Name: 태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 배우세요 Nasonia vitripennis 태아 마이크로인젝션 기술로 유전자 조작을 수행하는 방법을. 이 기법은 독 생성 및 성 결정 연구에 활용되어 말벌 생물학 연구를 발전시킵니다.

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이 작품은 관대 한 캘리포니아 대학, 리버 사이드 (UCR) 실험실 시작 기금 O.S.A, 미국 농 무부 식품과 농업 (NIFA) 해치 프로젝트 (1009509) O.S.A.에 의해 지원 되었다

1. 북 아 일 Vitripennis 식민지 양육
<ol>
	<li>여러 식민지를 설정 (~ 3-5) 버그 기숙사 장에 200-500 북 아 일 vitripennis 성인 (여자: 남자의 3:1 비율)을 배치 하 여. 참고: 버그 기숙사, 말 벌을 사용 하도 여러 개의 작은 유리 시험관 약 15-20 말 벌/유리병으로 목화와 함께 연결에서 전파 수 있습니다.<ol>
		<li>25 ± 1 ℃ 30% 상대 습도, 12시 12분 빛 어두운 주기에, 1:10 (v/v)의 작은 물방울으로 매일 그들을 먹이에 말 벌을 유지 자당/물 솔루션. 주: 말 벌 식민지 및 전파 제어 습도; 없이 실내 온도에 지휘 될 수 있다 또한 그러나, 온도 25 ° C는 배아의 발달 타이밍을 낮출 것 이다 약간 보다 낮은.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>말 벌 주사 전에 적어도 4 일 동안 친구를 허용 합니다.<ol>
		<li>처음 2 일 동안 신선한 먹이를 성관계 여성 수 1:10 (v/v)의 작은 방울으로 서 S. bullata pupae, 자당/물 솔루션.</li>
		<li>다음 2 일에 대 한 산란 사이트, 그들을 아주 벗 만들기의 여성 말 벌을 박탈 하 blowfly 번데기를 제거 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 수집 및 북 아 일 Vitripennis 전 blastoderm 단계 배아의 맞춤
<ol>
	<li>Parasitize에 여성 말 벌 허용 (배아 oviposit) 젊은 주인 (S. bullata pupae)으로. 유지 하기 위해 호스트 신선한, 즉시 그들을 취득 후 4 ° C에서 호스트를 저장 하 고 필요할 때만 제거. 참고: 젊은 호스트 이전 호스트 어두운 컬러 puparium (그림 1A) 반면 빨간 색된 puparium를 함으로써 확인할 수 있습니다.<ol>
		<li>개별 신선한 S. bullata 장소 번데기 크기의 구멍을 가진 거품 스 토퍼에 pupae 중심으로 잘라. 노출만 ~ parasitization와 쉽게 태아 컬렉션의 최대 농도 대 한 호스트의 앞쪽 끝 (선호 산란 사이트)의 0.2 cm. 참고: 앞쪽 끝은 반올림, 후부 끝은 두꺼운 ' 분화구 같은 ' 오프닝 (그림 1B)를 포함 하는 동안.</li>
		<li>으로이 배열에서 호스트 번데기 (100 벌 당 대략 5 호스트 pupae)을 놓고 말 벌 그들 (그림 2- ii) parasitize을 허용 하도록 대략 45 분을 기다려야 합니다. 참고: 그것은 매우 중요 하다는 배아, 어린 이상적으로, 사전 blastoderm 단계에 다는 것을 보장 하기 위해 oviposited의 첫 번째 시간. 오래 된 배아 (&#62; 1.5 h) 주입 수 없습니다.</li>
		<li>손으로 고 부드럽게 칫 솔 질/외면 어떤 거주 말 벌 들을 검색 하 여 개미의 호스트를 제거 합니다. 후 신선한 호스트와 함께 그들을 대체 모든 ~ 15 분 일찍 주사 하는 동안 계란을 개최 수집 계속.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>케이지에서 손으로 갓 parasitized 호스트를 제거 합니다. 현미경으로 해, 겸 자를 사용 하 여 신중 하 게 멀리 명. vitripennis 계란 (그림 2- 3 세) 노출 외부 puparium (번데기 껍질)의 후부 끝 (0.4 cm) 껍질. 참고: 합니다 주의 번데기 피부; puncturing 방지 이 경우는 hemolymph microinjection에 대 한 제거 하기 매우 어려울 것입니다 말 벌 배아 축 축 하 게 됩니다.</li>
	<li>액체 접착제를 사용 하 여 태아 맞춤 슬라이드 (그림 3)를 준비 하는 깨끗 한 유리 슬라이드에 coverslip 접착제. 그러나 참고: 높은 성능 인스턴트 접착제 본드 강도 높이기 위해 사용 되 고 건조 속도,에서 슬라이드에 주위를 움직이고는 coverslip 유지할 수 있는 어떤 접착제는 허용.</li>
	<li>箱 호스트 로부터 신중 하 게 젖은 미세 팁 붓 호스트의 부드러운 번데기 피부를 손상 하지 않도록 만드는 배아. 참고: ' 배아를 선택,'는 본질적으로 ultrafine 집게의 쌍의 절반을 붓 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>전송 ~ 20 배아 하나 하나에 슬라이드, 젖은 붓으로 coverslip의 측면에 인접 한. 태아의 뒤 끝은 같은 방향으로 (그림 2- 4) 지적을 커버 슬라이드의 가장자리에 대 한 배아의 앞쪽 끝을 방향을 정하십시오. 이것은 모든 배아 중 동일한 위치에 주입의 높은 정밀도 대 한 허용. 참고:이 향상 된 기술은 배아21,22위에서 설명한 대로 슬라이드를 해결 하기 위해 이중 면 끈끈한 테이프를 필요 하지 않습니다. 또한, 태아만 하거나 마십시오 주입 명. vitripennis 태아 microinjection22위에서 설명한 대로 동안 halocarbon 기름으로 계란을 커버.</li>
</ol>
3. 바늘 준비 Microinjections
<ol>
	<li>장소에 바늘 끌어당기는 aluminosilicate 모 세관 유리. 참고: 좋은 바늘은 성공적인 명. vitripennis 에 대 한 중요 한 태아 주사. 주사 바늘은 샤 프와는 chorion 통해 쉽게 침투 수 있도록 미세 팁 있어야 합니다. 석 영 및 붕 규 산 모 세관 바늘은 또한 일 수 있다 (그림 4)를 사용.</li>
	<li>605 하 열 , 속도 130, 80 지연 , 당겨 70, 및 500 압력 바늘 끌어당기는 사람에 설정 합니다. 참고: 추가 바늘 끌어당기는 설정 석 영 및 붕 바늘을 당기는 표 1;에서 볼 수 있습니다. 매개 변수는 다른 pullers 및 필 라 멘 트에 대 한 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>활성화를 만드는 올바른 바늘 바늘 끌어당기는 사람. 여러 개의 바늘의 생산을 위해 필요에 따라 반복 합니다. 참고: 가져온된 바늘 여러 병렬 상업 모델러 클레이의 롤을 포함 하는 배양 접시에 그들을 배치 하 여 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>다이아몬드 연마 플레이트 약 10에 팁으로 약간 바늘 팁을 경사 25 ° c (그림 2- 3 세) s. 참고: 주사 바늘 동시에 바늘을 통해 regents의 흐름을 강화 하면서 최소한의 피해와 배아로 항목을 홍보 하 여 빗면에서 혜택.</li>
</ol>
4. 태아 Microinjection
<ol>
	<li>게놈 수정 시 약 (예: transposon + 도우미 transposase, 또는 CRIPSR 시 약 등),구성 된 주입 혼합물을 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>Microloader 팁을 사용 하 여 주입 바늘 주입 혼합물의 2 µ L와 함께 로드 합니다. 참고: 프로토콜에서 주입 혼합 단일 가이드 RNA (sgRNA) (s) 및 H2o.에서에서 혼합 재조합 Cas9 단백질의 구성</li>
	<li>복합 현미경의 무대에 줄지어 배아와 유리 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>조심 스럽게 25-35 °의 각도 수직으로 태아의 뒤 끝에 바늘을 삽입 합니다.</li></ol>주사 주입 혼합물 (배아의 볼륨의 약 2-10%)의 1-5 pL 고 태아 혼합물 (그림 2- 4) 주입으로 약간 팽창에 나타나는지 확인 합니다. 참고: 너무 많은 주입 혼합 배아에 주입 하는 경우 그것은 수 있습니다 버스트 배아에서 세포질을 밝혀. 또한, 잘못 경사지 또는 바늘의 너무 큰 깨진 여 배아 파열을 일으킬 수 있습니다.<ol>
		<li>막힘 발생 하는 경우 다시 경사지 바늘을 보십시오. 명. vitripennis 배아의 세포질은 비정상적으로 점성 및 스티커, 자주 바늘 (1/25 주사) 막힘에 이르게. 참고: 그것은 드 이온된 수는 붓을 사용 하 여 정기적으로 추가 하 여 주입 기간 동안 태아를 축축한 유지 하는 것이 중요입니다. 브러시에 물 양은 배아를 이동 및 쉽게 정렬 키입니다. 너무 많은 물을 부동 및 너무 작은 물 그들 어려운 주위에 이동 하 게 하는 배아 발생 합니다.</li>
		<li>주사 ~ (약 10 분 소요 한다) 한 번에 20-40 알 다음 중지. 주입 된 달걀을 가볍게 만져 젖은 붓으로 주입 된 달걀을 전송 하 고 호스트에 그들을 배치. 달걀의 배치를 계획 사용 하 여 다시 신선한 새로 주입 계속 (&#62; 1 시간 이전). 참고: 이상적으로이 프로토콜은 가장 효과적인, 한 사람이 지속적으로 수집 하 고 달걀을 줄 경우 다른 사람 주입 게놈 수정 구성 요소 이며 호스트 pupae에 주입 된 배아를 이식 하는 동안.</li>
	</ol>
	

5. Injected G0 명. vitripennis Pre-stung 호스트에 배아 이식
<ol>
	<li>이전 쏘 이다 S. bullata 에 주입 된 G0 배아를 신중 하 게 배치 microinjection 후 젖은 붓으로 번데기 (그림 2- 6). 참고: microinjection에 대 한 배아를 수집 하는 데 사용 하는 호스트 pupae이이 목적을 위해 작동 합니다. 또한, 상당한 노력에도 불구 하 고 현재는 사용된22수 있는 사용할 수 있는 인공 다이어트입니다.<ol>
		<li>인구 과잉과 애벌레 경쟁을 피하기 위해 단일 미리 쏘 호스트에 한 번에 40까지 주입 된 배아 하나를 놓습니다. 참고: 주입은에 손상을 태아; 호스트 pupae에 주입 된 배아의 부주의 이식 주입 된 컴포넌트나, 노른자위를 짜 내 고 배아의 죽음으로 이어질 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>호스트 pupae 젖은 필터 종이와 면봉, 페 트리 접시에 놓고 주입된 태아 (대략 1-2 일)이 부 화까지 약 70%의 습도와 25 ° C에서 그들을 품 어 (그림 2- 7 세). 참고: 중요 한 것은, 호스트 남아 있을 수 있습니다는 벗 겨와 함께 puparium 고 명 vitripennis 계란 개발할 것입니다 일반적으로 너무 오랫동안 그들은 건조를 방지 하기 위해 습도 챔버 (젖은 필터 종이와 면봉 배양 접시)에서 알을 품는. 습도 제어할 수 없는 경우에 약화 면봉에서 습도 실 온에서 배양 하는 것은 충분 합니다.</li>
	<li>G0 배아 해치 후 70%의 습도 25°C에서 새로운 배양 접시에 호스트 pupae를 전송.<ol>
		<li>호스트 pupae와 주입된 G0 애벌레를 매일 모니터링 합니다. 만약 호스트 pupae 파울 냄새, 새로운 건강 pupae를 주입된 애벌레를 전송.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 게놈 수정에 대 한 심사
<ol>
	<li>좋은 붓 또는 배아 선택을 사용 하 여 호스트에서 각 명. vitripennis pupae를 제거 합니다. 주입 된 G0 애벌레 약 8 일 포스트 주입을 pupate 한다.</li>
	<li>목화와 함께 연결 된 격리 된 유리 유리병으로 각 제거 번데기를 배치 하 고 G0 성인, 빗금된 여성 된다는 것 처녀 다운스트림 유전 십자가 함께 도움이 될 것입니다 보장으로 등장 하도록 허용. 참고: 여성 정렬할 수 있습니다 남성에서 날개 길이: 암컷 몸 프로필 옆에 설정 과거를 확장 하는 긴 날개를가지고. 모든 microinjected 여성 pupae 연결된 유리병에 함께 놓일 수 있다 그리고 같은 남성 pupae에 적용 됩니다.</li>
	<li>일수로, 어느 PCR 또는 시각적으로 후 화면 G0 개인 (phenotypic 유전자를 방해) 하는 경우. 예를 들어 CRISPR는 삭제 특정된 유전자에 방해 유전자 표시 형 수 여 하는 경우 다음 정렬 하 고 영향을 받는 형 (그림 2- 8 세)의 돌연변이 체 버전 개인 유지21. 그러나, 영향을 받는 유전자는 필수적인 유전자의 돌연변이 등 보이지 않는 표현 형에 대 한 인코딩 하는 경우 복구에 대 한 화면을 횡단 체계 (크로스 G0 와 야생 타입 여성, 남성 또는 교차 G0 에서 야생 유형으로 여성) 수행 시 금 치 또는 무 균을 통해 상속 돌연변이입니다. 참고: D. melanogaster, N. vitripennis 성인과 유사한 CO2 간단 조작에 대 한 허용에 노출에 의해 움직일 수 있다. 또한, unmated 여성 줄 것 이다 상승 100% 단일 남성 broods, 따라서 돌연변이 unmated 여성 후속 분석을 위해 사용 될 수 있는 돌연변이 남성의 많은 수를 야기할 수 있는. 노트: 필수 유전자에 돌연변이 살아남은 G0 주입 여성 (아마도 heterozygous 돌연변이 대 한) 야생 타입 남성;에 짝짓기에 의해 유지 되어야 할 것 이다 G1 여성 자손의의 치명적인 것이 특정 한 경우 G1 남성 자손의 절반 치명적인 돌연변이의 상속으로 인해 죽을 한다.</li>
	<li>Outcross G0 성인과 화면 G1 자손 transgene 삽입 경우 목표는 transgenesis transgenesis 마커를 사용 하 여에 대 한. 현재 transgenesis 명. vitripennis에 설명 될 남아 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Rivers, D. B., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022191094900833">Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis.</a> J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).</li>
<li>Whiting, A. R. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2818420?seq=1#page_scan_tab_contents">The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker).</a> Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).</li>
<li>Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterium+targets+maternally+inherited+centrosomes+to+kill+males+in+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia.</a> Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).</li>
<li>Hurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-Killing+Bacteria+in+Insects%3A+Mechanisms%2C+Incidence%2C+and+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications.</a> Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).</li>
<li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselfish%26%2334%3B+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A &#34;selfish&#34; B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Sci Rep. 7, 42551(2017).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
<li>Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselfish%26%2334%3B+B+chromosome+that+enhances+its+transmission+by+eliminating+the+paternal+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A &#34;selfish&#34; B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome.</a> Science. 240 (4851), 512-514 (1988).</li>
<li>Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venom+Proteins+of+the+Parasitoid+Wasp+Nasonia+vitripennis%3A+Recent+Discovery+of+an+Untapped+Pharmacopee%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee.</a> Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).</li>
<li>de Graaf, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+venom+composition+of+the+ectoparasitoid+wasp+Nasonia+vitripennis+from+bioinformatic+and+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies.</a> Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).</li>
<li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li>
<li>Grillenberger, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+structure+of+natural+Nasonia+vitripennis+populations%3A+validating+assumptions+of+sex-ratio+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory.</a> Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).</li>
<li>Pultz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+role+for+zygotic+hunchback+in+patterning+the+Nasonia+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo.</a> Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).</li>
<li>Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+maternal+orthodenticle+patterns+anterior+and+posterior+in+the+long+germ+wasp+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia.</a> Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).</li>
<li>Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+tailless+in+the+long+germ+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis.</a> Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).</li>
<li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li>
<li>Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genes+Uniquely+Expressed+in+the+Germ-Line+Tissues+of+the+Jewel+Wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis.</a> G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).</li>
<li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome%2C+paternal+sex+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li>
<li>Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+infection-induced+transcriptome+of+Nasonia+vitripennis+reveals+a+preponderance+of+taxonomically-restricted+immune+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes.</a> PloS one. 8 (12), e83984(2013).</li>
<li>Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Nasonia+%28parasitoid+wasp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp).</a> Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).</li>
<li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Sci Rep. 7 (1), 901(2017).</li>
<li>Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1570-7458.1999.00594.x/full">Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis.</a> Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).</li>
<li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

명. vitripennis 게놈의 최근 시퀀싱은 기능적으로 하이 종23내 알 수 없는 유전자 분자 도구에 대 한 중요 한 필요를 나 가길 기다립니다. CRISPR-Cas9 시스템, 그리고 많은 다른 유전자 편집 도구, 다양 한 유기 체24에 대 한 유전자 기능 조사에 도움이 될을 입증 했다. 그러나, 상속 돌연변이 생성 하려면이 도구 태아 microinjections 수행 필요. 따라서, 여기는 효율적인 허용 하는 혁신의 번호를 포함 하는 자세한 시각적 기술 시연 명. vitripennis 태아 microinjections.
전반적으로,이 상세한 기술은 기존 방법23에 관하여 중요 한 혁신의 번호를 제공 하는 수 있도록 효율적인 명. vitripennis 태아 microinjections. 예를 들어 태아의 급속 한 컬렉션을 촉진 하기 위하여 산란 도구 (거품 스 토퍼) 만들어지고 크게 내 수많은 배아의 수집을 용이 하 게 하는 호스트 (그림 1)의 후부 끝에 완전히 누워 계란을 제한 하는 데 사용 시간의 짧은 기간. 계란의 더 큰 숫자를 수집 하는 큰 숫자와 함께 말 벌 식민지를 양육에 대 한 기술도 개선 하 고 정의 된. 또한, 태아 맞춤 가속, 배아를 효율적으로 조정 하 고 이중 면 끈끈한 테이프를 사용 하 여 장소 (그림 3)에서 태아를 보호 하지 않고 주입을 허용 하는 배아 줄 맞춤 장치 개발 된다.
또한, 그것은 배아를 주입 하지 desiccating 배아 또는 기름으로 그들을 취재 하는 동안 물으로 촉촉한 유지 하 여 생존 율 향상을 발견. 또한, 여러 가지 모 세관 유리 종류는 시험 고 명 vitripennis microinjection (표 1, 그림 4)에 대 한 완벽 한 바늘을 구성 하는 매개 변수 결정 됩니다. 또한, 다음과 같은 microinjection, 배아 생존 요금은 미리 쏘 호스트에 주입 된 달걀 잠복기로 인해 증가할 수 높은 습도 (70%) 챔버에 배치. 이러한 혁신 명. vitripennis에 대 한 더 간소 하 고 성공적인 microinjection 절차에 대 한 수 있습니다.
주입 장치 및 절차를 양육 사소한 수정 사용자 환경 설정에 따라,이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계를 성공적으로 명. vitripennis에 돌연변이 생성 하기 위한 필수적인 것입니다. 예를 들어 작업 신속 하 게 삽입 된 배아는 &#62; 1 h와 주사 바늘이 태아에 손상을 최소화 하기 위해 충분히 샤 프 둘 다 필수적인 것입니다. 이 프로토콜은 많은 (그렇지 않으면 모두) 유전자에 돌연변이 생성 하기 위한 효과적 이어야 한다, 하는 동안 한 가지 주요 한계는 대상 시퀀스를 쓰게 됩니다 팸 (NGG) 시퀀스를 대상으로 CRIPSR/Cas9 요구 사항입니다.
결론적으로,이 향상 된 기술은 게놈 수정, 삭제, 돌연변이 등의 많은 종류를 생성 하 고 어쩌면 유전자 변형 생성 하 CRIPSR/Cas9 기술21또는 심지어 transgene 삽입을 사용 하 여 삽입을 사용할 수 있습니다. 명. vitripennis는 크게이 유기 체 기능 연구를 가속 한다.

보석 말 벌 명. vitripennis, Sarcophaga bullata1등 파리를 먹고 육체의 ectoparasitoids는 Nasonia 속 내의 4 종 중 하나입니다. 그들의 빠른 세대 기간, 실험실, 그리고 독특하고 중요 한 생물 학적 특성의 범위에서 양육의 용이성으로 인해 명. vitripennis 전통적인 모형 유기 체에서 발견 하는 여러 실험 도구 개발에 대 한 집중 되었습니다. . 예를 들어 일부 독특한 생물 학적 특성 등 haplo-2 중 복제 시스템2, 미생물 및 유전자 기생충3,4, 관계는 supernumary (B) 염색체5,6 ,7. 함께 찍은,이 게 명. vitripennis 독 생산8, 를 포함 한 다른 사람 뿐만 아니라이 프로세스의 분자와 세포질 측면 elucidating 겨냥 하는 실험에 대 한 중요 한 실험 시스템 9, 섹스 결정10,11, 그리고 진화 그리고 개발 축 패턴 형성12,,1314의. 또한, N의 생물학 연구 유전 툴키트. vitripennis 지난 10 년 동안 극적으로 증가 했다 또는 그래서,15고해상도 게놈 시퀀싱과 여러 유전자 발현 연구16,,1718, 그리고 기능적으로 의존 하는 RNA 간섭 (RNAi)19,20을 함께 향상 추적성 및 반전 유전학이 유기이 체에서 수행의 기능 하는 유전자 발현을 방해 하는 능력.
많은 중요 한 과학적인 전진 및 확장 된 툴킷이 유기이 체에,에 불구 하 고 현재의 지식으로 한 그룹은 성공적으로 수행 상속 게놈 수정21생성 하 미 발달 microinjections. 이것은 그들은 매우 연 약하고 작은, 되 고 ~2/3 초파리 melanogaster 태아, 그들 일반적으로 어렵게 조작할 수의 크기 명. vitripennis 의 배아를 사용의 어려움 때문에 주로 이다. 또한, 명 vitripennis 여성 embryogenesis, 애벌레, 번데기 개발의 전체 발생을 미리 쏘 blowfly pupae로 그들의 계란을 입금. 따라서, 성공적인 microinjections, 사전 blastoderm 단계에 대 한 배아 해야 효율적으로 수집 호스트 pupae, 신속 하 게 microinjected, 그리고 즉시 개발에 대 한 그들의 호스트에 다시 이식에서. 이 단계 정밀 및 microinjected 배아 또는 예외적으로 도전 하는 기술을 만드는 번데기 호스트의 손상을 방지 하려면 손 재주가 필요 합니다. 도 불구 하 고, 북 아 일 vitripennis 태아 microinjection22를 설명 하는 10 년 전 동안 출판 한 짧은 프로토콜입니다. 그러나,이 절차 갓 누워 배아 포장해 될 필요, 그것은 microinjection를 위한 계란 앵커를 끈적끈적한 테이프를 사용 하 여 기술의 시각적 데모를 포함 하지 않습니다. 따라서, 상속 게놈을 생성 하기 위해 어떤 기본적인 연구소에 의해 따라 할 수 있는 북 아 일 vitripennis 태아 microinjections에 대 한 향상 된 단계별 프로토콜을 상세하게 비주얼 절차를 포함 하는 업데이트 및 수정 된 프로토콜은 여기에 설명 된 이 중요 한 모델 곤충에 수정입니다.

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>41515</td><td>곤충 사육 케이지</td></tr><tr><td>유리 시험관</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>살파리 번데기, Sarcophaga bullata</td><td>Carolina Insects</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 베벨러</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 연마 플레이트(0.7u - 2.0u 팁 크기)</td><td>Sutter 기기</td><td>: 104E</td><td></td></tr>, <tr><td>Micromanipulator</td><td>, 세계 정밀 기기</td>: <td>Kite R</td><td></td></tr>, <tr><td>Femtojet Express, 프로그래밍 가능한 마이크로인젝터</td>, <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td>, <td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 또는 P-2000</td><td></td></tr>, <tr><td>실체 현미경</td>, <td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr>, <tr><td>복합 현미경</td>, <td>Leica DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미노실리케이트 유리 모세관 1mm(외경) X 0.58mm(내경)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>붕규산염 또는 석영</td></tr><tr><td>Identi-Plugs를</td> 사용할 수도 있습니다 <td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>폼 플러그</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>접착제</td><td>Aron Alpha</td><td>AA471</td><td>현미경 슬라이드에 커버슬립 접착용</td></tr><tr><td>미세 팁 페인트 브러시</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>초극세 팁 집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips 마이크로로더 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

태아 microinjection 및 nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

보석 말 벌 Nasonia vitripennis 섹스 결정, haplo 2 중 섹스 결정, 독이 합성, 그리고 호스트 symbiont 상호 작용, 다른 사람의 사이에서 포함 하 여 프로세스의 연구에 대 한 효과적인 모델 시스템으로 떠오르고 있다. 이 유기 체와 협력의 주요 한계 감독된 게놈 수정 작업을 수행 하는 효과적인 프로토콜의 부족 이다. 게놈 수정의 중요 한 부분 시 약, CRISPR/Cas9 분자를 포함 하 여 microinjection 통해 배아로 편집의 배달입니다. Microinjection 많은 모형 유기 체에서 잘 설립,이 기술은 특히 도전 명. vitripennis 에서 그것의 작은 태아 크기 및 배아 개발이 완전히 내 발생 하는 사실 때문에 주로 수행 하는 개미의 blowfly 번데기입니다. 다음 절차는 호스트 pupae, 그들, microinjecting 개미의 말 벌 배아에서 효과적으로 제거 하기 위한 유선형, 영상 절차를 시연 하 고 호스트에 다시 신중 하 게 그들을 이식 하는 동안 이러한 중요 한 문제 극복 에 대 한 지속 개발. 이 프로토콜은 강하게이 유기 체에 있는 게놈 고급 수정 작업을 수행 하는 연구 그룹의 기능을 향상 시킵니다.

이 프로토콜 식민지 양육, 사전 blastoderm 배아 컬렉션, 정렬, microinjection, 및 주입 후 후속 이식에 대 한 자세한 지침을 제공 하 고 효율적인 게놈 엔지니어링 명. vitripennis에서 사용할 수 있습니다. 그림 2에서처럼 명. vitripennis 으로 성공적인 microinjection에 대 한 단계의 일반적인 순서 포함: (i) 남성과 여성의 성인 친구 허용 (~ 4 일)에 배치 (ii) 공급 신선한 호스트 비행 pupae (S. bullata)는 성관계 암컷과 산란에 대 한 허용 수정된 폼 플러그 (~ 45 분), (iii) 폭로 하 고 사전 blastoderm 단계 말 벌 배아를 수집 개미의 호스트 pupae 표 피 박 리 멀리 신중 하 게 (~ 15 분), 배아를 수집 (4) 정렬 (~ 15 분), (v) 배아로 microinjecting 게놈 수정 구성 요소 (~ 15 분), (vi) 신중 하 게 배치 주입된 태아 적절 한 개발을 위한 수 있도록 미리 쏘 호스트에 다시 (~ 15 분), (vii) 전송 하 여 주입된 태아/호스트의 탈수를 방지 하 고 약 70%의 상대 습도와 습도 챔버로 그들 (~ 15 분). 개미의 호스트 다음 명. vitripennis 배아의 완전 한 개발을 위한 수 있도록 약 14 일 동안 알을 품는. 일단 주입, 성인 (8 세) 호스트에서 등장, 격리, 친구, 고 예상된 돌연변이의 존재에 대 한 그들을 개별적으로 화면.
효과적인 바늘 침투와 북 아 일 vitripennis 배아로 microinjection에 대 한 여러 종류의 석 영, aluminosilicate, 그리고 붕 형식을 포함 하 여 필 라 멘 트와 모 세관 유리 바늘을 테스트 합니다. 그것은 바늘의 품질은 파손/주입, 동안 막힘 방지 및 두 배아 생존 및 변환 효율의 높은 속도 달성 하기 위한 중요 한 발견. 각 유리 유형에 대 한 효과적인 프로토콜 원하는 피하 같은 긴 팁 명. vitripennis 태아 microinjection 다른 micropipette pullers (P-1000, 및 P-2000)를 사용 하 여에 대 한 효과적인 위해서는 바늘을 개발 되었다 (표 1 그림 4).
절차를 최적화 하려면 생존 율 게놈 수정 부품의 다양 한 금액의 주입에 따라 측정 됩니다. 여기에 사용 된 게놈 수정 구성 요소 했다 혼합된 가이드 RNAs와 편집, CRISPR 중재 게놈에 대 한 Cas9 단백질 명. vitripennis21에서 잘 작동 하도록 이전 시연 했다. 무엇는 이전에 유사한 보고, 여기 단사 유전자 설계 및 합성 sgRNA 타겟팅. 대상으로이 유전자를 방해 함으로써, 쉽게 식별 phenotypic 변화 유기 체19,21의 눈 색깔에 볼 수 있다. 다양 한 sgRNA의 농도 결합 하는 주입 혼합물 (0, 20, 40, 80, 160, 그리고 320 ng / µ L) Cas9 단백질 (0, 20, 40, 80, 160, 그리고 320 ng / µ L) 야생 타입 명. vitripennis의 배아에 주입 되 고. 주입 된 배아의 생존 율은 복용량-의존 (표 2)21발견 된다. 감소 생존 율 (표 2), 아마도 첨가제 오프 대상 효과 때문에 sgRNA와 Cas9 단백질의 증가 농도. 높은 습도 (~ 70%)은 낮은 습도로 호스트, 이식 후 배아 생존을 위해 중요 한 것 또한 발견 (~ 10%) 모든 삽입 된 배아를 100% 죽음 귀착되 었 다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg"> 
그림 1 . 호스트 pupae의 준비 (S. bullata) 에 대 한 명. vitripennis 배아 산란. (A) 영 하 고 오래 된 S. bullata 번데기입니다. 반면 젊은 번데기는 그들의 표 피에 더 붉은 색조 이전 pupae 어두운 표 피가 있다. 젊은 pupae 산란을 극대화에 대 한 선호 됩니다. 번데기의 후부와 앞쪽 끝도는 "분화구 같은 오프닝 후부에, 앞쪽 끝 둥근된 포인트를 제공 하는 반면에 의해 구별 될 수 있다. (B) 북 아 일 vitripennis 배아 산란. 에 대 한 호스트 (S. bullata) 번데기 준비 호스트 번데기는 번데기 했다 거품 플러그에 삽입 구멍을 크기. 앞쪽 끝의 0.2 cm 앞쪽 영역으로 산란의 최대 농도 대 한 허용 노출 플러그 내부 호스트 pupae 얼굴의 후부 측면을가지고. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg"> 
그림 2 . 타임 라인을 만들기 위한 명. vitripennis microinjection에 의해 돌연변이. 명. vitripennis 배아 컬렉션, CRISPR/Cas9 microinjection, 및 포스트 주입 절차의 연대표 명. vitripennis 성인 산란 사이트의 부재에 (나)는 4 일에 대 한 친구 허용 되었다. 는 신선한, 육체 비행 호스트 pupae, S. bullata, 후부 끝의 0.5 c m만 노출로 거품 스 토퍼 안에 parasitization (ii) 수 있도록 45 분 벗 암컷에 도입 되었다. 동시에 microinjection 바늘 및 CRISPR/Cas9 구성 요소를 포함 하 여 주입 재료 (iii) 준비 되었다. 배아는 호스트 (iv)에서 수집, (v), 정렬 되었고 구성 요소 CRISPR/Cas9 (vi)와 주입. 주입 된 배아 신중 하 게 미리 쏘 호스트 (7 세)에 다시 전송 그리고 완전 개발된 (14 일) (8 세)까지 알을 품을. 성인 등장, 돌연변이 대상 유전자 (ix)의 예상된 CRISPR/Cas9 유발 돌연변이 들의 고기에 대 한 상영 했다. 전체 절차는 일반적으로 19 일 걸립니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg"> 
그림 3 . 안 감에 배아 수정된 현미경 슬라이드. (A) A coverslip입니다. (B) 현미경 슬라이드입니다. (C)는 배아 줄 맞춤 장치.coverslip 주입 선 배아에 사용 되는 현미경 슬라이드에 붙어 있을 수 있습니다. coverslip의 목적은 쉽게 조작 및 배아의 수 있도록 가장자리 역할 이다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg"> 
그림 4 . 주사 바늘 준비. 좋은 나쁜 aluminosilicate 유리 바늘의 (A) 예. (B) unbeveled, 올바르게 경사진 고 가난 하 게 경사진된 바늘의 팁. Aluminosilicate 유리 모 세관 튜브 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 뽑아 했다. 생산된 바늘 팁은 다음 부드럽게 열리고는 beveler를 사용 하 여 정제. 좋은 비스듬한 바늘은 매우 날카로운 팁, 그리고 나쁜 비스듬한 바늘은 무딘 팁. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>유리 모 세관 타입</td>
			<td>셔터 바늘 끌어당기는 모델</td>
			<td>열</td>
			<td>필 라 멘 트</td>
			<td>속도</td>
			<td>지연</td>
			<td>풀</td>
			<td>압력</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>석 영</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>붕 규 산</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1입니다. 바늘 끌어당기는 사람에 대 한 설정입니다. 주: 바늘 끌어당기는 설정이 다 기계에서 기계 각 실험실 그들의 자신의 바늘 끌어당기는 설정을 최적화 해야 합니다. 이 테이블 리 외 에서 수정 되었습니다. 21
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA-1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">총 배아</td>
			<td>이식 (10% 습도)</td>
			<td colspan="4">이식 (70% 습도)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>애벌레 생존자</td>
			<td>애벌레 생존자</td>
			<td colspan="3">성인 생존자</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>총 (%)</td>
			<td>총 (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>총 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아니 주입</td>
			<td>아니 주입</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>물</td>
			<td>물</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng / µ l</td>
			<td>20 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng / µ l</td>
			<td>40 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng / µ l</td>
			<td>80 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng / µ l</td>
			<td>160 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng / µ l</td>
			<td>320 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2입니다. 주입 및 이식 survivorship 및 mutagenesis 요금 sgRNA와 Cas9의 다른 농도의 주사에 따라. 이 테이블 리 외 에서 수정 되었습니다 21

Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

이 절차의 전반적인 목표는 게놈 조작을 용이하게 하기 위해 nasonia vitripennis 배아에 미세 주입을 성공적으로 수행하는 것입니다. 이 방법은 독 생산 및 성 결정과 같은 nasonia vitripennis 생물학과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하는 주요 이점은 말벌 게놈을 직접 조작할 수 있고 다양한 고급 게놈 변형을 제공한다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 박사후 연구원인 Ming Li가 맡을 것입니다. 먼저 200-500명의 성체를 암컷과 수컷의 비율이 3:1로 나뉘어 벌레 기숙사 우리에 넣어 여러 개의 N.vitripennis 군체를 형성합니다. 말벌을 섭씨 25도 이상, 상대 습도 30%, 12-12도의 명/암 주기로 유지하십시오.이틀 동안 짝짓기 한 암컷이 신선한 S.bullata 번데기와 1-10 부피에서 부피의 자당 물 용액의 작은 방울을 먹게합니다. 다음 이틀 동안 번데기를 제거하여 암컷 말벌의 산란 부위를 박탈하여 매우 육량적으로 만듭니다. S.bullota 번데기 숙주를 신선하게 유지하려면 얻은 직후 섭씨 4도에서 보관하고 필요할 때만 제거하십시오.붉은색 번데기를 가진 어린 숙주와 더 어두운 색의 번데기를 가진 나이든 숙주를 구별하십시오. 중앙에 번데기 크기의 구멍이 뚫린 거품 마개에 새로운 S.bullata 번데기를 개별적으로 넣어 암컷 말벌이 어린 숙주에 기생할 수 있도록 합니다. 기생을 최대한 집중시키고 배아 채취를 더 쉽게 하기 위해, 둥글게 처리된 숙주의 앞쪽 끝단의 약 0.2cm만 노출시키고, 뒤쪽 끝은 더 두껍고 분화구 같은 개구부를 포함하고 있습니다.이 배열로 숙주 번데기를 케이지에 넣고 말벌이 기생할 때까지 약 45분 동안 기다립니다. 기생한 숙주를 손으로 회수하고 잔여 말벌을 부드럽게 두드리거나 불어내어 제거합니다. 약 15분마다 새로운 숙주로 교체하여 주사 중 초기 단계의 난자를 계속 수집합니다.해부 현미경으로 집게를 사용하여 갓 기생한 숙주의 외부 번데기의 뒤쪽 끝을 조심스럽게 벗겨내어 N.vitripennis 알을 노출시킵니다. 그런 다음 액체 접착제를 사용하여 커버 슬립을 깨끗한 유리 슬라이드에 붙여서 배아 정렬 슬라이드를 준비합니다. 끝이 가는 젖은 붓으로 숙주의 배아를 조심스럽게 털어내면서 숙주의 부드럽고 번양적인 피부가 손상되지 않도록 합니다.그런 다음 젖은 붓으로 약 20개의 배아를 커버 슬립 옆에 바로 인접한 슬라이드에 하나씩 옮깁니다. 배아의 앞쪽 끝이 덮개 슬라이드의 가장자리에 닿도록 하여 배아의 뒤쪽 끝이 같은 방향을 가리키도록 합니다. 이를 통해 모든 배아에서 동일한 위치에 더 높은 정밀도로 주입할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 주사 바늘을 당긴 후 약 10초 동안 섭씨 25도의 다이아몬드 연마판에 팁을 약간 터치하여 바늘 끝을 비스듬히 만듭니다. 게놈 변형 시약으로 구성된 주입 혼합물을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 마이크로로더 팁을 사용하여 주사 바늘에 2마이크로리터의 주입 혼합물을 로드합니다.그런 다음 안감을 이룬 배아가 있는 유리 슬라이드를 복합 현미경의 스테이지에 놓습니다. 바늘을 배아의 뒤쪽 끝에 25-35도의 수직 각도로 조심스럽게 삽입하십시오. 그런 다음 주입 혼합물을 1-5 피코 리터로 주입하고 주입으로 배액이 약간 팽창하는지 확인하십시오.막힘이 발생하면 바늘을 다시 베벨링해 보십시오. N.vitripennis 배아의 세포질은 비정상적으로 점성이 있고 끈적거리기 때문에 바늘이 자주 막힙니다. 한 번에 약 20-40개의 난자를 주입한 다음 중단합니다.주입된 난자를 젖은 붓으로 주입된 난자를 가볍게 만져 숙주에 넣습니다. 그런 다음 새로 낳은 신선한 난자를 사용하여 계속 주입하십시오. 이상적으로 이 단계는 한 사람이 난자를 채취하여 정렬하는 동안 다른 사람은 게놈 변형 성분을 주입하고 주입된 배아를 숙주 번데기에 이식할 때 가장 효과적입니다.마이크로 주입 후, 젖은 붓을 사용하여 이전에 쏘인 S.bullata 번데기에 한 번에 하나씩 주입된 G zero 배아를 조심스럽게 놓습니다. 숙주 번데기를 젖은 여과지와 면봉이 있는 페트리 접시에 넣고 주입된 배아가 약 하루에서 이틀 안에 부화할 때까지 섭씨 25도, 습도 약 70%에서 배양합니다. 중요한 것은 숙주에게 껍질이 벗겨진 번데기를 남길 수 있으며, N.vitripennis 알은 건조를 방지하기 위해 가습실에서 배양하는 한 정상적으로 성장한다는 것입니다.G 제로 배아가 부화한 후 숙주 번데기를 새로운 페트리 접시로 옮기고 섭씨 25도, 습도 70%에서 부화시킵니다. 숙주 번데기를 모니터링하고 매일 G 제로 유충을 주입합니다. 숙주 번데기에서 악취가 나면 주입된 유충을 새로운 건강한 숙주 번데기로 옮깁니다.N.vitripennis 배아에 효과적인 바늘 침투 및 미세 주입을 위해 다양한 마이크로피펫 풀러를 석영, 알루미노실리케이트 및 붕규산염을 포함한 필라멘트가 있는 여러 유형의 모세관 유리 바늘로 N.vitripennis 배아 미세주입에 효과적인 원하는 피하 주사와 같은 긴 팁을 갖도록 테스트했습니다. 여기에 사용된 게놈 변형 구성 요소는 보다 선명한 매개 게놈 편집을 위한 혼합 가이드 RNA와 cas9 단백질이었습니다. 이 실험에서는 진사 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 cas9 단백질과 함께 다양한 양으로 N.vitripennis에 주입했습니다.이 표는 sgRNA 및 cas9 단백질의 농도 증가가 생존율 감소로 이어짐에 따라 생존율이 용량에 따라 다르다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 촉촉한 끝이 가는 붓이나 배아 송곳을 사용하여 조심스럽게 조작 또는 이식 중에 말벌 배아에 구멍을 뚫거나 건조시키지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고급 게놈 변형을 성공적으로 수행하기 위해 말벌 배아를 효율적으로 회수, 미세 주입 및 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

우리는 Ciona intestinalis의, 미세 주입하고 전기 기술을 사용하여 척추 동물에 척색 자매 그룹에 과도 형질 전환 유전자 최저를 제시한다. 이러한 방법은 척색 머리 감각 상피, 인간의 질병 관련 유전자의 많은 orthologs을 포함한 척추 동물의 기본적인 특성, 기능이 단순한 무척추 동물에서 기능 유전체학을 용이하게한다.

척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em&gt; Ciona intestinalis의</em

지중해초파리(medfly) Ceratitis capitata(Diptera: Tephritidae)는 전 세계 농업 해충입니다. 이 식물의 생물학에 대한 깊은 이해는 메드플라이 개체군을 통제하여 경제적 영향을 줄이는 데 중요합니다. 배아 미세주입(embryo microinjection)은 이 종에서 생식세포 형질전환(germ-line transformation)과 역유전학(reverse genetics) 연구를 모두 가능하게 하는 근본적인 도구입니다.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

여기서, 우리는 NASOnia vitripennis에 있는 효율적인 pupal 및 성인 주사를 위한 방법을 태아 micro주입에 접근하는 대안으로, RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 유전자 녹아웃을 통해 RNA 침묵을 사용하여 관심있는 유전자의 기능적 분석을 가능하게 하는 방법을 기술합니다.

나소니아 vitripennis에서 RNAi와 CRISPR 유전자 편집을위한 푸팔과 성인 주사

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

여기에서는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집을 통해 게놈을 수정하거나 생식계열 형질전환을 통해 표시된 전치 요소를 추가할 목적으로 세포 전 옥수수 식물 호퍼 배아를 수집하고 미세 주입하기 위한 프로토콜입니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

배우세요 Nasonia vitripennis 태아 마이크로인젝션 기술로 유전자 조작을 수행하는 방법을. 이 기법은 독 생성 및 성 결정 연구에 활용되어 말벌 생물학 연구를 발전시킵니다.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

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