Name: Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 급성 골수성 백혈병 및 환자 유래 이종이식 모델에서 유동세포측정법을 이용한 백혈병 줄기 세포 정량화 방법입니다. 이 기술은 대부분의 혈액학/종양학 연구실에서 표준 항체로 적용 가능합니다.

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이 작품은 일부 프랑스 협회 Laurette Fugain, LigueContre 르 암 (북한 센터), Fondation 드 프랑스 (백혈병 위원회), SIRIC Oncolille, 및 프랑스 국립 암 연구소에서 지원 됩니다.

우리는 과학적 목적을 위한 동물의 사용에 대 한 유럽 표준을 따른다. 이 연구는 지역 윤리 위원회 (#3097-2015120414583482v3)에 의해 승인 되었다.
1. 샘플 준비
<ol><li>골 수의 mL 당 1.8 mg의 농도에서 항 응 혈 약 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)을 포함 하는 튜브에 드 노 보 AML에서에서 골 (2 mL)를 수집 합니다.</li>
	<li>Ficoll 분리, 뒤 붉은 세포를 granulocytes, 단 세포를 분리 하는 밀도 그라데이션 분리를 수행 합니다. 골 3 양의 인산 염 버퍼 식 염 수에 희석 (PBS: NaCl 137 m m, KCl 2.7 m m, Na2HPO4 10 m m, KH2포4 1.8 m m). 조심 스럽게 희석된 골의 1 볼륨 1 양의 Ficoll 오버레이. 회전 브레이크 없이 300 x g에서 30 분. 새로운 무 균 튜브에 흰 버 피 코트 층의 mononucleated 세포를 전송 합니다.</li>
	<li>10 mL PBS의 셀을 두 번 씻어) 오염 혈 청 성분을 제거 하기 위해 5 분 동안 300 x g에서 원심과.</li>
</ol>2. 적혈구 (RBC)의 세포
<ol><li>셀에 세포의 용 해 버퍼 (염화 암모늄 0.8%)의 2 개 mL를 추가 작은, 소용돌이 부드럽게 하 고 5 분 x 300g에 5 분 원심 분리기에 대 한 실 온에서 품 어. 참고: 필요한 경우이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>워시 셀 PBS에는 이전 (1.3)를 설명합니다.</li>
</ol>3. 환자 xenografts 파생.
<ol><li>폭발 세포 골 수에서 Ficoll 분리 후 가져오고 immunomagnetic를 사용 하 여 세포 고갈 후 부정적인 선택 (CD3 T-와 B-세포에 대 한 CD20). 제조업체의 지침을 따릅니다.</li>
	<li>5 x 106 AML 폭발 셀 무조건된 NSG 쥐의 꼬리 정 맥에 주사. 금지 장치를 사용 하 여 꼬리 정 맥 주입을 촉진 하기 위하여. 계속 마우스 기존의 조건 및 특정 병원 체 자유로운 조건에서 특히 모든 시간, 개별 환기 케이지를 사용 하 여 층 류 후드 조작. 매 2 주, 모 세관 submandibular 컬렉션 메서드는 보통을 사용 하 여 혈액의 60 µ L를 걸릴. 장소 5 mL에 모 세관 튜브 하단 라운드. 작은 멸 균 거 즈 패드를 사용 하 여 부드러운 압력을 적용 하 여 피를 중지 합니다. Expulse 깨끗 한 주사기 혈액입니다.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼의 1 ml을 추가 하 고 5 분 동안 품 어. 다음 5 분 동안 5 분 PBS와 300 x g에서 centrifugre 세척에 대 한 300 x g에서 원심. 상쾌한, 3 µ L 안티 인간 CD45 FITC와 1 µ L 안티 murine 10% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 얼룩과 추가 100 µ L PBS를 제거 CD45 APC와 4 ° C에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>PBS (2 mL) 10 %BSA 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기에에서 셀 펠 릿 두 번 세척.</li>
	<li>Aliquot 최대 흐름 cytometry 튜브로 PBS의 100 µ L 당 1 x 106 셀.</li>
	<li>CD45 (인간의 대 murine) 식의 설문 조사 engraftment chimerism 분석 하 여 2 주마다 cytometry (그림 2A , B)를 사용합니다.</li>
	<li>희생 (주변 폭발 수가 이상 70% 또는 질병의 심각한 임상 증상)에서 수집 되 폭발 세포 골 및 분쇄 spleens에서 tibias 홍 여 하 고 PBS와 화관 앞13에서 설명한. 자 궁 경부 전위 국제 지침에 의해 마우스를 안락사.</li>
	<li>셀 펠 릿 RBC 있으면 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 (단계 2.1)의 세포를 수행 합니다.</li>
	<li>워시 셀 펠 릿 두 번 PBS (2 mL) 10 %BSA 300 x g에서 원심 분리기에서에서 5 분.</li>
	<li>교류 cytometry 튜브로 PBS의 100 µ L 당 1 x 106 셀에 셀과 aliquot 업을 수집 합니다.</li>
</ol>4. 얼룩
<ol><li>활용 된 항 체 (단계 4.2 참조)와 소용돌이 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 15 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>인간의 기본 또는 PDX 샘플 안티-CD36-FITC의 10 µ L, 안티-CD19-ECD의 5 µ L, 안티-CD33-PC5.5의 5 µ L, 안티-CD90-APC의 5 µ L, 안티-CD34-AA700, 안티 CD45RA APC H7의 5 µ L, 안티-CD38-태평양 파랑의 5 µ L의 5 µ L의 5 µ L의 구성에 대 한 다음 패널을 사용 하 여 안티-CD45-코의 µ 한 안티-CD123-PC7 및 2.5 L</li>
	<li>5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 2 ml PBS의 셀을 세척 하 여 언바운드 항 체를 제거 합니다.</li>
	<li>다시 최종 흐름 cytometric 분석에 대 한 PBS의 450 µ L에서 세포를 일시 중단 합니다.</li>
</ol>5. 게이팅 흐름 cytometry 분석을 위한 전략
<ol><li>빨강, 파랑, 보라색 레이저를 갖춘 교류 cytometer에서 데이터 수집 (적어도 500000 셀)을 수행 합니다. 1) 광학 정렬, 2) 유체 시스템, 3) 광학 감도 및 4) fluorospheres를 사용 하 여 표준화에 대 한 매일 cytometer 설정 확인</li>
	<li>CD38 식 (그림 1)을 정의 하려면 순차 제어 전략을 따릅니다.<ol>
<li>정상적인 골 수 샘플에서 세포를 사용 하 여 정의 하는 hematogones 또는 플라즈마 세포 CD38 식에 대 한 긍정적인 통제 될 것입니다. 참고:이 게이트는 특히 후속 putative LSC 인구 그것의 정의에 따라 평가 해야 합니다.</li>
		<li>CD45dim/SSC (사이드 분산형) 낮은 인구 기준 (그림 1A)에 의해 생리 선구자 세포 (정상 돌풍 세포)를 정의 합니다. 이 폭발 인구 내의 정의 CD38 표시 하는 hematogones + + CD19 + 형 (그림 1B)와 마지막으로, CD36 및 CD33 식을 사용 하 여 정의 하는 myeloblasts, monoblasts, 및 erythroblasts (그림 1C). (그림 1E)와 같이 hematogones CD34 식을 결정 합니다. P6-P10 (그림 1D)로 정의 된 폭발 세포 내에서 일어나는 여러 가지 부분 모집단을 평가 합니다. P6, P7, P8 조상 모집단 미리 CD38 게이트를 기반으로 폭발 셀 CD34 구획을 구분 합니다. P8 구획 P6 CD38 기반 (FMO) 컨트롤 마이너스 CD38 형광에 있는 셀을 포함 하는 hematogones로 동일한 CD38 강도 있는 폭발을 포함 하 고 P7 셀 CD38 관련 2 개의 극치 사이 식 (그림 1D)입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CD34 + 38-(P6)에서 문이 셀, CD90 CD45RA 표현 (그림 1 층)을 사용 하 여 상 상속 LSC에서 HSC를 구분 합니다. 참고: HSC 형은 CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-multipotent 창시자 (MPP)는 CD34 + CD38로 정의-CD90-CD45RA-. 상 상속 LSC 형은 CD34 + CD38-CD90dimCD45RA +와 더 미 숙 다운스트림 인구는 CD34 + CD38로 정의 된 림프 액 창시자 (LMPP)-CD90-CD45RA +.</li>
</ol>6입니다. MRD RT-PCR에 의해 모니터링
<ol><li>앞에서 설명한14RT-PCR에 의해 모니터 MRD 수준.</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

막 또는 세포질 마커 cytometry에 의해 정확 하 고 재현성 평가 악기 설정을 매일 광학 정렬, 적절 한 유체 시스템, 광학 감도 및 표준화의 기능에 대 한 확인 필요 교정 구슬을 사용 하 여.
AML CD90 및 CD45RA를 사용 하 여 다중 변수 흐름 cytometry 분석에서 폭발 세포 인구의 탐지는 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 분석에서 중요 한 단계는 CD34 + CD38-인구의 정확한 게이팅을 수행 하려면 CD38 식 폭발 세포에의 한 정확한 평가입니다. CD38 강도 특히 hematogones 플라즈마 세포 (CD38 +)에 정상 골 수 세포를 사용 하 여 정의 됩니다. 다른 마커의 강도 isotype 컨트롤을 사용 하 여 결정 됩니다.
CD45RA 및 CD90의 추가 putative LSC에서 HSC를 구별 하는 데 사용 됩니다. 후자와 하지 HSC 아마 질병 재발의 원인, 따라서이 프로...

급성 골수성 백혈병 (AML) 백혈병 관련 된 사망의 가장 흔한 원인입니다. 처음, AML는 조 혈 줄기 세포 (HSC)의 클론 질병 차별화, 폭발 셀의 후속 축적의 체포를 특징으로하 고 기능성 조 혈 요소의 생산을 감소. 최근, 폭발 세포 인구의 클론이 차세대 시퀀싱 (NGS) 전략을 사용 하 여 종양 세포1의 내부 클론 진화의 존재를 보여주는 본질적으로 설립 되었습니다.
이 leukemic 줄기 세포 (LSC)의 존재를 확장합니다. 그것은이 동적 셀 구획 백혈병 진행 및 치료 하는 동안에 부과 하는 다양 한 선택 압력을 극복 하기 위해 진화 가설입니다. 따라서 LSC 현재 화학요법 식이요법을 저항 하 고 깊은 임상 의미2질병 재발을 중재 하는데 있다. 다양 한 마커 CD1233, CLL-14, CD975 또는6팀-3 같은 LSC 하 설명 했습니다. CD34 + CD38-폭발 세포의 구획 LSC7 농축 간주 됩니다 하지만 또한 정상적인 HSC를 포함 합니다. CD90 CD45RA 표현 CD34 + CD38에 적용-정상 및 악성 조 혈 전8의 몇몇 단계를 분리 하는 허가 (P6) 구획 (그림 1). 특히, 정상적인 CD34 + CD38, CD90 + CD45RA HSCs, multipotent 창시자 (MPP) 같은 CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-세포와 CD34 + CD38-CD90-CD45RA + 림프 액 multipotent 조상 (LMPP) 셀 AML의 대부분에 결정 될 수 있는 경우8 ,9. CD38의 평균 형광 강도 (MFI) CD34 + 세포 구획 내에서 고려 되어야 하는 특히 중요 하다. CD38 강도 3 개의 새로운 세포 구획 그를 정의 하기 때문에: CD38 네거티브 (P6), CD38 dim (P7)와 CD38 밝은 (P8) (그림 1). CD38 MFI를 사용 하 여 hematogones 또는 플라즈마 세포 내부 긍정적인 컨트롤로 이러한 세포는 강하게 CD38 표현으로 결정 될 수 있습니다.
Immunodeficient 끄 덕/SCID/IL2Rγcnull (NSG) 마우스 모델은 정상의 engraftment를 위해 널리 이용 된다 그리고 악성 인간 조 혈 모 세포10,11. 직렬 xenotransplantation 분석 LSC 또는 HSC 함수를 실험적으로 확인 하는 데 사용 됩니다. 이 연구는 광범위 하 게 대규모 시퀀싱 접근에 의해 분석 되었습니다 했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 덜 AML 폭발 인구는 주요 AML (그림 2)에 비해 NSG 쥐에 engrafted LSC 및 HSC immunophenotype에 대 한 알려져 있다.
LSC의 숫자는 이렇게 본질적으로 낮은, 식별 및 LSC의 정량화는 도전 하며 여기에 설명 된 방법을 사용할 수 있습니다 흐름 cytometric 분석 결과 진단 및 임상 수행으로 (로 잔여 LSC 수 있습니다 화학 요법 응답을 평가 하 급성 골수성 백혈병 재발 발생할). LSC의 존재는 긍정적인 최소 잔여 질병 (MRD)를 나타낼 수 있습니다. 날짜 하려면, MRD 분자 방법 (즉, RT-PCR, NGS)에 의존 대부분 AML에 모니터링10,12. 그러나,이 프로토콜에 우리 검색 여러 HSC/LSC 마커 (CD34, CD38, CD45RA, CD90)의 동시 단백질 표정 인간의 AML의 기본 폭발 셀에 multiparametric 흐름 cytometry2,,89. 항 체의이 조합은 어떤 표준 흐름 cytometry 실험실에 적용 될 수 있습니다 그리고이 흐름 MRD 분석 결과 특히 재미 있는 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 MRD 불가능 때 즉, 경우 백혈병 특정 분자 마커 진단 AML 샘플에서 감지 되지 않습니다. 또한,이 프로토콜은 더 민감한 분자 MRD 기술 보완으로 감지 하 고 비정상적인 조 혈 조상 세포를 계량 하는 것을 목표로 나타내는 기능 셀 특성 (그림 3).
우리 3 조 혈 모 조상 인구와 성숙의 다른 학위를 가진 상 상속 LSC 구획 cytometry 임상 실험실의 대부분에서 사용할 수 있는 항 체와 함께 하 여 계량 하는 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리는 해당 환자-파생-xenografts (PDX) 이러한 셀 구획의 존재를 확인 하 고 치료에 후속.

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액(10x)</td><td>오자임</td><td>BLE420301</td><td>RBC 용해 용액 A: 멸균 H<2< 및 RBC 용해 용액 B 100mL에 NHsub>4Cl 8.29g + Na2>EDTA 0.037g: 멸균 H<>>sub2O NOD/SCID/IL2R&gamma 100mL에 KHCO<sub3 1g</td></tr><tr><td>; cnull&nbsp; (NSG)&nbsp; 생쥐</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>재고 번호: 005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer &ndash; MACS 분리 완충액</td><td>MACS 완충액 Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (클론 FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (클론 D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (클론 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (클론 J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (클론 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (클론 HI100)&nbsp;</td><td>벡크 톤 디킨슨</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>안티 CD38-퍼시픽 블루 (클론 LSI98-4-3, Iotest)</td><td>벡크 만 쿨터</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>안티 CD45-KO (클론 J.33, Iotest)</td><td>벡크 만 쿨터</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>안티 CD3-PE</td><td>벡크 만 쿨터</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>안티 CD20-PE</td><td>벡크 만 쿨터</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>안티 CD123-PC7</td><td>벡크 만 Coulter</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>플로우 세트</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>플로우 체크</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 인간 PE 선택 키트</td><td>줄기세포 기술</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp; 자석&nbsp;</td><td>줄기 세포 기술</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

급성 골수성 백혈병 (AML)은 다른 유형의 그리고 치료 하지 않으면, 치명적인 질병. 그것은 성인 백혈병 관련 된 사망의 가장 흔한 원인입니다. 처음, AML는 조 혈 줄기 세포 (HSC)의 질병 차별화, 폭발 세포 백혈병의 후속 축적의 체포를 특징으로하 고 기능성 조 혈 요소의 생산을 감소. 이 백혈병 줄기 세포 (LSC)의 존재를 확장,이 동적 셀 다양 한 선택 압력을 극복 하기 위해 진화 하는 구획 부과 시 백혈병 진행 및 치료 하는 동안. LSC 인구를 추가로 정의 하려면 CD90 추가 CD45RA CD34 + CD38-셀 구획 내에서 정상적인 HSCs multipotent 창시자의 차별 수 있습니다. 여기, 우리 multiparametric cytometry에 의해 인간의 AML의 기본 폭발 셀에 여러 개의 상 상속 LSC 마커 (CD34, CD38, CD45RA, CD90)의 동시 표현 검색 프로토콜 개요. 또한, 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다. 검색의이 방법 및 상 상속 LSC의 정량화 임상 후속의 화학 요법 응답 사용할 수 있습니다 (즉., 최소 잔여 질병), 잔여 LSC AML 재발을 일으킬 수 있습니다.

여기 우리 조상 인구 정상 및 악성 인간의 골 수 샘플을 결정 하는 방법을 제시. 우리는 성공적인 PDX에서 골 수 및 비장 수집 하 고 위에서 설명한 대로 multiparametric cytometry 수행. 우리는 폭발 세포 진단 환자 샘플 및 해당 PDX 및 특히, CD34 + CD38-조상 구획 사이 특히 putative LSC에 농축의 여러 모집단 비교. 우리는 발견 CD34 + CD38-폭발 분수에서 PDX 진단 환자 샘플 0.53%, 그림 2C, D(3.48%)에 비해 높았다. 흥미롭게도, 우리는 putative LSC의 더 높은 백분율을 발견 (CD34 + CD38 표시-CD90-CD45RA + 형) 기본 환자 샘플 (0.48%, 그림 2E, F대 2.76%)에 비해 PDX에서 악성의 가능한 농축 제안 이 마우스 모델에서 혈액 조직에 조상 세포. 일...

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

이 절차의 전반적인 목표는 급성 골수성 백혈병과 환자 유래 이종 이식편에서 진단 및 치료 후속 조치 시 유세포 분석을 통해 백혈병 줄기세포를 추정하는 것입니다. 이 방법은 급성 골수성 백혈병에서 유세포 분석을 통한 백혈병 줄기 세포의 정량적 평가의 임상적 관련성과 같은 혈액학/종양학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적으로 사용되는 항체가 있는 대부분의 혈액학/종양학 실험실에 적용할 수 있다는 것입니다.이 절차는 박사 후 연구원인 Thomas, 대학원생인 Fanny, 그리고 제 연구실의 엔지니어인 Adeline이 시연할 것입니다. 먼저 de novo AML에서 항응고제 EDTA 1.8mg당 1.8mg이 들어 있는 튜브에 담긴 골수 2ml를 수집합니다. 먼저 골수를 3가지 부피의 PBS로 희석하여 적혈구 및 과립구로부터 단핵 세포를 분리합니다.그런 다음 한 권의 피콜과 한 권의 희석된 골수를 조심스럽게 겹쳐줍니다. 밀도 구배를 300g에서 30분 동안 쉬지 않고 돌립니다. 그런 다음 단핵 세포의 흰색 담황색 코팅층을 새로운 멸균 튜브로 옮깁니다.혈청 성분을 오염시키는 상등액을 제거하려면 PBS 10ml를 넣고 300g에서 5분 동안 세포를 원심분리한 후 세척을 반복합니다. 세포 펠릿에 2ml의 용해 완충액을 첨가하여 적혈구를 용해시키고 부드럽게 와류를 일으킵니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다.300g에서 세포를 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 씻습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 골수에서 아세포 세포를 분리한 후, 층류 후드 아래에서 조건 없는 NSG 마우스를 억제 장치에 삽입하고 꼬리 정맥에 6번째 AML 아세포 세포를 10의 5배 5배 주입합니다.마우스를 기존의 특정 병원체가 없는 조건에서 환기가 잘 되는 개별 케이지로 되돌립니다. 2주에 한 번씩 헤마토크릿 모세혈관을 이용한 턱밑 채취 방법을 사용하여 60마이크로리터의 혈액을 채취합니다. 모세혈관을 5ml 튜브에 넣은 다음 멸균 거즈 패드로 부드러운 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.튜브에 1ml의 용해 완충액을 추가하고 부드럽게 와류를 일으킵니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 300g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.그런 다음 상등액을 제거한 후 10% BSA가 함유된 PBS 100마이크로리터, 항인간 CD45 FITC를 3마이크로리터로 첨가하고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 PBS, 2밀리리터, 10% BSA로 두 번 세척하고 300g에서 5분 동안 원심분리기를 세척합니다. 2주에 한 번씩 유세포 분석을 사용하여 인간 대 쥐 CD45 발현의 키메라 분석에 의한 생착을 분석합니다.blast count가 70% 이상이거나 심각한 질병의 임상 징후가 관찰되는 경우, 동물을 희생하고 앞서 설명한 대로 PBS를 사용하여 경골과 대퇴골을 세척하여 으깬 비장과 골수에서 단핵 blast 세포를 수집합니다. 패널 염색을 수행하려면 접합 항체를 인간 1차 또는 환자 유래 이종 이식편 또는 PDX 샘플과 결합하고 튜브를 와류로 회전시킵니다. 그런 다음 실온에서 15-30분 동안 어두운 곳에서 세포를 배양합니다.2ml의 PBS를 사용하여 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 450마이크로리터의 PBS에 세포를 다시 현탁시킨 다음 유세포 분석 및 MRD 모니터링을 진행합니다. 유세포 분석을 통해 세포질 마커의 멤브레인을 정확하고 재현성 있게 평가하려면 광학 정렬을 검증하십시오.3D 시스템의 적절한 조정과 스토마진 보정을 사용한 광학 감도 및 스토마타이징은 매일 최고조로 작용하고 있습니다. 일반 골수를 사용하여 CD38의 게이트를 설정합니다. 최소 500, 000개의 이벤트가 필요하며 각 흐름 실행이 규칙적이고 동질적인 것으로 확인됩니다.또한 이중선, 죽은 세포 및 세포 파편이 제거됩니다. 미성숙 조혈 세포는 CD45 중간, SSC 낮음으로 정의됩니다. 그리고 CD38 양성 대조군 또는 헤마토고네는 CD19/CD38 이중 양성입니다.그런 다음 P8 또는 CD38 양성, P7 또는 CD38 중간체 및 P6 또는 CD38 음성이 정의됩니다. P6 셀은 HSC, MPP 및 LSC로 더 세분화 될 수 있습니다. 정상적인 골수이므로 LSC 음성입니다.다성분 유세포 분석을 사용하여 CD34 양성, CD38 음성 blast fraction이 진단 환자 샘플에 비해 PDX에서 더 높은 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 1차 환자 샘플에 비해 PDX에서 추정되는 LSC의 비율이 더 높게 발견되었으며, 이는 이 마우스 모델의 혈액 조직에서 악성 전구 세포가 풍부할 수 있음을 시사합니다. 두 개의 서로 다른 환자 샘플에서 blast progenitor 집단을 비교한 결과, CD34 양성, CD38 음성 비율은 진단 시 0.06%에서 첫 번째 환자의 첫 번째 치료 추적 관찰에서 3.33%로 증가했습니다.대조적으로, CD34 양성, CD38 음성 분획은 두 번째 환자에서 진단 시 7.8%에서 첫 번째 치료 추적 관찰에서 2.27%로 감소했습니다. 이에 따라, 추정 LSC 분율은 첫 번째 환자에서 진단 시 0%에서 0.65%로 증가했고, 두 번째 환자에서는 진단 시 6.57%에서 치료 추적 시 1.44%로 감소했다. 환자 1의 NPM1 돌연변이와 환자 2의 CBF-beta MYH11 유전자 융합을 분자 마커로 사용하여 최소 잔류 질환 또는 MRD 모니터링을 실시한 결과, 첫 번째 치료 추적 관찰에서 첫 번째 환자의 분자 MRD가 두 번째 환자에 비해 덜 감소한 것으로 나타났습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 유세포 분석 설정 및 CD38 측정을 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 기능성 백혈병 줄기 세포 평가와 같은 추가 질문에 답하기 위해 유세포 분석 세포 분류와 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 환자 유래 이종 이식편의 환자 샘플에서 백혈병 줄기 세포를 검출하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 환자 샘플로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 GOP 지침 및 기관 안전 절차와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

flow-cytometry-to-estimate-leukemia-stem-cells-primary-acute-myeloid

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

MDS 진단 기준 형태학 또는 비 유익한 세포 유전학의 부재에 어렵습니다. MFC는 MDS 진단 과정을 구체화 도움이 될. 임상 연습에 유용 될, MFC 분석 기반으로 해야 합니다 매개 변수 충분 한 특이성 및 감도, 그리고 데이터 다른 연산자 사이 재현 되어야 합니다.

데이터베이스 가이드-cytometry 골 골수성 세포 성숙의 평가 위한

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

우리는 인간 1 차급성 골수성 백혈병 (AML) 견본에 있는 NKG2D 리간드 (NKG2DL) 검출을 위한 2개의 다른 염색 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째 접근법은 융합 단백질을 기반으로 하며, 알려진 모든 잠재적으로 알려지지 않은 리간드를 인식할 수 있으며, 두 번째 프로토콜은 다중 항 NKG2DL 항체의 첨가에 의존한다.

급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

우리는 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T-급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별했습니다. 염색은 분열하지 않는 세포에 유지되고 세포 증식 중에 감소하여 추가 조사를 위해 휴면 세포를 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 정지의 맥락에서 자가 재생을 연구하기 위한 기능적 도구를 제공합니다.

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 

여기에서는 인류 세포 분석 기반 방법을 사용하여 마우스에 이종 이식하고 골수 흡인에서 얻은 급성 인간 골수성 백혈병 세포에서 mTORC1, JAK/STAT5 및 MAPK 경로의 다운스트림 신호를 분석합니다. p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 및 p-ERK1/2 수준은 고감도의 차세대 스펙트럼 유세포 분석기를 사용하여 동시에 측정됩니다.

급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석

이 프로토콜은 주사 후 4일 후에 발생하는 환자 유래 B- 및 T- 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 난자 이종이식을 설명합니다.

오보에 위치 환자 유래 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 이종이식 (PDX-ALL)

이 프로토콜은 유도 화학 요법에 대한 반응의 역학을 기반으로 급성 림프구성 백혈병의 재발을 생성하기 위한 마우스 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다.

급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

배우세요 급성 골수성 백혈병 및 환자 유래 이종이식 모델에서 유동세포측정법을 이용한 백혈병 줄기 세포 정량화 방법입니다. 이 기술은 대부분의 혈액학/종양학 연구실에서 표준 항체로 적용 가능합니다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

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