Name: 위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 배우세요 도메인옴 라이브러리 구축 및 차세대 시퀀싱을 활용한 단백질 선별 방법을. 이 기술은 고처리량 단백질 상호작용 연구와 기능 분석에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 이탈리아 교육부 및 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CP에 2010P3S8BR_002).

<ol><li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li>
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<li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110(2010).</li>
<li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+soluble%2Ffoldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering%3A+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li>
<li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+%26%2334%3Bgenic%26%2334%3B+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Filtering &#34;genic&#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).</li>
<li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li>
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<li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+open+reading+frames+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li>
<li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+of+cDNA+libraries%3A+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li>
<li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+%CE%B1-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+%28RIDome%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li>
<li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li>
<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li>
<li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li>
<li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li>
<li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+phage+display%3A+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li>
<li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Gen+Subj%22%5BJournal%5D)">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li>
<li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+%CE%B1-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+%28RIDome%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mrd.1080010210/abstract">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146(2003).</li>
<li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2803857/">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinforma%22%5BJournal%5D)">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li>
<li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JBrowse%3A+A+next-generation+genome+browser%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li>
<li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+soluble%2Ffoldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering%3A+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li>
<li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+%26%2334%3Bgenic%26%2334%3B+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Filtering &#34;genic&#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).</li>
<li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li>
<li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

높은 품질 높은 다양 한 ORFs 필터링 된 도서관의 창조 때문에 파이프라인의 모든 이후 단계에 영향을 미칠 것입니다 전체 절차의 첫 번째 중요 한 단계입니다.
우리의 방법의 중요 한 유리한 기능 (intronless) DNA (cDNA, genomic DNA, PCR 파생 이나 합성 DNA)의 모든 소스 라이브러리 건설에 적합 이다. 고려 되어야 하는 첫 번째 매개 변수는 pFILTER 벡터에 복제 하는 DNA 파편의 길이 게놈 또는 transcriptome, 소위 "domainome"의 도메인의 전체 컬렉션의 표현을 제공 해야 합니다. 우리는 단백질 도메인 성공적으로 복제 될 수 있습니다, 선택 하 고 마지막으로 확인 한 길이 분포에 걸친 150에서 750 bp33,34, DNA 조각에서 시작 이며이 무슨 라인에 보고는 증명 대부분 단백질 도메인 100 aa 길이 보여주는...

여기, 우리는 높은 처리량 방법 건설과 genic/게놈 시작 소스에서 접힌 및 수용 성 단백질 도메인의 라이브러리의 선택에 대 한 설명. 접근은 세 가지 다른 기술: 파지 디스플레이, 데이터 분석을 위한 접는 기자와 특정 웹 도구 다음 세대 시퀀싱 (NGS)의 사용. 식별 및 새로운 단백질/단백질 도메인의 주석, 알려진된 단백질의 구조 및 기능적 속성의 정의의 특성에 대 한 단백질 기반 연구의 많은 다른 컨텍스트에서 메서드를 사용할 수 있습니다. 단백질 상호 작용 네트워크입니다.
많은 관련 질문은 단백질 기반 연구에 여전히 존재 하 고 최적의 단백질 생산을 위한 방법의 개발은 조사의 여러 분야에 대 한 중요 한 필요. 예를 들어 간결한 하 고 진 핵 게놈1의 수천의 가용성에도 불구 하 고 코딩 된 단백질 및 펩 티 드의 직접 주석으로 상대 proteomes의 해당 지도 아직도 대부분의 유기 체에 대 한 누락 된. 완전 한 proteomes의 카탈로그는 도전 목표 시간 및 자원의 점에서 거 대 한 노력을 요구로 떠오르고 있다. 실험적인 주석에 대 한 황금 표준 남아 모든 오픈 독서 프레임 (ORFs)는 게놈의 소위 "ORFeome" 건물의 복제. 일반적으로 유전자 기능에 알려진된 활동의 관련된 유전자 상 동에 따라 할당 됩니다 하지만이 방식은 많은 잘못 된 주석 참조 데이터베이스2,3,4,의 존재로 인해 제대로 정확한 5. 또한, 심지어 식별 및 주석 된 단백질에 대 한 추가 연구는 풍요, 구조적 및 기능적 속성을 포함 하 여 다른 컨텍스트에서 식 패턴의 관점에서 특성을 달성 하는 데 필요한 뿐만 아니라 상호 작용 네트워크입니다.
또한, 이후 단백질 그들 각각의 다른 도메인으로 구성 된 특정 기능을 표시 하 고 다르게 단백질 기능에 기여 하 고, 연구 하 고 이러한 도메인의 정확한 정의 수 있습니다 더 포괄적인 그림을 모두 단일 유전자 전체 게놈 수준에서. 이 모든 필요한 정보를 만든다 단백질 기반 연구 다양 하 고 도전적인 분야를
이 관점에서 중요 한 기여 단백질 생산을 위한 공평 하 고 높은 처리량 방법으로 주어질 수 있었다. 그러나, 상당한 투자가 필요 하 고, 옆에 같은 방식의 성공 성/안정적인 단백질 구조를 생산 하는 능력에 의존 합니다. 이것은 주요 제한 요소 때문에 단백질의 약 30% 수 수 성공적으로 표현을 실험적으로 유용한6,,78될 충분 한 수준에서 생산 추정 되었다. 이 한계를 극복 하는 방법은 함께 개별 유전자의 겹치는 조각 표현을 제공 하는 다른 polypeptides를 생산 하기 위해 무작위로 파편이 된 DNA의 사용을 기반으로 합니다. 임의로 생성 된 DNA 파편의 단지 작은 백분율은 기능적 ORFs 동안 그들의 대다수 (그들의 순서 안에 정지 codons의 존재) 때문에 작동 하지 않습니다 또는 해제 자연 (원래 다른 프레임에 ORF)에 대 한 인코딩 생물학 의미 없이 polypeptides입니다.
이러한 모든 문제를 해결 하려면 우리의 그룹 게놈 규모9,10,,1112에서 사용할 수는 높은 처리량 단백질 표현과 상호 작용 분석 플랫폼을 개발 했습니다. 이 플랫폼 통합 다음 방법: 1); 모든 유기 체에서 DNA의 코딩 부분에서 제대로 접힌된 단백질 도메인의 컬렉션을 선택 하는 방법 상호 작용;의 파트너를 선택 하기 위한 2) 살 균 소 전시 기술 완전히 특성화 연구 전체 위하여 식별 관심;의 클론을 NGS 3) 그리고 4) 간단 하 고 사용자 친화적인 방식으로 위하여 Seq 분석을 수행 하기 위해 어떤 생물 정보학 또는 프로그래밍 기술 없이 사용자에 대 한 데이터 분석을 위한 웹 도구.
이 플랫폼의 사용 조사;의 대안 전략에 비해 중요 한 장점을 제공합니다 위의 모든 방법은 완전히 편견, 높은 처리량 및 전체 게놈까지 단일 유전자에서 배열 하는 연구에 대 한 모듈입니다. 파이프라인의 첫 단계가 특징인 다음 깊이 NGS 연구에서 무작위로 파편이 된 DNA에서 도서관의 창조 이다. 이 라이브러리는 관심의 유전자/파편 periplasmic 공간 (즉, 초 지도자)으로 단백질 분 비에 대 한 신호 순서와 TEM1 β-lactamase 유전자 사이 복제는 설계 된 벡터를 사용 하 여 생성 됩니다. 융해 단백질 암 피 실린 저항 및 복제 조각 프레임 경우에 암 피 실린 압력 하에서 생존 능력 부여 됩니다 이러한 요소와 결과 융해 단백질은 제대로 접힌된10,13 14. 모든 클론 항생제 선택, 소위 "필터링 클론" 구조, ORFs, 그들 (80%)의 대다수는, 실제 유전자9에서 파생 됩니다. 또한,이 전략의 힘 모든 필터링 ORF 클론 제대로 접혀/수용 성 단백질/도메인15인코딩하는 발견에 있다. 많은 클론, 라이브러리 및 매핑 동일한 지역/도메인에 있는 다른 시작 지점 및 끝 지점을, 수용 성 제품에서 발생 가능성이 최소 조각의 편견, 단일 단계 식별 수 있습니다.
기술에 있는 더 개선 라이브러리 특성 NGS의 사용에 의해 제공 됩니다. 이 플랫폼의 조합을 데이터 분석에 대 한 특정 웹 도구 참조 DNA 더 광범위 한 분석 필요성 없이 연구에 중요 한 편견된 정보 선택한 ORFs의 위치와 정확한 뉴클레오티드 시퀀스에 제공 또는 실험적인 노력입니다.
Domainome 라이브러리 선택 컨텍스트로 전송 고 기능 연구를 수행 하는 범용 악기로 사용 될 수 있습니다. 높은 처리량 단백질 표현과 상호 작용 분석 플랫폼 우리가 통합을 우리 위하여 Seq 라는 활용 살 균 소 전시 기술 phagemid 벡터 필터링된 ORF 전송 및 살 균 소 ORF를 만드는 도서관입니다. 일단 단백질 도메인 M13 입자;의 표면에 표시 되는 페이지 디스플레이 컨텍스트를에 다시 복제 이 방법으로 domainome 라이브러리는 유전자 파편 특정 효소 활동 도메인 인코딩 또는 바인딩 속성을 위하여 네트워크 프로 파일링에 대 한 직접 선택할 수 있습니다. 이 방법은 처음 Zacchi 그 외 여러분 에 의해 기술 되었다 16 및 여러 가지 다른 컨텍스트13,,1718에서 나중에 사용.
(를 포함 하 여 효 모 2 잡종 시스템 및 질량 분석19,20) 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 데 사용 하는 다른 기술에 비해, 하나의 주요 장점은 살 균 소 중 발생 하는 바인딩 파트너의 증폭 선택의 여러 라운드를 표시 합니다. 이 라이브러리에 있는 낮은 풍부한 바인딩 단백질 도메인의 식별 되므로 선택 감도 증가 합니다. ORF 필터 라이브러리를 사용 하 여 수행 하는 선택의 효율성은 비 기능 클론의 부재로 인해 더욱 증가 된다. 마지막으로, 기술 선택을 단백질과 비 단백질 미끼21,22,23,,2425에 대해 수행 될 수 있습니다.
Domainome-페이지 라이브러리를 사용 하 여 페이지 선택 미끼로 다른 병 적인 조건 환자, 예를 들어 면역 질환13, 암 또는 감염 질환의 혈 청에서 나오는 항 체를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 방법은 대규모 식별 하 고 특성 항 원/epitopes 구체적으로 동시에 환자의 항 체에 의해 인식 수 있도록 연구에서 질병의 소위 "항 체 서명"를 얻기 위해 사용 됩니다. 사용 하는 다른 방법에 비해 살 균 소의 디스플레이 선형 및 구조적 항 원 epitopes의 식별 수 있습니다. 특정 서명 식별 잠재적으로 이해 병 인, 새로운 백신 디자인, 새로운 치료 목표의 확인과 개발 도구의 새로운 및 특정 진단 및 예 후에 대 한 중요 한 영향을 미칠 수 있는. 또한, 연구는 전염 성 질병에 초점을 맞추고 때 주요 이점은 면역성 단백질의 발견은 병원 체 재배에서 독립 이다.
우리의 접근 방식은 접는 기자를 "domainome"를 선택 하는 게놈에 사용할 수 있는 확인: DNA의 코딩 부분에서 제대로 접혀, 잘 표현, 수용 성 단백질 도메인 어떤 유기 체에서 cDNA의 컬렉션. 일단 고립 된 단백질 조각을 유전자 주석 뿐만 구조 연구, 항 체 epitope 매핑, 항 원 확인, 등등에 대 한 필수적인 실험 정보를 제공 하는 많은 목적을 위해 유용 하다. NGS에서 제공 하는 높은 처리량 데이터의 완전성 살 균 소 전시 도서관, 등 매우 복잡 한 샘플의 분석을 가능 하 게 그리고 전통적인 힘 드는 따기 및 개별 페이지 구조 클론의 테스트 회피 가능성을 보유 하고있다.
기능 필터링 된 라이브러리의와 극단적인 감도 그리고 NGS 분석의 힘을 동시에 만들 필요 없이 초기 화면에서 직접 각 상호 작용의 책임 단백질 도메인 식별 가능 하다 각 추가 라이브러리 바인딩 단백질. NGS genic/게놈 시작 소스 전체 domainome의 포괄적인 정의를 허용 하 고 데이터 분석 웹 도구는 매우 구체적인 특성 모두는 질적, 양적 관점에서의 획득은 위하여 단백질의 도메인입니다.

<table><tbody><tr><td>Sonopuls 초음파 균질화기</td>, <td>Bandelin</td><td>HD2070</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>의 GeneRuler, 100 bp Plus, DNA Ladder</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>SM0321</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>GeneRuler, 1kb DNA Ladder</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td>의 <td>SM0311</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>분자 생물학, Agarose</td>, <td>BioRad</td><td>161-3102</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>Green Gel Plus</td><td>Fisher Molecular Biology</td><td>FS-GEL01</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>6x DNA 로딩 염료</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>28704</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>의 Quick Blunting Kit</td>, <td>New England Biolabs,</td><td>E1201S,</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000, UV-Vis 분광광도계</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic Beads,</td><td>New England Biolabs,</td><td>S1420S</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>28104</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>EcoRV</td>, <td>New England Biolabs,</td><td>R0195L</td><td></td></tr>, <tr><td>Antarctic Phosphatase</td>, <td>New England Biolabs</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 3M pH5.2</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 용 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>DH5aF '박테리아 세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml 튜브</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml 튜브</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,1 cm electroporation cuvette</td><td>Biosigma</td><td>4905020</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x YT 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1003</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA 중합효소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0702</td><td></td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>96웰 열 순환기(가열식 뚜껑 포함)</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>150mm 플레이트</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm 플레이트</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>BssHII</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0199L</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0131L</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 미니프렙 키트</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>M13KO7 헬퍼 파지</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td>27-1524-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이세스 카나마이세쿠스의 카나마이신 설페이트</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>K1377</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리에틸렌 글리콜(PEG)</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>P5413</td><td></td></tr>, <tr><td>클로라이드나트륨(NaCl)시</td><td>그마-알드리치</td>, <td>S3014</td><td></td></tr>, <tr><td>PBS, 일반</td><td>실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>면역침전을 위한 다이나비드스 단백질 G</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>MagnaRack 자기 분리 랙</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15000</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Nonfat Dried milk powder</td><td>EuroClone</td><td>EMR180500</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td><td>7958935001</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 비드</td><td>Agencourt, Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT 듀얼 인덱스 프라이머</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001 또는 FC-131-2002 또는 FC-131-2003 또는 FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 또는 Hiseq2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광광체</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 바이오 분석기 또는 TapeStation</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forward PCR 프라이머</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td>5 ' TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3'</td></tr><tr><td>역 PCR 프라이머</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td>5 ' TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3'</td></tr><tr>NGS <td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td>용 포워드 프라이머</td><td>5' TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCATGC 3';</td></tr><tr>NGS <td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td>용 리버스 프라이머</td><td>5' GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3';</td></tr></tbody></table>

위하여-seq: domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

접이식 기자는 쉽게 식별할 수 있는 고기, 항생제 내성, 단백질 또는 임의의 열려있는 독서 프레임을 접는 제대로 융합 될 때 그 접는 및 기능 손상 등으로 단백질. 우리는 어디, 사용 하 여 가장-1 β-lactamase (암 피 실린 저항을 부여 하는 효소) 게놈 규모, 우리 수 선택 잘못 접힌된 단백질 도메인의 컬렉션 어떤 intronless 유전자의 DNA의 코딩 부분에서 전략을 개발 했습니다. 이 접근 방식, 소위 "domainome"에 의해 얻은 단백질 조각 잘 표현 하 고 수용 성, 구조/기능 연구에 대 한 적합 한 그들을 만드는 것입니다.
복제 페이지 디스플레이 시스템에 직접 "domainome"를 표시 함으로써, 우리 그것은 원하는 바인딩 속성 (예를 들어, 다른 단백질 또는 항 체), 특정 단백질 도메인 선택할 수 필수 제공 보였다가 유전자 주석 또는 항 원 확인. 에 대 한 실험 정보
새로운 차세대 시퀀싱 기술 (NGS)를 사용 하 여 선택한 polyclonal 인구에 가장 풍부한 클론의 id는 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로 라이브러리 자체의 다양성, 풍부 및 정확한 매핑을 선택한 조각의 각에 완전 한 정보를 제공 하도록 선택 출력 깊은 시퀀싱 분석을 소개 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜 라이브러리 건설, 특성화 및 유효성 검사에 대 한 주요 단계를 보여줍니다.

필터링 접근은 그림 1에서 도식화. Intronless DNA의 각 종류를 사용할 수 있습니다. 그림 1A 에서 필터링 접근의 첫 번째 부분 표시 됩니다: agarose 젤에 있는 bioanalyzer 후, 관심의 DNA의 좋은 조각 조각 150-750 bp의 원하는 크기에 길이 분포의 얼룩으로 나타납니다. 얻은 조각난된 DNA의 대표적인 가상 젤 이미지는 주어진 다. 조각 agarose 젤에 로드, 다음 복구는 최종 복구 및 phosphorylated, 고 임의의 DNA 파편의 도서관을 만드는 이전 무딘된 pFILTER 벡터에 복제. 최적의 조건에서 복제 절차의 각 단계를 수행 하는 것이 좋은 품질 도서관 연구에서 DNA의 총 범위를 필요 합니다.
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설명 하는 프로토콜 건설, 특성화 및 DNA 소스에서 만든 "domainome" 라이브러리 (선택의 대상)에 대 한 선택 수 있습니다. 이것은 다른 기술을 결합 하 여 연구 파이프라인에 의해 달성: 파지 디스플레이, 접이식 기자와 다음 세대 시퀀싱 데이터 분석을 위한 웹 도구.

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

이 방법은 새로운 단백질 또는 단백질 도메인의 음장, 알려진 단백질의 구조적 및 기능적 특성의 특성화, 단백질 상호 작용 네트워크 또는 다른 조건에서 항원 항체 시그니처의 정의와 같은 단백질 기반 연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 유전자에서 전체 게놈에 이르기까지 모든 종류의 연구에 대해 완전히 편견이 없고 높은 처리량및 모듈식이라는 것입니다. 도메인 라이브러리의 구성은 기능 연구에 매우 유용합니다.그것은 파지 디스플레이 문맥으로 옮겨지고 결합 단백질 또는 정제 항체와 같은 다른 표적에 대하여 선택을 위해 사용될 수 있다. NGS와의 커플링은 매우 민감하고 강력한 분석을 가능하게 합니다. 동시에, 특별히 개발 된 웹 도구는 전체 도메인 및 상호 작용의 정확한 특성을 제공합니다.먼저 ORF 라이브러리를 구성하려면 100%의 출력으로 30초 펄스로 DNA를 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 사다리와 초음파 처리 된 DNA를 1.5 % 아가로즈 젤에 적재하십시오. 그런 다음 전기 전도 장치를 센티미터 당 5 볼트로 15 분 동안 시작합니다.아가로즈 겔 전기포고증은 초음파 처리를 확인하는 DNA 얼룩의 존재를 나타낸다. 이는 초음파 처리를 거치지 않는 DNA로부터 얻은 고체 밴드와 비교된다. 그런 다음 단편화된 DNA 얼룩으로 젤 부분을 자르고 컬럼 기반 젤 추출 키트를 사용하여 정화합니다.UV 분광계에서 정제된 DNA의 농도를 측정합니다. 그런 다음 제조업체의 지시에 따라 빠른 무딘 효소 믹스의 마이크로 리터 1개로 5마이크로그램의 인서트를 치료합니다. 그런 다음 효소 믹스를 섭씨 70도에서 10분 동안 비활성화합니다.여과 벡터를 준비하려면 먼저 EcoRV 제한 효소로 정제된 복제 벡터의 5마이크로그램을 소화한다. 그런 다음 소화되고 소화되지 않은 벡터와 분자 마커를 1% 아가로즈 젤에 적재합니다. 그런 다음 가열은 제한 효소를 섭씨 80도에서 20분 동안 비활성화합니다.다음으로, 소화된 벡터를 5단위의 인산효소와 10X 인산염 버퍼의 1/10부피를 증식한다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 인산염 효소를 섭씨 65도에서 5분간 비활성화합니다.다음으로, 젤에서 플라스미드를 추출하고 DNA를 정화합니다. 그런 다음 UV 분광계에서 DNA의 농도를 측정합니다. 결찰 반응을 수행하기 위해 소화된 벡터 1마이크로그램에 인산체 400

interactome-seq-protocol-for-domainome-library-construction

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 T7 파지 표시 펩타이드 라이브러리의 QCM 바이오센서 기반 바이오패닝을 사용하여 단백질-약물 상호작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. QCM 바이오센서에 특정 펩타이드를 표시하는 파지의 바이오패닝을 통해 친화성이 높은 펩타이드를 특이적으로 분리한 다음 아미노산 염기서열분석을 수행하여 표적 단백질의 특정 상호 작용 부위를 식별할 수 있습니다.

Quartz-Crystal Microbalance 바이오센서 기반 바이오패닝으로 단백질-약물 상호작용 연구

파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

방법은 항원 동시에 수백 대해 파지 디스플레이 조합 항체 라이브러리의 합성 확장, 고 스루풋 선택을 수행하기위한 시각적 반주하여 설명한다. 이 병렬 접근 방식을 사용하여, 우리는 표준 면역의 기능적인 다양한 항원에 대한 높은 친화력과 특이성을 나타내는 항체 단편을 격리했다.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

여기에서는 추정되는 파지 유전자의 기능적 특성화를 위한 표현형 접근법을 제시합니다. 기술에는 숙주 동화 대사를 모니터링할 수 있는 개발된 분석법, 다중 표현형 분석 플레이트(MAP), 이화 대사에 대한 효과를 측정할 수 있는 확립된 대사체학 방법 등이 포함됩니다.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

효 모 인구 잠재적으로 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용에 대 한 선택의 깊은 시퀀싱 풍부한 파트너 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 생성 합니다. 여기, 우리가 특정 생물 정보학 도구와 같은 화면에서 시퀀스 데이터 분석 사용자 지정 된 업데이트 소프트웨어의 동작을 설명 합니다.

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

임의의 주어진 소분자 리간드에 대해 원하는 친화성 및 특이성을 가진 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템을 만드는 것은 많은 생물학적 감지 및 작동 응용을 가질 것이다. 여기서, 우리는 파지 디스플레이 조합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계적 선택을 통해 화학적으로 유도된 이량화 시스템의 de novo 엔지니어링을 위한 효율적이고 일반화 가능한 방법을 설명한다.

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

유비퀴티뉴션은 번역 후 중요한 단백질이며, 이의 난독증은 수많은 인간 질환에 연루되어 있다. 이 프로토콜은 파지 디스플레이가 유비퀴티니션의 특이성, 효율성 및 패턴을 제어하는 E3 리개아의 활성을 결합하고 조절할 수 있는 새로운 유비퀴틴 변종을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.

파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

배우세요 도메인옴 라이브러리 구축 및 차세대 시퀀싱을 활용한 단백질 선별 방법을. 이 기술은 고처리량 단백질 상호작용 연구와 기능 분석에 필수적인 도구를 제공합니다.

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

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