인간의 우유 샘플의 타겟된 16S 시퀀싱 하는 방법

이 방법의 전반적인 목표는 반자동 프로토콜을 사용하여 모유 및 기타 낮은 바이오매스 샘플에서 16 SRRNA를 증폭하는 것입니다. 이 방법은 건강 및 질병과 관련된 인간 마이크로바이옴의 발달 및 교란에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반자동이고 비교적 수행하기 쉬우며 분비물, 면봉 및 대변을 포함한 여러 샘플 유형에 적용할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 전유를 해동하고 할당한 후 샘플을 5000회 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화합니다. 플라스틱 주걱 또는 큰 구멍 피펫 팁을 사용하여 상단 지방층을 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 100 마이크로 리터를 제외한 모든 상등액을 제거하십시오.

PBS 1밀리리터로 펠릿을 다시 매달아 세척합니다. 그런 다음 5ml 튜브에 1ml의 멸균 PBS를 추가하여 음성 대조군을 준비합니다. 서스펜션을 깨끗한 1포인트 5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 1분 동안 5000배 G로 회전시킵니다.

그런 다음 1000마이크로리터의 멸균 여과 피펫 팁을 사용하여 전체 상층액 지방층을 버립니다. 시료를 파괴하고 균질화하려면 베타 메르캅토에탄올이 함유된 600마이크로리터의 용해 완충액을 펠릿에 추가하고 현탁액을 비드 튜브로 옮깁니다. 용해 완충액과 20마이크로리터의 박테리아 모의 샘플이 포함된 positive control 1개를 준비합니다.

모든 비드 튜브를 15초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 그런 다음 섭씨 37도 및 700-800RPM의 온도 조절 와류에서 샘플을 10분 동안 가열합니다. 튜브를 자동 시료 분열기 어댑터 세트에 로드합니다.

그런 다음 30헤르츠에서 1분 동안 샘플을 비드 비트로 두드립니다. 어댑터 세트를 분해하고 샘플 플레이트와 함께 수동으로 전환합니다.ample 플레이트에서 기기의 왼쪽 로봇 팔에서 오른쪽 로봇 암으로 이동합니다. 30헤르츠에서 튜브를 1분 더 비드로 치다가 17, 200배 G, 25°C에서 3분 동안 튜브를 원심분리합니다.

200마이크로리터 피펫을 사용하여 상층액을 모두 제거하되 샘플 상단의 지방층이나 하단의 비드 잔류물을 취하지 않도록 주의합니다. 상등액을 균질화 컬럼에 도포합니다. 그런 다음 최대 속도와 섭씨 25도에서 3분 동안 컬럼을 원심분리합니다.

350마이크로리터의 엘루이드를 2밀리리터 제조업체의 마이크로원심분리기 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DNA를 분리하려면 뚜껑을 자르고 DNA와 RNA를 위한 개별 스핀 컬럼의 가장자리를 매끄럽게 만듭니다. 수집 튜브가 없는 DNA 스핀 컬럼을 로터 어댑터에 삽입합니다.

그런 다음 수집 튜브를 버리십시오. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 자동 DNA/RNA 정제 기기의 로딩 차트에 따라 와류가 있는 2밀리리터 튜브를 셰이커에 삽입합니다. 1 포인트 5 밀리리터 수집 튜브에 라벨을 붙이고 로터 어댑터에 삽입합니다.

그런 다음 자동 DNA/RNA 정제 기기의 로딩 차트에 따라 로터 어댑터를 원심분리기에 설정합니다. 필터 팁, RNase free water 및 시약을 기기의 시약 블록에 삽입한 후 기기의 뚜껑을 닫고 기기에서 맞춤형 DNA 정제 프로그램을 실행합니다. 반응이 완료되면 셰이커에서 튜브가 포함된 샘플을 채취하고 샘플이 남아 있으면 단기 보관을 위해 섭씨 영하 20도, 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

작업 영역과 PCR 마스터 믹스를 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 50-100마이크로리터의 DNA 샘플을 96웰 플레이트 맵에 따라 32웰 기기 샘플 어댑터에 로드합니다. 각 PCR 플레이트에 대해 깨끗한 1포인트 5밀리리터 수집 튜브에 30마이크로리터의 PCR 물을 피펫팅하여 두 개의 음성 대조군을 설정합니다. 그런 다음 모든 샘플을 32웰 기기 샘플 어댑터에 놓고 캡을 열린 위치에 고정합니다.

기기의 시약 어댑터에서 특정 바코드 번호가 있는 각 리버스 프라이머의 캡을 한 번에 하나씩 제거합니다. 로봇 액체 처리기를 로드하려면 가장자리 효과를 피하기 위해 시약 어댑터를 B1.In 위치에 놓고 어댑터의 한쪽 가장자리를 그립 쪽에 조심스럽게 놓고 다른 쪽 가장자리를 천천히 아래로 내립니다. 어댑터의 모든 모서리를 눌러야 합니다.

샘플 어댑터를 위치 C1에 놓고 어댑터의 모든 모서리를 밀어야 합니다. 그런 다음 5 밀리리터 마스터 믹스를 소용돌이칩니다. 캡을 열고 기기의 마스터 믹스 및 시약 블록의 A 위치에 놓습니다.

절반 스커트 PCR 플레이트를 고정하기 위한 96웰 기기의 어댑터에 PCR 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 실행을 시작하고 새 파일로 저장합니다. 실행이 완료되면 오류가 없는지 확인합니다.

그런 다음 12개 또는 8개의 스트립 캡을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 격렬하게 소용돌이를 일으키고 96웰 플레이트 스피너를 사용하여 1분 동안 플레이트를 회전시킵니다. 마지막으로 플레이트가 포스트 증폭실로 이동하고 열 순환기에 로드될 때까지 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.

PCR 증폭 후 텍스트 프로토콜에 따라 품질 관리 및 라이브러리 준비를 수행합니다. 프로토콜의 첫 번째 QC 단계는 16SV4 영역의 PCR 증폭을 따릅니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 각 샘플에서 1마이크로리터의 PCR 산물을 전기영동으로 분석하여 350 내지 450 염기쌍의 예상 크기 범위 내에 있음을 확인했습니다.

일부 모유 샘플은 더 적은 양의 특정 제품을 생성했는데, 이는 해당 샘플에서 추출된 미생물 DNA의 수치가 낮거나 추출 중 PCR 억제제가 이월되었음을 시사합니다. 각 샘플에 대한 특정 산물의 정량화는 염기서열분석을 위한 샘플의 동일한 몰 풀링에 필요한 부피를 결정하는 데 필수적이었습니다. 표적 염기서열분석(targeted sequencing)을 위한 풀링된 라이브러리는 일반적으로 특정 PCR 산물에 의해 지배됩니다.

라이브러리에 상당한 양의 비특이적 산물이 있는 경우, 워크플로우에 겔 정제 단계를 추가해야 합니다. 염기서열분석 결과는 모유 마이크로바이옴과 관련된 분류군의 높은 다양성과 각 샘플에 대한 염기서열분석 리드 수의 가변성을 보여줍니다. 대조적으로, 박테리아 모의에 대한 분류군 구성 및 리드 수는 이전 워크플로우 실행에서 모의에 대해 얻은 결과와 유사했으며, 이는 모유 샘플에서 관찰된 변동성이 내재적 워크플로우 변동성의 함수가 아니라 진정한 실험 결과임을 시사합니다.

시퀀서를 밤새 가동하는 경우, 모든 샘플이 초기 PCR 실행으로 증폭되면 12-24개의 샘플에 대해 이 기술을 이틀 만에 완료할 수 있습니다. 그렇지 않은 경우 또 다른 쉘 데이가 필요합니다. 이 절차를 시도할 때 오염을 방지하기 위해 PCR 전 영역에서 PCR 후 영역으로만 이동하는 것이 중요합니다.

교차 오염을 방지하기 위해 장갑을 자주 교체하는 것도 중요합니다. 인체 샘플로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 항상 적절한 보호 장비 및 생물 안전 캐비닛과 같은 예방 조치를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.