초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로플레이트 형광측정법을 사용하여 정제된 플라빈 함유 미토콘드리아 탈수소효소의 과산화물/과산화수소 및 NADH 생산 속도를 정량화하는 것입니다. 미트로콘드리아는 최대 12개의 서로 다른 과산화물/과산화수소 형성 부위를 포함할 수 있으며, 이는 분리된 미토콘드리아와 함께 다른 기질 및 억제제 조합을 사용하여 확인되었습니다. 그러나 분리된 미토콘드리아에서 개별 생산 현장의 방출 용량을 정확하게 정량화하는 것과 관련하여 여전히 몇 가지 어려움이 남아 있습니다.

그리고 이것은 활성 산소 종을 생성하는 원치 않는 부작용뿐만 아니라 측정을 방해할 수 있는 첨가제의 사용 외에도 항산화제의 존재 및 특이성이 부족한 억제제의 사용과 관련이 있습니다. 여기에서는 정제된 플라빈 의존성 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 과산화물/과산화수소 및 NADH 생산을 동시에 측정하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 원치 않는 부작용 및 활성 산소 종 소멸 시스템을 제거함으로써 개별 생산 현장의 ROS 생성 잠재력을 직접적이고 정확하게 정량화할 수 있기 때문에 유리합니다.

ROS와 NADH 생산을 동시에 측정하면 개별 효소의 과산화물/과산화수소 형성 잠재력 및 활성을 직접 비교할 수 있으며, 이는 미토콘드리아로 분석을 수행하기 전에 ROS 생산을 위한 억제제를 스크리닝하는 데 유용할 수 있습니다. 여기에서는 돼지 심장 기원의 피루브산 탈수소효소 복합체와 알파-케토글루타레이트 탈수소효소 복합체를 예로 사용할 것입니다. 둘 다 플라빈을 함유한 효소이며 활성 산소 종에 대한 알려진 공급원입니다.

또한, 이 두 효소는 쉽게 정제될 수 있습니다. 과산화물/과산화수소 및 NADH의 동시 측정은 개화의 변화를 추적하여 달성됩니다. NADH는 자체 고유 개화 특성을 가지고 있어 생산을 쉽게 측정할 수 있습니다.

한편 과산화물/과산화수소의 변화에는 과산화물 디스뮤타타제, 양고추냉이 과산화효소 및 amplex 초적색 시약이 필요합니다. 양 고추 냉이 과산화 효소와 과산화수소가 존재하면 amplex ultrared는 비 형광 분자에서 형광 resorufin으로 전환됩니다. Superoxide dismutase는 연구 중인 탈수소효소에 의해 형성된 모든 과산화물이 과산화수소로 전환되도록 합니다.

분석을 설정하기 전에 작업 솔루션이 준비됩니다. 분석을 간소화하기 위해 모든 시약은 20마이크로리터 분취액에 담긴 96웰 블랙 플레이트의 웰에 추가됩니다. 웰의 각 반응에 대한 부피는 200마이크로리터이므로 작동 용액은 반응 웰에서 발견되는 농도의 10배입니다.

다음으로, NADH 자가꽃과 레소루핀 형광의 이중 측정을 위한 동역학 분석을 실행하도록 마이크로플레이트 리더를 프로그래밍합니다. 이 작업은 먼저 절차를 선택하고 섭씨 25도로 설정하여 수행됩니다. 그런 다음 Start Kinetic을 클릭합니다.

약 5분 동안 실행할 시간을 설정한 다음 30초의 형광 판독 간격을 선택합니다. 그런 다음 Read를 클릭하고 분석에 대한 형광 측정 파라미터를 설정합니다. 여기에서 프로브의 위치, 개화의 변화를 추적하는 데 사용되는 파장 및 판독될 웰이 소프트웨어에 입력됩니다.

형광 판독을 위한 다양한 채널도 선택되며, 그 중 하나는 376나노미터 여기 파장과 450나노미터 방출 파장으로 설정된 NADH의 자가백화 전용입니다. resorufin 형광의 변화는 565 나노 미터 및 600 나노 미터에서 추적됩니다. 분석 조건이 설정되면 개별 웰에 NADH와 과산화물/과산화수소 생산을 동시에 측정하는 데 필요한 완충액과 다양한 시약이 로드됩니다.

우물에 다른 시약을 적재하는 순서는 다음과 같습니다. 먼저, 필요한 양의 완충액을 웰에 첨가한 후 20마이크로리터의 정제된 효소 용액을 첨가합니다. 효소는 기기 내부에서 몇 분 동안 완충액에서 평형을 이룹니다.

그런 다음 나머지 시약을 다음 순서로 첨가합니다. 기판이 추가되면 시작을 누릅니다. 플레이트 캐리어가 리더에 들어가고 프로토콜이 시작됩니다.

분석하는 동안 원시 상대 형광 단위(RFU)에 대한 실시간 출력은 소프트웨어를 사용하여 추적할 수 있습니다. 사용자는 웰 레이아웃 위의 Data 탭을 사용하여 다양한 형광 판독 사이를 전환할 수 있습니다. 다른 형광 판독에 대한 곡선을 선택할 수 있습니다.

또한 키보드의 Control 키를 누른 상태에서 웰을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하면 다양한 반응을 실시간으로 비교할 수 있는 복합 그래프를 생성할 수 있습니다. 실험이 완료되면 마이크로플레이트 캐리어가 기기에서 나옵니다. 이 시점에서 RFU의 변경 사항에 대한 대표 그래프의 결과를 Excel로 내보냅니다.

원시 RFU 값은 먼저 대표 RFU 그래프에서 데이터를 클릭하여 내보냅니다. 이것은 NADH 및 resorufin 형광에 대한 원시 RFU 값 테이블을 생성합니다. NADH 또는 resorufin 형광의 변화에 해당하는 원시 RFU 번호를 동시에 내보낼 수 없다는 것은 아닙니다.

내보낸 결과는 분석을 위해 구성됩니다. 분석을 수행하기 전에 생성된 NADH 및 resorufin 형광에 대한 표준 곡선을 사용하여 시간이 지남에 따라 형성된 마이크로몰 내 NADH 및 피코몰 내 과산화물/과산화수소의 양을 계산할 수 있습니다. 그 다음에는 NADH 및 과산화물/과산화수소 생성 속도를 계산할 수 있습니다.

이 절차의 경우, 분석을 수행하기 전에 분리된 플라빈 함유 탈수소효소의 순도를 확인하는 것이 중요합니다. 이는 단백질에 대한 간단한 쿠마시 염색을 수행하거나 다른 기질이 있는 상태에서 효소의 활성을 분석함으로써 달성할 수 있습니다. DTT와 같은 환원제는 플라빈 결합 탈수소효소에 의한 과산화물/과산화수소 생산을 위한 기질로 사용될 수 있으므로 분석에서 생략하는 것이 좋습니다.

전반적으로 이 방법은 과산화물/과산화수소 생산을 위한 억제제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있고 다른 플라빈 결합 미토콘드리아 탈수소효소의 ROS 형성 용량을 직접 비교할 수 있다는 점에서 매우 유연합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 정제된 탈수소효소로 ROS 및 NADH 생산을 측정하는 방법을 자세히 이해할 수 있을 것입니다. 이 분석은 분리된 미토콘드리아를 사용한 보다 정교한 실험을 위한 디딤돌 역할을 할 수 있습니다.