배치.</li>
		<li>반전 뇌관 및 샘플 튜브를 제거 합니다.</li>
		<li>후 증폭 방에 96 잘 접시를 받아 고 열 순환 조건 ( 표 1참조)의 표에 따라 주기 고 열 cycler에 접시를 로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 타겟된 16S 포스트 PCR 품질 관리 젤 전기 이동 법을 위한 테이프 기반 플랫폼을 사용 하 여
참고: 포스트 PCR 품질 관리 (QC) 및 모든 후속 단계는 실시 실험실의 지정 된 후 증폭 지역에서. DNA는 자동화 된 DNA/RNA 조각 분석기에서 분석 된다.
<ol><li>
작업 영역 준비
	<ol>
<li>살포 사용 RNase, DNase, DNA에에서 모든 표면 decontaminant, 뒤 디 물에 두 번, 그리고 마지막으로 70% 에탄올으로 워크스테이션을 청소.</li>
		<li>모든 공급 및 필요한 장비를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시 약 준비
	<ol>
<li>최소 30 분의 25 ° C에서 온도 제어 vortexer에서 샘플 버퍼와 사다리를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시 약은 워밍업 하는 동안 단일 관으로 각 샘플에 대 한 3 PCR 복제를 풀링 하 여 PCR 샘플 준비</li>
	<li>악기에는 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>짧게 소용돌이 고 풀링된 PCR 제품 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>RT에서 선반에 악기의 96 잘 접시를 놓고 그것을 분류 합니다.</li>
	<li>짧게 소용돌이 스핀 다운 샘플 버퍼 및 사다리.</li>
	<li>96 잘 접시 (필요 이상 53 µ L/화면 테이프)의 각 음에 3 µ L 견본 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>샘플;는 짝수 실행 샘플 수가 홀수인 경우는 빈 우물에 샘플 버퍼의 4 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>사다리를 사다리의 1 µ L를 잘 추가 합니다.</li>
	<li>그것의 지정 풀링된 PCR 제품의 1 µ L를 추가 하는 다음 지도, 잘.</li>
	<li>커버 호 일 씰 플레이트</li>
	<li>소용돌이 1 분 2000 rpm에서 악기의 vortexer와 어댑터를 사용 하는 접시.</li>
	<li>다시 경우 튜브의 하단에 샘플 아래로 회전 급강하 거품 위치까지 회전 합니다.</li>
	<li>소프트웨어를 시작 합니다.</li>
	<li>에 스크린 테이프와 로드 팁을 로드 합니다.</li>
	<li>96-잘 어댑터와 조각 분석기에 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>컨트롤러 소프트웨어와 함께 실행을 설정 합니다.</li>
	<li>심지어 번호 우물을 선택 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>샘플 Id를 작성 합니다.</li>
	<li>확인 화면 테이프의 모든 우물 회색으로 강조 표시 됩니다.</li>
	<li>분석기는 모든 피 펫 팁을 인식 하는지 확인 합니다.</li>
	<li>시작을 선택 하 고 (샘플 번호, 이름과 날짜 연구) 결과를 저장할 파일 이름을 지정 합니다.</li>
	<li>자세한 내용은 제조업체의 설명서를 참조 하십시오.</li>
	<li>실행 완료 되 면, 팁, 화면 테이프, 및 튜브를 삭제 합니다.</li>
	<li>16S 피크 nM (v4 315-450 bp) 사이 대 한 데이터를 분석 합니다. 이 피크는 뇌관 선택에 따라 달라 집니다.</li>
</ol>5. 라이브러리 계산, 풀링, 정리 및 품질 관리
<ol><li>결정 후 amplicon 크기와 모든 샘플의 몰, 수영장 최종 원하는 볼륨 및 nM 풀링된 라이브러리 라이브러리 (샘플 계산 참조).</li>
	<li>정리 및 집중 실리 카 멤브레인 기반 정화를 사용 하 여 풀링된 라이브러리 PCR 제품, 제조 업체의에 따르면 키트 ( 재료의 표참조) 프로토콜 합니다.<ol>
<li>50 µ L의 최종 볼륨 DNA elute</li>
	</ol>
</li>
	<li>Double을 사용 하 여 즉시 청소 라이브러리의 농도 측정 제조 업체의 프로토콜에 따라 DNA 높은 감도 fluorometer 킷 좌초.<ol>
<li>198 µ L 희석 버퍼 플러스 염료 (1: 100 희석)의 함께 풀링된 및 청소 라이브러리의 2 µ L를 희석.</li>
		<li>Fluorometric 장치에서 측정 된 값을 기록 하 고 희석 비율에 따라 변환.</li>
	</ol>
</li>
	<li>농도 (ng / µ L) 풀링된 라이브러리에 대 한 읽기를 사용 하 여 라이브러리 몰 nM에서 계산 합니다. 1 µ L undiluted 라이브러리를 사용 하 여 측정 하는 microvolume 분 광 광도 계에 OD260/280. 참고: 값이 1.8-2.0 라이브러리의 적절 한 순도 나타냅니다.</li>
	<li>다음 세대 시퀀싱에 대 한 준비까지-20 ° C에서 최종 라이브러리를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

16S rRNA의 타겟된 다음-세대 시퀀싱 미생물 특성화18에 대 한 널리 사용 되 고, 급속 한 기술입니다. 그러나, 일괄 처리 효과, 환경 오염, 샘플 교차 오염을, 감도, 재현성 등 많은 요인 수 부정적인 실험 결과 영향을 하 고 그들의 해석7,19 혼동 , 20. 가장 강력한 16S 분석을 용이 하 게에 미생물 워크플로 좋은 실험 디자인, 적절 한 컨트롤의 사용, 워크플로 단계의 공간 분리 및 최상의 방법의 응용 프로그램을 통합 해야 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 이러한 매개 변수 각각의 통합 하 고 위의 문제를 해결 하 고 다양 한 샘플에 대 한 16 워크플로 구현 하는 중요 한 실험 도구를 제공 합니다.
좋은 실험 디자인은 16S 미생물 분석을 위한 중요 합...

인간 식민지 미생물 지역 사회는 인간의 건강과 신진 대사, 면역 발달, 질병 민감성과 예방 접종과 약물 치료1, 에 대 한 응답에 영향을 미치는 질병에 매우 중요 한 것으로 2. 현재 인간의 건강에는 microbiota의 영향을 이해 하는 노력 강조 뿐만 아니라 지역화 된 사이트 정의 해부학 구획 (즉, 피부, 창 자, 구두, 등), 관련 된 미생물의 식별 이러한 구획3,4. 이러한 조사 활동을 underpinning 급속 한 출현 및 샘플의 미생물 유전 콘텐츠 (미생물)의 분석에 대 한 대규모 병렬 플랫폼을 제공 하는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 증가 접근성입니다. 많은 생리 샘플, 관련 된 미생물은 복잡 하 고 풍부한 (즉,의 자), 하지만, 일부 샘플은 미생물 어디 낮은 미생물 바이오 매스 (즉, 인간의 우유, 낮은 호흡기)로 표현 됩니다 감도, 실험적인 인공 물, 및 가능한 오염 될 주요 문제. 미생물 연구와 적절 한 실험적인 디자인의 공통 과제 여러 검토 기사5,6,,78의 대상이 되었습니다.
여기에 소개 강력한 NGS 실험 파이프라인 기반으로 rRNA 16S V4 지역9 인간 우유의 미생물 특성의 타겟된 시퀀싱 합니다. 인간 우유의 미생물 분석은 복잡 하지는 본질적으로 낮은 미생물 바이오 매스10여만 하지만 또한 높은 인간 DNA의 레벨11,12,,1314 배경 및 잠재적인 carryover PCR 억제제15,16 추출 된 핵 산의. 이 프로토콜은 상용 추출 키트와 샘플 준비 일괄 처리를 통해 변화를 최소화 하는 것을 도울 수 있는 반자동된 플랫폼에 의존 합니다. 그것은 프로토콜의 각 단계를 확인 하 고 파이프라인 견고성의 독립적인 통계를 제공 하는 품질 관리로 샘플 함께 처리 되는 잘 정의 된 세균성 모의 사회 통합. 로 프로토콜 인간의 우유 샘플에는 설명의 자, 직장, 질, 피부, 나, 그리고 구강 면봉10,17를 포함 하 여 다른 샘플 형식에 쉽게 적응할 수 이며 시작 지점으로 사용할 수 있습니다. 미생물 분석을 수행 하고자 연구원입니다.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA 추출 키트</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA 오염 제거</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>온도 제어 와류</td></tr><tr><td>버퍼 RLT plus</td><td>Qiagen</td><td></td><td>1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Allprep 키트</td></tr><tr><td>의 일부&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME는 이황화 결합,</td></tr><tr><td>LME 비드,</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>비드 튜브</td></tr>, <tr><td>QIAgen, Tissue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>를 감소시켜 RNase를 비가역적으로 변성시키는 환원제입니다.키트에 들어 있는 QIAgen RB 튜브</td><td></td><td></td><td>제조업체의 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>QIAcube 및 관련 플라스틱 용기</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>자동 DNA/RNA 정제 기기</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>비효소 오염 제거 용액</td></tr><tr><td>EB 완충액</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>용출 완충액</td></tr><tr><td>QIAgility 및 관련 플라스틱 용기</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>로봇 액체 처리기</td></tr><tr><td>PCR 물</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>바코드 리버스 프라이머</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #</td><td>설계 및 주문</td></tr><tr><td>96 웰 PCR 플레이트</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 및 관련 플라스틱 제품</td><td>Tapestation</td> Agilent 5067-5585용 애질런트 <td>G2964AA</td><td>자동 DNA/RNA 단편 분석기</td></tr><tr><td>D1000 시약</td><td></td><td></td><td>시료 완충액 및 래더는 이 키트의 일부입니다</td></tr>. <tr><td>OneStep PCR 억제제 제거 키트</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR 억제제 제거는 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트,</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA 클린업 키트: PCR 산물의 실리카막 기반 정제</td></tr>, <tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>디메틸설폭사이드 기반 희석 완충액 및 염료가 이 키트의 일부입니다.</td></tr><tr><td>Qubit 형광측정기</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>미세량 분광 광도계</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>카탈로그 없음 #의</td><td>차세대 시퀀서</td></tr></tbody></table>

인간의 우유 샘플의 타겟된 16s 시퀀싱 하는 방법

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

미생물 커뮤니티 연구는 상대적으로 신속, 저렴 하 고 높은 처리량 시퀀싱의 개발을 광범위 하 게 되었다. 그러나, 이러한 모든 기술에서와 마찬가지로 재현 결과 실험실 워크플로 통합 하는 적절 한 예방 조치 및 컨트롤에 따라 다릅니다. 이것은 특히 낮은 바이오 매스 샘플 중요 어디 세균 DNA 오염 잘못 된 결과 생성할 수 있습니다. 이 문서 낮은-에 중순-throughput 규모에 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 지역의 타겟된 시퀀싱을 사용 하 여 인간 유 방 우유 샘플에서 미생물을 식별 하는 반자동된 워크플로 자세히 설명 합니다. 프로토콜 설명 전체 우유 등에서 샘플 준비: 세포, 핵 산 추출, 증폭, 16S rRNA 유전자 및 품질 관리 조치 라이브러리 준비 V4 영역의 샘플. 프로토콜 및 토론 준비와 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, PCR 반응 억제제 제거, 샘플 오염 환경, 시 약, 포함 하는 낮은 바이오 매스 샘플의 분석을 돌출 하는 문제를 고려 하는 중요 한 것은, 또는 실험 소스, 고 재현성을 보장 하도록 설계 된 실험 모범 사례. 프로토콜을 설명 하는 대로 인간 우유 샘플, 면봉, 깔끔한, 또는 보존 버퍼에 안정 냉동에 수집 된 샘플을 포함 한 수많은 낮은 및 높은 바이오 매스 샘플 종류에 적응은.

여기에 제시 된 프로토콜 데이터 생성 충족 프로토콜 감도, 특이성, 및 오염 제어에 대 한 벤치 마크 되도록 중요 한 품질 관리 (QC) 조치를 포함 합니다. 프로토콜의 QC 첫걸음 16 v 4 지역 (그림 2)의 PCR 증폭을 다음과 같습니다. 각 샘플에서 PCR 제품의 1 개의 µ L 315-450 bp (그림 2, 빨간 화살표)의 예상된 크기 범위 내에서 그것은 확인을 위해 전기 이동 법으로 분석 했다. 인간의 우유 샘플 특정 제품의 낮은 금액을 생성 (그림 2A, 3, 9-11 레인 비교 레인 4-8), 추출 하는 동안 그 샘플, 또는 PCR 억제제의 이성 미생물 DNA를 추출 하는 중 저급의 제안. 2.0 보다는 더 적은 생성 하는 샘플에 대 한 PCR 억제제 정리 315-450 혈압 범위 (<stron...

반자동된 워크플로 인간 우유와 다른 낮은 바이오 매스 샘플 종류에서 16S rRNA의 타겟된 시퀀싱에 대 한 제공 됩니다.

인간의 우유 샘플의 타겟된 16S 시퀀싱 하는 방법

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

이 방법의 전반적인 목표는 반자동 프로토콜을 사용하여 모유 및 기타 낮은 바이오매스 샘플에서 16 SRRNA를 증폭하는 것입니다. 이 방법은 건강 및 질병과 관련된 인간 마이크로바이옴의 발달 및 교란에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반자동이고 비교적 수행하기 쉬우며 분비물, 면봉 및 대변을 포함한 여러 샘플 유형에 적용할 수 있다는 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 전유를 해동하고 할당한 후 샘플을 5000회 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화합니다. 플라스틱 주걱 또는 큰 구멍 피펫 팁을 사용하여 상단 지방층을 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 100 마이크로 리터를 제외한 모든 상등액을 제거하십시오.PBS 1밀리리터로 펠릿을 다시 매달아 세척합니다. 그런 다음 5ml 튜브에 1ml의 멸균 PBS를 추가하여 음성 대조군을 준비합니다. 서스펜션을 깨끗한 1포인트 5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 1분 동안 5000배 G로 회전시킵니다.그런 다음 1000마이크로리터의 멸균 여과 피펫 팁을 사용하여 전체 상층액 지방층을 버립니다. 시료를 파괴하고 균질화하려면 베타 메르캅토에탄올이 함유된 600마이크로리터의 용해 완충액을 펠릿에 추가하고 현탁액을 비드 튜브로 옮깁니다. 용해 완충액과 20마이크로리터의 박테리아 모의 샘플이 포함된 positive control 1개를 준비합니다.모든 비드 튜브를 15초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 그런 다음 섭씨 37도 및 700-800RPM의 온도 조절 와류에서 샘플을 10분 동안 가열합니다. 튜브를 자동 시료 분열기 어댑터 세트에 로드합니다.그런 다음 30헤르츠에서 1분 동안 샘플을 비드 비트로 두드립니다. 어댑터 세트를 분해하고 샘플 플레이트와 함께 수동으로 전환합니다.ample 플레이트에서 기기의 왼쪽 로봇 팔에서 오른쪽 로봇 암으로 이동합니다. 30헤르츠에서 튜브를 1분 더 비드로 치다가 17, 200배 G, 25°C에서 3분 동안 튜브를 원심분리합니다.200마이크로리터 피펫을 사용하여 상층액을 모두 제거하되 샘플 상단의 지방층이나 하단의 비드 잔류물을 취하지 않도록 주의합니다. 상등액을 균질화 컬럼에 도포합니다. 그런 다음 최대 속도와 섭씨 25도에서 3분 동안 컬럼을 원심분리합니다.350마이크로리터의 엘루이드를 2밀리리터 제조업체의 마이크로원심분리기 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DNA를 분리하려면 뚜껑을 자르고 DNA와 RNA를 위한 개별 스핀 컬럼의 가장자리를 매끄럽게 만듭니다. 수집 튜브가 없는 DNA 스핀 컬럼을 로터 어댑터에 삽입합니다.그런 다음 수집 튜브를 버리십시오. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 자동 DNA/RNA 정제 기기의 로딩 차트에 따라 와류가 있는 2밀리리터 튜브를 셰이커에 삽입합니다. 1 포인트 5 밀리리터 수집 튜브에 라벨을 붙이고 로터 어댑터에 삽입합니다.그런 다음 자동 DNA/RNA 정제 기기의 로딩 차트에 따라 로터 어댑터를 원심분리기에 설정합니다. 필터 팁, RNase free water 및 시약을 기기의 시약 블록에 삽입한 후 기기의 뚜껑을 닫고 기기에서 맞춤형 DNA 정제 프로그램을 실행합니다. 반응이 완료되면 셰이커에서 튜브가 포함된 샘플을 채취하고 샘플이 남아 있으면 단기 보관을 위해 섭씨 영하 20도, 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.작업 영역과 PCR 마스터 믹스를 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 50-100마이크로리터의 DNA 샘플을 96웰 플레이트 맵에 따라 32웰 기기 샘플 어댑터에 로드합니다. 각 PCR 플레이트에 대해 깨끗한 1포인트 5밀리리터 수집 튜브에 30마이크로리터의 PCR 물을 피펫팅하여 두 개의 음성 대조군을 설정합니다. 그런 다음 모든 샘플을 32웰 기기 샘플 어댑터에 놓고 캡을 열린 위치에 고정합니다.기기의 시약 어댑터에서 특정 바코드 번호가 있는 각 리버스 프라이머의 캡을 한 번에 하나씩 제거합니다. 로봇 액체 처리기를 로드하려면 가장자리 효과를 피하기 위해 시약 어댑터를 B1.In 위치에 놓고 어댑터의 한쪽 가장자리를 그립 쪽에 조심스럽게 놓고 다른 쪽 가장자리를 천천히 아래로 내립니다. 어댑터의 모든 모서리를 눌러야 합니다.샘플 어댑터를 위치 C1에 놓고 어댑터의 모든 모서리를 밀어야 합니다. 그런 다음 5 밀리리터 마스터 믹스를 소용돌이칩니다. 캡을 열고 기기의 마스터 믹스 및 시약 블록의 A 위치에 놓습니다.절반 스커트 PCR 플레이트를 고정하기 위한 96웰 기기의 어댑터에 PCR 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 실행을 시작하고 새 파일로 저장합니다. 실행이 완료되면 오류가 없는지 확인합니다.그런 다음 12개 또는 8개의 스트립 캡을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 격렬하게 소용돌이를 일으키고 96웰 플레이트 스피너를 사용하여 1분 동안 플레이트를 회전시킵니다. 마지막으로 플레이트가 포스트 증폭실로 이동하고 열 순환기에 로드될 때까지 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.PCR 증폭 후 텍스트 프로토콜에 따라 품질 관리 및 라이브러리 준비를 수행합니다. 프로토콜의 첫 번째 QC 단계는 16SV4 영역의 PCR 증폭을 따릅니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 각 샘플에서 1마이크로리터의 PCR 산물을 전기영동으로 분석하여 350 내지 450 염기쌍의 예상 크기 범위 내에 있음을 확인했습니다.일부 모유 샘플은 더 적은 양의 특정 제품을 생성했는데, 이는 해당 샘플에서 추출된 미생물 DNA의 수치가 낮거나 추출 중 PCR 억제제가 이월되었음을 시사합니다. 각 샘플에 대한 특정 산물의 정량화는 염기서열분석을 위한 샘플의 동일한 몰 풀링에 필요한 부피를 결정하는 데 필수적이었습니다. 표적 염기서열분석(targeted sequencing)을 위한 풀링된 라이브러리는 일반적으로 특정 PCR 산물에 의해 지배됩니다.라이브러리에 상당한 양의 비특이적 산물이 있는 경우, 워크플로우에 겔 정제 단계를 추가해야 합니다. 염기서열분석 결과는 모유 마이크로바이옴과 관련된 분류군의 높은 다양성과 각 샘플에 대한 염기서열분석 리드 수의 가변성을 보여줍니다. 대조적으로, 박테리아 모의에 대한 분류군 구성 및 리드 수는 이전 워크플로우 실행에서 모의에 대해 얻은 결과와 유사했으며, 이는 모유 샘플에서 관찰된 변동성이 내재적 워크플로우 변동성의 함수가 아니라 진정한 실험 결과임을 시사합니다.시퀀서를 밤새 가동하는 경우, 모든 샘플이 초기 PCR 실행으로 증폭되면 12-24개의 샘플에 대해 이 기술을 이틀 만에 완료할 수 있습니다. 그렇지 않은 경우 또 다른 쉘 데이가 필요합니다. 이 절차를 시도할 때 오염을 방지하기 위해 PCR 전 영역에서 PCR 후 영역으로만 이동하는 것이 중요합니다.교차 오염을 방지하기 위해 장갑을 자주 교체하는 것도 중요합니다. 인체 샘플로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 항상 적절한 보호 장비 및 생물 안전 캐비닛과 같은 예방 조치를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

미생물 군집을 특성화하는 것은 환경 미생물학의 오랜 목표였습니다. 차세대 염기서열분석 방법을 통해 이제 최소한의 비용과 노동력으로 전례 없는 깊이로 미생물 군집의 특성을 분석할 수 있습니다. 여기에서는 벤치탑 염기서열분석기를 사용하여 박테리아 16S 리보솜 RNA 유전자를 염기서열분석하는 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

우리 여기 높은 처리량 탐지 및 정량화 fucosylated 인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)의 전체 셀 바이오 센서를 사용 하 여 설명 합니다. 또한 설명 여기, HMO 생산 종자의 분석으로이 플랫폼의 적응 신호 대 노이즈 비를 향상에 초점을 맞추고 합니다.

Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

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