Name: 초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 학습하세요 미세플레이트 형광법을 이용한 플라빈 함유 미토콘드리아 탈수소효소의 초과산화물/과산화수소 및 NADH 생성률 동시 정량 측정 방법을. 이 기법은 개별 생성 부위의 활성산소종 생성 잠재력을 정확하게 평가할 수 있습니다.

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이 작품은 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에 의해 투자 되었다. 동영상 제작 교육 및 학습 (CITL) 뉴펀들랜드 메모리얼 대학에 혁신을 위한 센터와 공동으로 실시 했다.

1. 화학 물질 고 정화 효소
<ol><li>다음과 같은 재료를 조달: PDHC 및 KGDHC 돼지 심장 근원 (또는 다른 정화 미토 콘 드 리아 flavoenzyme); H2O2 (30% 솔루션), pyruvate, α ketoglutarate 나드+, NADH, CoASH, 티 아민 파이 인산 (TPP), 마 니 톨, HEPES, 자당, EGTA, 3-메 틸-2-옥 valeric 산 (KMV), superoxide dismutase (잔디), 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP), 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine 시 약 (AUR), 그리고 CPI-613.</li>
</ol>2. 분석 결과 및 시 약 준비 계획
<ol><li>96 잘 접시에 표 1 에 따라 분석 결과를 설정 합니다. 참고: 각 반응에 대 한 전체 볼륨은 200 µ L. 주식 농도의 시 약 20 µ L 추가 되도록 조정 하는 각 음에. 그러면 공동 인자와 잘 분석 결과 시작 하기 전에 각 반응에 기판의 급속 한 추가.</li>
	<li>220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 1mm EGTA, 및 20 mM HEPES (HCl로 pH 7.4)를 포함 하는 반응 버퍼를 준비 합니다. 참고:이 다른 정제 효소의 물리적 특성에 따라 변경할 수 있습니다.</li>
	<li>효소 활동 분석 실험14,,1617 를 사용 하 여 오염 또는 immunoblot에 의해 순화 KGDHC 또는 PDHC를 검사 또는 Coomassie 얼룩5.</li>
	<li>표 1에서 작업 솔루션 농도 의하여 반응 버퍼에 모든 시 약을 준비 합니다.</li>
	<li>모든 시 약 1 mL-20 ° c.에 aliquots로 저장 자동 산화 및 반복된 동결-해 동 자발적인 저하를 방지 하기 위해 100 µ L aliquots에서 pyruvate 및 α ketoglutarate-80 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>DMSO의 1 mL에 마스터 재고 AUR 시 약을 준비 하 고 반응 버퍼에서 100 µ M을 희석. 스토어 빛 으로부터 보호입니다. 참고: 여기, 100 µ M 작업 솔루션은 2 ~ 3 주마다 신선한 고 빛 으로부터 보호.</li>
</ol>3. 분석 결과 서식 파일 설정
<ol><li>듀얼 측정 기능으로 단색 microplate 리더에 분석 결과 절차를 설정 합니다.</li>
	<li>"프로토콜"을 선택 하 여 읽기 프로시저를 정의 합니다. 그런 다음 "프로시저"를 클릭 합니다.</li>
	<li>25 ° c (그림 1A) "온도"를 설정 합니다.</li>
	<li>(그림 1A) 읽기 조건을 설정할 "운동 시작"을 클릭 합니다. 시간 및 읽기 간격/실험의 수를 설정 합니다.</li>
	<li>클릭 "읽기" (그림 1B). 참고: 샘플 최고의 위치에서 읽는 50의 이득. 시간: 5 분, 간격 30-s 읽기. 채널 1: Resorufin 형광-여기/방출 = 565 nm:600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 채널 2: NADH autofluorescence-여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.</li>
	<li>"읽기", 웰 스 모니터 (예를 들어, a 1-a 4와 B1 B4)을 선택 합니다.</li>
	<li>"키네틱 끝"을 선택 합니다.</li>
</ol>4. 표준 곡선
<ol><li>시 약을 해 동 하 고 필요할 때까지 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>
NADH 표준 곡선 (그림 2A)
	<ol>
<li>반응 버퍼에 0.5-10 m m의 농도 범위에서 NADH에 대 한 작업 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>180 µ L 반응 버퍼를 포함 하는 웰 스 솔루션 집중 작업 각 NADH에서 20 µ L aliquots를 추가 합니다. 각 NADH의 최종 농도 잘는 0.05-1 m m.</li>
		<li>"읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm. 참고:이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
AUR 표준 곡선 (그림 2B)
	<ol>
<li>반응 버퍼; 과산화 수소의 작업 주식 준비 사진 농도 범위 200-4000 nM에서.</li>
		<li>각 잘에 반응 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 U/mL, 우물에 최종 농도 = 3 U/mL =) 20, 잔디의 µ L (재고 농도 일 250 U/mL, 우물에 최종 농도 = 25 U/mL =), 그리고 AUR의 20 µ L (재고 농도 작업 = 100 µ M 잘에서 최종 농도 = 10 µ M) 각 잘 포함 반응 버퍼를.</li>
		<li>잘 포함 하는 버퍼 및 분석 실험 시 약 각을 재고 솔루션 작업 각 H2O2 의 20 µ L를 추가 합니다. 최종 반응 볼륨 200 µ L 이며 각 우물에서 H2O2 의 최종 농도 20-400 nM 이다.</li>
		<li>25 ° c.에서 플레이트 리더에서 1 분에 대 한 번호판을 품 어</li>
		<li>"읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 = 565 nm/600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. O2 ●/H2 O2 릴리스 및 KGDHC 및 PDHC에 의해 NADH 생산 측정
<ol><li>다른 시 약의 추가의 순서에 대 한 표 1 를 참조 하 여 각 볼륨과 각 작업 솔루션의 농도 추가 잘.</li>
	<li>각 잘에 반응 버퍼의 40 µ L를 추가 합니다. 분석 실험 KMV 또는 CPI-613를 사용 하 여, 각 음을 버퍼의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>PDHC 또는 KGDHC의 20 µ L를 추가 (1 U/mL, 잘 당 최종 농도의 작업 사진 = 0.1 U/mL)을 각 영역.</li>
	<li>2 분 동안 25 ° C에서 PDHC 및 KGDHC를 품 어.</li>
	<li>KMV의 20 µ L을 추가 (작업 사진 = 100 mM, 최종 농도 = 10 m m) 또는 CPI-613의 20 µ L (재고 농도 작업 = 1.5 m m, 최종 농도 = 150 µ M) (표 2). 참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.</li>
	<li>25 ° c.에 1 분 동안 품 어 참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.</li>
	<li>HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 단위/mL, 우물에 최종 농도 = = 3 단위/mL) 및 잔디의 20 µ L (재고 농도 일 250 단위/mL, 우물에 최종 농도 = 25 단위/mL =) 각 잘 하.</li>
	<li>코엔자임 A의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 = 1mm, 최종 농도 = 0.1 m m), 20 TPP의 µ L (재고 농도 작업 = 3 mM, 최종 농도 = 0.3 m m), 고 나드+ 의 20 µ L (재고 농도 작업 = 10 m m, 최종 농도 = 1 m m) 각 w 내 말이 맞지.</li>
	<li>보호 은박지 덮 음에서 AUR 시 약을 제거 하 고 추가 20 µ L 각 잘.</li>
	<li>Pyruvate의 20 µ L 추가 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m) PDHC 및 α ketoglutarate 웰 스 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m)를 KGDHC를 포함 하는 우물.</li>
	<li>클릭 "읽기" 운동 측정을 시작 합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>키보드에서 'CTRL' 버튼 누른 1 (그림 3A) 채널에 해당 하는 모든 운동 측정을 포함 한 그래프를 생성 하는 우물을 클릭 합니다.</li>
	<li>상대 형광 단위 (RFU) (그림 3B) 다른 시간 지점에서 측정에 대 한 원시 값에 대해 오른쪽 상단에 있는 보기 아이콘에 "데이터"를 클릭 합니다.</li>
	<li>분석 (표 3)에 대 한 값을 내보냅니다.</li>
	<li>"그래프" 드롭 다운 메뉴 오른쪽 상단에 (그림 3B) 형광 채널 2와 관련 된 RFU 값에 액세스 하려면 클릭 합니다.</li>
	<li>채널 2 단계 6.1 6.3 반복 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+years+of+Mitchell%27s+proton+circuit%3A+From+little+grey+books+to+little+grey+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li>
<li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li>
<li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li>
<li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28675747">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+cellular+energy+transduction+and+its+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity.</a> Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).</li>
<li>Ambrus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+oxygen+species+by+human+and+bacterial+pyruvate+and+2-oxoglutarate+dehydrogenase+multienzyme+complexes+reconstituted+from+recombinant+components%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components.</a> Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).</li>
<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li>
<li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li>
<li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li>
<li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li>
<li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+%28E3%29+deficiency%3A+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li>
<li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li>
<li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29+from+bovine+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li>
<li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart%3A+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li>
<li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase%2C+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li>
</ol>

공개는 아무 상관이 있다.

이 프로토콜은 이후 유리, 1) 그것은 어떤 경쟁 반응을 방해할 수 있는 그렇지 않으면 H2O2 감지 (예, 항 산화 시스템 또는 기타 소스 선생님의), 2를 제거)의 기본 속도의 직접 평가 제공 선생님 분리를 포함 하는 플 라빈 미토 콘 드리 아 효소, 3) 원시의 비교를 허용 한다 선생님 릴리스 2의 속도 또는 더 정화 플 라빈 기반 dehydrogenases, 4) 선생님과 효소 활동, 및 5의 속도의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다) 선생님 자료에 대 한 선택적 경쟁력 억제제의 수 있습니다. 우리의 그룹 및 다른 사람 사용이 메서드 이전 간행물 allosteric 여 선생님의 규칙을 검사와 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육14,16, 산화 환 원 신호 메커니즘 실시 전에 실험 17</su...

영양소 대사의 궁극적인 목표는 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 만드는 것입니다. 포유류 세포에서이 미토 콘 드리 아, 탄소에 ATP에 저장 된 에너지를 변환 하는 더블 membraned 세포에서에서 발생 합니다. ATP의 생산에는 탄소는 두 명의 전자 사업자, NADH, 플 라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FADH2)1을 형성 하는 미토 콘 드리 아에 의해 combusted 때 시작 됩니다. NADH와 FADH2 는 다음 산화 다 소 단위 호흡기 복합물에 의해 I 및 II, 각각, 그리고 자유 전자는 터미널 전자 수락자 분자 산소 (O2) 복잡 한 41에 ferried. 열역학으로 호의 베푸는 "내리막" 전송 전자의 O2 는 체인의 끝에는 양성자의 수출에는 intermembrane에 결합 I, III, 및 IV 단지에 의해 공간. 이 양성자 (양성자 동기 힘), 임시 형태의 ATP2를 만들기 위해 복잡 한 V에 의해 도청 깁스 자유 에너지의 막 횡단 전기 그라디언트를 만듭니다. 미토 콘 드리 아에서 전자 이동 반응은 ATP 생산을 완벽 하 게 결합 하지. Krebs 사이클 및 호흡기 체인에 여러 지점에서 전자 중간 형태로 선생님3O2 작용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아에서 생성 된 가장 생물학적으로 관련 선생님은 O2●- H2O2. O2●- 종종 간주 됩니다 미토 콘 드리 아에 의해 형성 된 근 선생님, 비록 그것은 생산의 관련 된 자유 O2●- 및 H2O2의 혼합물 형성 분명 지금 보 플 라빈의 급진적인 화학 그룹4,5. 높은 수준에서 선생님 위험할 수 있습니다, 손상 산화 조6의 결과로 세포 기능에 필요한 생물 학적 성분. 그러나, 낮은 금액에서 미토 콘 드리 아 선생님 중요 한 신호 전달 기능을 성취 한다. 예를 들어, 미토 콘 드리 아에서 H2O2 릴리스 T-세포 활성화, 스트레스 신호 (예를들면, Nrf2 신호 통로의 유도), 세포 증식 및 분화, 유도 제어에 연루 되어 있다 인슐린 신호 릴리스, 그리고 동작7먹이. 상당한 진행 선생님의 신호 전달 기능을 이해 했다. 그러나, 중요 한 질문은 여전히 남아 있다 관계는 미토 콘 드리 아 효소 역할을 가장 중요 한 소스 및 생산 제어 하는 방법은.
선생님 자료 생산의 사이트에 의해 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다: 1)는 전자 기증의 농도 사이트, 2) 전자 기부 사이트, 3)에 대 한 액세스 산소, 4) 고 농도의 산화 상태 그리고 산화 기판3, 의 종류 8 , 9. 미토 콘 드리 아에서 다른 같은 NADH 및 막 잠재적인 힘의 농도 또한 선생님 생산8,10영향 요인. 예를 들어 O2●-/ H2O2 생산 순화 PDHC 또는 KGDHC의 속도 증가 증가 NADH 가용성5,11. 이 시나리오에서 전자는 흐르는 거꾸로 NADH에서 PDHC 또는 KGDHC, O2●-/ H2O2 생산12에 대 한 사이트의 E3 소 단위에 유행 센터. 마찬가지로, 나드+ 의 KGDHC12에서 선생님 방출 감소 반대의 효과 있다. 따라서, 제어 항목 또는 선생님의 사이트에서 전자의 출구는 얼마나 많은 O2●-/ H2O2 를 형성 변경할 수 있습니다. 예를 들어, PDHC 또는 KGDHC CPI-613, 리 포 산, 결과 거의 90%에 감소 O2●-/ H2O2 생산13아날로그와 E2 소 단위를 차단 합니다. 와 화학 S glutathionylation 촉매, diamide disulfiram, O2●-/H2O2 에 의해 생산 PDHC 또는 KGDHC E에 glutathione의 활용을 통해 거의 폐지는 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 2 소 단위14. PDHC 및 KGDHC의 E2 소 단위를 통해 전자의 흐름 차단에 대 한 트레이드 오프는 (예를 들어, 복잡 한 III) 전자 수송 사슬에 의해 선생님 형성 감소는 NADH 생산 감소 이다. 이 또한 전자 수송 사슬에 의해 ATP 출력을 줄일 수 있습니다. 전반적으로, 선생님 생산의 사이트에 전자 항목을 차단 하는 것은 O2●-/ H2O2 생산을 제어 하는 매우 효과적인 수단 수 있습니다.
미토 콘 드리 아에는 최대 12 잠재적인 O2●-/ H2O2 소스6포함할 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분은 포함 하는 플 라빈 효소 O2●- 및 H2O2의 혼합물을 생성 하는. 다른 기판 및 억제제 조합을의 사용의 호흡기 단지 및 미토 콘 드리 아 dehydrogenases 역할 고용량 O2●-/ H2O2 에 사이트를 형성 하는 식별에 대 한 허용 다른 조직3. PDHC 및 KGDHC 높은 용량 O2●-/ H2O2 근육과 간 미토 콘 드리 아13,15발광 사이트 역할을 보여왔다. 그러나, 몇 가지 문제가 남아 O2●-/ H2O2 다른 기판 및 억제제 조합에 있는 미토 콘 드리 아에 영향 개별 사이트의 잠재적인 형성의 시험에 관한 효소의 활동입니다. 이것은 원치 않는 쪽 반응 (예를 들어, O2●-/ H2O2 의 효소 이외의 사이트의 형성)의 존재로 인해 오염 생 영양분 (예를 들어,지방산 산) 또는 세포 (예:, peroxisomes 또한 O2●/H2O2를 형성), 그리고 선택도, 부족 억제제의 사용 및/또는 완전히 선생님 생산을 억제 하지 않는 화합물의 사용. 특정 억제제 또한 미토 콘 드리 아 생체 및 전자 흐름의 방향을 변경할 수 있습니다 그리고이 선생님 자료 생산의 다른 사이트에서 변경 하 고 결과 혼동 한다. 절대 릴리스에 대 한 O2●/H2O2 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 요금은 또한 O2●- 및 H2O2 의 높은 농도 때문에 계량 하기 어려운 행렬 및 intermembrane 공간에서 효소를 제거합니다. 따라서, O2●-/ H2O2 릴리스 측정을 방해할 수 있는 모든 경쟁 반응의 제거 때 유용할 수 있습니다 식별 하는 고용량 O2●-/H2O2 사이트를 형성.
여기, 우리는 정화 플 라빈 종속 dehydrogenases에 의해 O2●-/ H2O2 생산과 NADH 형성의 동시 시험을 허용 하는 간단한 방법 제시. 정제 효소를 사용 하 여 원치 않는 선생님 측 반응 형성 및 효소 저하 선생님 제거할 수 있습니다 네이티브 O2●-/ H2O2 생산 속도의 개별 flavoenzymes에 대 한 보다 정확한 측정을 위한 수 있도록. 이 메서드는 O2●-/ H2O2 O2●-/H2O 화면 잠재적인 사이트별 억제제 또는 다른 정화 dehydrogenases의 능력을 형성을 직접 비교를 사용할 수 있습니다. 2 출시입니다. 마지막으로, O2●/H2O2 와 NADH 생산을 동시에 측정의 효소 활동, 선생님 자료 용량 관계의 실시간 평가 대 한 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>피루브산 탈수소효소 복합체</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td><td>정제 플라보엔자임</td></tr><tr><td>알파-케토글루타레이트 탈수소효소 복합체</td><td>SIGMA</td><td>K1502-20UN</td><td>정제 플라보효소</td></tr><tr><td>30% 과산화수소 용액</td><td>SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>시약, 표준 곡선</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>SIGMA</td><td>N0632-1G</td><td>시약, 활성/ROS 방출 분석</td></tr><tr><td>NADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>시약, 표준 곡선</td></tr><tr><td>피루브산</td><td>SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>시약, 활성/ROS 방출 분석,</td></tr><tr><td>알파-케토글루타레이트</td>, <td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>시약, 활성/ROS 방출 분석,</td></tr><tr><td>CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>시약, 활성/ROS 방출 분석</td></tr><tr><td>티아민 피로인산</td>염 <td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>시약, 활성/ROS 방출 분석</td></tr><tr><td>만니톨</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td>완충 성분</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td><td>완충 성분</td></tr><tr><td>자당</td><td>SIGMA</td><td>S7903-250G</td><td>완충 성분</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td><td>완충 성분</td></tr><tr><td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>시약, ROS 방출 억제제</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-482709</td><td>시약, ROS 방출 억제제</td></tr><tr><td>SOD</td><td>SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>시약, ROS 방출 감지</td></tr><tr><td>양고추냉이 과산화효소</td><td>SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>시약, ROS 방출 감지</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Thermofisher</td><td>A36006</td><td>시약, ROS 방출 검출</td></tr><tr><td>Biotech Synergy 2 마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>분석용 마이크로플레이트 리더</td></tr><tr><td>Gen5 소프트웨어</td>, <td>원시 RFU 수집에 사용되는</td><td>BioTek Instruments</td><td></td> 소프트웨어,</tr><tr><td>Graphpad, Prism</td>, <td>Graphpad 소프트웨어</td><td></td><td>, 데이터 분석,</td></tr><tr><td>Microsoft EXCEL</td>, <td>Microsoft</td><td></td><td>소프트웨어, 데이터 분석</td></tr></tbody></table>

초과/수소 과산화 수소와 nadh 생산 미토 콘 드리 아 dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

그것은 알려졌다 미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)의 최대 12 효소 소스 포함 될 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분 플 라빈 종속 된 호흡 단지 등 초과 (2O●-), 과산화 수소 (H2O2)의 혼합물을 생성 하는 dehydrogenases. 고립 된 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트의 선생님 생산 잠재력의 정확한 정량화의 항 산화 방어 시스템 측면 또한 O2●/H2O2를 형성 하는 존재 인 전하실 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 생체를 중단 시킬 수 있는 일반적인 반응 억제제의 사용 또한 생산의 다른 사이트에서 선생님 자료를 변경 하 여 측정을 손상 수 있습니다. 여기, 우리는 정화 플 라빈에 연결 된 dehydrogenases에 의해 H2O2 릴리스 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 생산의 동시 측정을 위한 쉬운 방법 제시. 여기 우리의 목적을 위해 순화 된 pyruvate 효소 복합물 (PDHC)와 α ketoglutarate 효소 복잡 한 (KGDHC) 돼지 심장 근원의 예제로 사용 했습니다. 이 메서드는 네이티브 H2O2 릴리스 요금 생산의 개별 사이트의 정확한 측정을 위해 선생님과 항 산화 시스템의 다른 잠재적인 소스를 제거 하 여 수 있습니다. 또한,이 메서드는 H2O2 출시와 효소 활동, 효과의 심사 및 선생님 생산 억제제의 선택 간의 관계의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 전반적으로,이 접근의 네이티브 선생님 릴리스 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육 섬유 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 효소의 심층 평가 대 한 수 있습니다.

그림 3A 순화 KGDHC에 의해 H2O2 와 NADH 생산의 동시 측정 하는 동안 수집 된 RFU에 대 한 대표적인 추적을 제공 합니다. 각 시간 간격에 대 한 원시 RFU 데이터는 그림 3B에서 묘사 된다. 원시 RFU 데이터 분석에 대 한 다음 내보내집니다. 그림 2에 제시 하는 표준 곡선에서 추정 하 여 NADH와 H2O2 5 분 동안 각 측정 간격에서 형성의 절대 금액을 확인할 수 있습니다. 이 계산의 예는 표 3에서 제공 됩니다. 에 의해 형성 된 NADH와 H2O2 의 양을 일단 KGDHC 또는 다른 간격 PDHC 결정, 값이 복사 되 고 추가 분석을 위...

미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)을 생산할 수 있는 여러 종속 플 라빈 효소 포함. 선생님을 모니터링 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 릴리스 원치 않는 측 반응 때문에 도전 이다. 우리 정화 flavoenzymes 고 미 판 fluorometry를 사용 하 여 선생님 자료에 대 한 기본 속도의 직접 평가 대 한 쉽고, 싼 방법 제시.

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로플레이트 형광측정법을 사용하여 정제된 플라빈 함유 미토콘드리아 탈수소효소의 과산화물/과산화수소 및 NADH 생산 속도를 정량화하는 것입니다. 미트로콘드리아는 최대 12개의 서로 다른 과산화물/과산화수소 형성 부위를 포함할 수 있으며, 이는 분리된 미토콘드리아와 함께 다른 기질 및 억제제 조합을 사용하여 확인되었습니다. 그러나 분리된 미토콘드리아에서 개별 생산 현장의 방출 용량을 정확하게 정량화하는 것과 관련하여 여전히 몇 가지 어려움이 남아 있습니다.그리고 이것은 활성 산소 종을 생성하는 원치 않는 부작용뿐만 아니라 측정을 방해할 수 있는 첨가제의 사용 외에도 항산화제의 존재 및 특이성이 부족한 억제제의 사용과 관련이 있습니다. 여기에서는 정제된 플라빈 의존성 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 과산화물/과산화수소 및 NADH 생산을 동시에 측정하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 원치 않는 부작용 및 활성 산소 종 소멸 시스템을 제거함으로써 개별 생산 현장의 ROS 생성 잠재력을 직접적이고 정확하게 정량화할 수 있기 때문에 유리합니다.ROS와 NADH 생산을 동시에 측정하면 개별 효소의 과산화물/과산화수소 형성 잠재력 및 활성을 직접 비교할 수 있으며, 이는 미토콘드리아로 분석을 수행하기 전에 ROS 생산을 위한 억제제를 스크리닝하는 데 유용할 수 있습니다. 여기에서는 돼지 심장 기원의 피루브산 탈수소효소 복합체와 알파-케토글루타레이트 탈수소효소 복합체를 예로 사용할 것입니다. 둘 다 플라빈을 함유한 효소이며 활성 산소 종에 대한 알려진 공급원입니다.또한, 이 두 효소는 쉽게 정제될 수 있습니다. 과산화물/과산화수소 및 NADH의 동시 측정은 개화의 변화를 추적하여 달성됩니다. NADH는 자체 고유 개화 특성을 가지고 있어 생산을 쉽게 측정할 수 있습니다.한편 과산화물/과산화수소의 변화에는 과산화물 디스뮤타타제, 양고추냉이 과산화효소 및 amplex 초적색 시약이 필요합니다. 양 고추 냉이 과산화 효소와 과산화수소가 존재하면 amplex ultrared는 비 형광 분자에서 형광 resorufin으로 전환됩니다. Superoxide dismutase는 연구 중인 탈수소효소에 의해 형성된 모든 과산화물이 과산화수소로 전환되도록 합니다.분석을 설정하기 전에 작업 솔루션이 준비됩니다. 분석을 간소화하기 위해 모든 시약은 20마이크로리터 분취액에 담긴 96웰 블랙 플레이트의 웰에 추가됩니다.

simultaneous-measurement-superoxidehydrogen-peroxide-nadh-production

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 reductive 및 산화 반 반응 모두를 조사하기 위해 중지 흐름 악기의 사용을...

중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을...

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

근원:엘레트라 레오1, 루이자 H.D. 카르도소1, 사빈 슈미트1, 에리히 그나이거11오로보로스 악기이 비디오는 산소 플럭스가 살아있는 포유류 세포와 투과화된 포유류 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 다양한 호흡 상태를 특성화하기 위해 디지토닌, 대사 기질, ADP, 언커플러 및 억제제를 순차적으로 사용하는 방법을 보여줍니다. 생성된 산소 플럭스 프로파일은 정의된 조건에서 미토콘드리아 기능과 에너지 결합 효율을 나타냅니다.

살아있는 세포와 투과화된 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하기 위한 산소 플럭스 측정

공 초점 주사 현미경은 살아있는 동물의 관류 심장이나 골격근에 단일 미토콘드리아 이벤트 이미징에 적용된다. 수퍼 옥사이드 깜박이고 막 잠재적 인 변동으로 단일 미토콘드리아 프로세스의 실시간 모니터링은 생리학 관련 맥락에서 병리학 섭동 동안 미토콘드리아 기능의 평가를 가능하게한다.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징 생체

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

여기서, 우리는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 형광 현미경으로 부착 된 세포에서 세포 ROS 국소화를 시각화하고 형광 판 판독기와 ROS 강도를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

본 연구는 호흡량 측정 및 효소 분석을 통해 미토콘드리아 기능에 대한 생체이물의 효과를 연구하는 방법론을 소개한다. 다양한 종의 전자 전달 사슬 조절을 조사하여 곤충 매개체 매개 질병에 대한 표적 생물 살충제 개발에 대한 통찰력을 제공합니다.

고립된 미토콘드리아에서 이종생물 수송 및 효과 공개: 호흡량 측정 및 효소 분석의 통찰력

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

학습하세요 미세플레이트 형광법을 이용한 플라빈 함유 미토콘드리아 탈수소효소의 초과산화물/과산화수소 및 NADH 생성률 동시 정량 측정 방법을. 이 기법은 개별 생성 부위의 활성산소종 생성 잠재력을 정확하게 평가할 수 있습니다.

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

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