Name: 병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 배우세요 포유류 대뇌 피질 평탄화 및 염색 기법으로 세포 모듈을 층별로 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 다양한 종 간 피질 구조 비교와 기능 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 신경 퇴행 성 질병 (DZNE), 독일 연방 교육부 (BMBF, Förderkennzeichen 연구에 대 한 훔볼트 대학 촉 산 베를린, 계산 신경 과학 베를린의 번스타인 센터, 독일 센터에 의해 지원 되었다 01GQ1001A), NeuroCure, 그리고 고트프리트 빌헬름 라이프니츠 DFG의 상. 우리 Shimpei 이시야마 우수한 그래픽 디자인 및 우수한 기술 지원 Juliane Diederichs 감사합니다.

모든 실험 절차는 로컬 윤리 위원회 (LaGeSo)의 감독 하에 동물 복지에 독일 지침에 따라 수행 했다. 인간 박쥐 뇌 데이터 노이만 외 에서 파생 했다 5 다음 절차는 성인 남성 Wistar 쥐에 수행 (스트레인: RJHan:WI).
1. 관류 및 뇌 추출
참고: homogenously 고정 하 고 혈액-무료 두뇌를 얻기 위해 동물의 transcardial 관류는 매우 권장 하 고, 잔여 혈액 얼룩 동안 불특정 배경 신호를 증가. 그럼에도 불구 하 고, 유엔 perfused 견본에서 평평된 섹션을 가져오고 얼룩 수 이기도 합니다. 시료 처리의 편리한 사용 정착 액의 농도 따라 다릅니다. 너무 작은 고정 병합 및 절단, 너무 높은 농도 병합에 대 한 유연성과 착 색 신호의 품질 낮은 하는 동안 하는 동안 두뇌에 손상을 처리의 위험을 증가 시킵니다.
<ol><li>Transcardially perfuse는 동물 23 G 바늘을 사용 하 여. 더 자세한 안내 참조 게이지 외. 9<ol>
<li>인산 염 버퍼 식 염 수10 (PBS, 0.02 M, pH 7.4) 동물의 몸과 뇌에서 피를 사용 하 여. 주입 액체 명확, 적어도 150 mL PBS 혈관 시스템을 통해 주입 되 고 표시 될 때까지 계속 합니다. 참고: 최상의 결과 얻으려면 끼얹는다 되 동물의 생리 적인 혈압의 범위와 유사한 압력에 달성 된다 (예를들면, 쥐: 120-130 mmHg). 필요에 따라 솔루션을 피하기 위해 혈액 응고11헤 파 린 (10 U/mL)를 추가 합니다.</li>
		<li>뇌를 해결 하려면 transcardially 최소 100 mL paraformaldehyde12 달 이다 (PFA, 4%; 0.1 M 인산 버퍼 (PB)13) 동물의 목은 뻣 뻣 한 때까지. 주의: PFA는 잠재적인 발암 물질 이다. 참고: 얼룩, 같은 시 토 크롬 산화 효소 조직화 학적인 활동에 대 한 가장 좋은 결과 달성, 2%를 사용 하는 경우 PFA. 다른 얼룩, immunohistochemistry, 등 4 %PFA 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두개골에서 뇌를 추출 합니다. 참고: 게이지 외. 자세한 내용은 9 .<ol>
<li>머리 큰가 위 또는 뼈가 위를 사용 하 여 격리 합니다.</li>
		<li>좋은 위를 사용 하 여 코 목에서 중간에 따라 피부를 잘라. 두개골을 노출 피부 떨어져 당겨. 목과 일시적인 근육 좋은 위를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>정수 리 뼈까지 구멍 매그넘에서 출발 interparietal 뼈 통해 잘라 중간을 확인 합니다.</li>
		<li>벗기다 interparietal 뼈 Rongeurs를 사용 합니다. 화살 봉합을 따라 잘가 위를 정면 뼈의 앞쪽 끝에는 정수 리의 후부 끝에서 잘라.</li>
		<li>Rongeurs를 사용 하 여 정수 리와 정면 뼈 껍질. 또는, 멀리 집게를 사용 하 여 뼈를 들어 올립니다. 숟가락을 사용 하 여 복 부 신경 코드를 잘라내어 뇌를 제거. PB (0.1 m M, pH 7.4)에 뇌를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4%에 침수에 의해 유엔 perfused 두뇌 수정 4 ° C에서 1-3 h PFA (두뇌 크기 및 프로브에 따라: 말괄량이: ~ 1 h, 인간: ~ 3 h). : 참고 대형 및 gyrencephalic 두뇌 인간 같이, 분리 하 고 고정 시간을 줄이기 위해 관심 영역 밖으로 잘라.</li>
	<li>섹션에 더 큰 피 질 영역을 얻기 위해 병합 더 후 고정; 이전 뇌 2 단계로 진행 합니다. 그러나, 부분의 중간 entorhinal 외피 같은 영역에 도달 더를, 후 4%에서 뇌 수정 PFA 2 단계를 진행 하기 전에 24 h에 대 한.</li>
</ol>2. 뇌의 해 부와 병합
<ol><li>면도날 (lissencephalic 두뇌) 또는 메스 (gyrencephalic 두뇌)를 사용 하 여 두뇌 반구를 분리 합니다. 참고: 경우에 뇌 후 고정 되지이 처리에 의해 손상 될입니다.</li>
	<li>후속 섹션 등록 및 수축 추정을 방 조에 대 한 선택적 단계:<ol>
<li>비-관심의 영역에서 피 질 대뇌 피 질의 표면에 정상 35 G 바늘으로 찔린 합니다. 대뇌 피 질의 시트 따라 정의 된 거리에서 두 번 단계를 반복 합니다. 대뇌 피 질의 시트 따라 거리를 결정 하려면 미리 잘라 스레드를 사용 하 여 고정된 길이 (예를 들어, 5 m m)에 하 고 펑크의 포인트를 결정 하는 대뇌 피 질의 표면에 따라 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic 두뇌: subcortical 구조 해 주걱을 사용 하 여 제거. 중요: 모든 절차에 걸쳐 PB (0.1 m M, pH 7.4)와 습 한 뇌를 유지.<ol>
<li>소 뇌에 의해 뇌를 누른 부드럽게 신체 callosum에서 해 부 비행기 여 주걱을 삽입 합니다. 라운드 팁 주걱의 피 질에서 가리켜야 합니다.</li>
		<li>추가 주걱을 주걱 시상과 피 질 사이 때까지 부드럽게 당겨. 별도 동작을 긁어와 subcortical 구조입니다.</li>
		<li>반구도 두께 대 한 검사 합니다. 참고: 모든 고르지 못한 영역이 단면 중 트랜스 레이어 그라데이션에 발생할 수 있습니다. 접선 단면 메스는 뇌를 통해 접선 섹션은 원하는 지역의 pial 표면에 평행 하 게 깨끗 한 컷을 만들기 위해 사용 합니다.</li>
		<li>병합 품질 향상을 위한 선택적 단계를 수행:<ol>
<li>그들은 측면에 피 층의 두께 증가 이후가, 핵 accumbens, orbitofrontal 외피를 통해 깨끗 한 컷을 확인 합니다. 또한, 외피의 중간 부분에의 전개를 수 있는 전 두 엽 피 질의 내부 지역에 구호 컷을 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>유리 슬라이드에 반구 (피 질 아래로)를 놓습니다. 2.6 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gyrencephalic 두뇌: gyri 펼쳐 백색 질 제거 (자세한 프로토콜에 대 한 참조: Sincich 외. 14; Tootell 및 실버15)입니다. 중요: 사용 PB (0.1 m M, pH 7.4) 촉촉한 유지 하는 두뇌에서 모든 시간<ol>
<li>관심 영역을 향하도록 피와 큰 페 트리 접시에 젖은 필터 종이 입었다.</li>
		<li>거미 집 모양의 막과 두 개의 집게를 사용 하 여 pia를 제거 합니다.</li>
		<li>젖은 면봉을 사용 하 고 gyri 사이의 유착을 분리 하려면 각 고 랑에 부드럽게 삽입.</li>
		<li>다른 젖은 필터 종이 사용 하 여 두뇌를 돌아서.</li>
		<li>2 개의 곡선된 마이크로 주걱을 사용 하 여 단일 gyri 전개. 이랑의 오목 끝 가까이 도달까지 떨어져 백색 질을 애타게 하는 주걱의 볼록한 쪽을 사용 합니다. 젖은 면봉을 사용 하 고는 이랑의 오목 끝에 도달 소용돌이 움직임 진행.</li>
		<li>떨어져 단일 gyri 애타게. 필요한 경우 작은 구호 상처 긴장 너무 높은 경우 추가 합니다.</li>
		<li>페 트리 접시 또는 이와 유사한 용기에서 펼친된 두뇌 평평.</li>
	</ol>
</li>
	<li>필요에 따라 지역 밖으로 건조 하지 않습니다 보장 하기 위해 적용 하는 필터 종이 스폰지에 더 큰 두뇌를 배치 합니다.</li>
	<li>양쪽에 찰 흙의 2 개의 연된 조각을 놓으십시오. 중요: 흙의 두께 정의 얼마나 많은 북반구를 결합 수, 점토 10-20% 인지 확인 취소 병합 된 피 질 보다 얇은.</li>
	<li>북반구는 완전히 평평 때까지 부드럽게 피 질에 두 번째 유리 슬라이드/작은 페 트리 접시 누릅니다. 원하는 지역에 대 한 최상의 결과 얻으려면 해당 지역에 유리 슬라이드를 먼저 놓습니다. Lissencephalic 두뇌에 대 한 최상의 결과 얻으려면, 유리 슬라이드 tangentially 측면 부분에 먼저 놓고이 지역에 집중 된 압력을 적용 합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드/페 트리 접시 (예, 세라믹 시계 유리) 무게를 넣어 샌드위치에 4 ° C에서 3-5 h에 대 한 반구를 평평 하 게.</li>
	<li>후 고정을 위한 압력을 해제 하 고 유리 슬라이드를 제거 합니다. 4 ° c.에 통에 24 h 평평된 반구 PFA (무료 부동)에 넣어 참고: 조직화 학적인 활동 stainings에 대 한 최상의 결과 달성 1%를 사용 하는 경우 PFA. Immunohistochemistry, 유엔 perfused 두뇌, 2 %PFA 사용할 수 등 다른 stainings에 대 한.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> 그림 1: 쥐 대뇌 반구 및 시각화 somatosensory 피 질에 모듈의 병합에 대 한 워크플로의 도식 대표. 쥐의 뇌 해 부 transcardial 관류 후 (A). 바꾸어 구조 제거 하 고 피 질 인산 버퍼 (B)에서 두 개의 유리 슬라이드 사이 평평 했다. 병합 된 반구 (C) 후 고정, 접선 sectioned, 고 시 토 크롬 산화 효소 활동 (D)에 대 한 스테인드. 스케일 바 = 1 cm. r: Rostral, c: 꼬리, l: 측면, m: 중간. 라우 어 외. 에서 적응 하는 그림 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 절단 접선 섹션
참고: 얼룩 프로토콜의 요구에 따라 절단 절차 및 두께 적용할 수 있습니다. Vibratome는 80-150 µ m에서 더 조직화 학적인 처리 (3.2 단계) 반구를 잘라 사용 되었다. 그러나, immunohistochemical 처리, 얇은 단면도 원하는 및 냉동 톰 단계에 대 한 단면 (3.3) 10-60 µ m에 사용 되었다. 동영상 1을참조 하십시오.
<ol><li>샌드위치에 평평된 반구를 세척 (0.1M, pH 7.4) 15 분.</li>
	<li>vibratome에 있는 반구를 잘라.<ol>
<li>접선 조각화 홀더는 반구를 놓습니다. 필요에 따라 다시 눌러 부드럽게 위치 (예를 들어, superglue 함께) 그것을 고정 하기 전에 유리 슬라이드와 함께. 참고: 절단 아티팩트 평평된 반구의 작은 간격으로 발생할 수 있기 때문에 사용 하는 접착제의 양을 최소화 합니다.</li>
		<li>필요한 두께에 얇은 끝 (앞쪽, 하 후부 여기) 두꺼운 하 고 더 안정적인 끝에서 반구를 잘라. 3.4 단계로 진행 합니다. 참고: 고정은 낮은 농도 사용 하는 경우 그것을 잘라 느린 속도 높은 진폭에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동 톰에 반구를 잘라.<ol>
<li>Cryoprotect 때까지 (PB)에 30% 자당 해결책에 그것을 immersing 하 여 두뇌 싱크. 참고: 조직 되 고 cryoprotected의 크기에 따라 솔루션에 싱킹 범위는 몇 시간에서 몇 일입니다. 큰 머리에 대 한 대체 cryoprotection 방법 간주 될 수 있습니다 (참조 Rosene 외. 16)입니다.</li>
		<li>기본 탑재 두뇌 동결 톰에 얼음을 형성 합니다. PB 동결 톰의 블록 얼굴에 결빙으로 기본 얼음을 생성 합니다. 중요: 얼음 기지의 표면 톰 블레이드 병렬 인지 확인 합니다. 이 위해 정확 하 게 절단 표면에 평행 하 게 얼음 베이스에 맞게 톰 블레이드를 사용 하 여 기본 빈 얼음 잘라.</li>
		<li>중간에 두뇌를 포함 하 고 평행 블록 얼굴을 관심 영역으로는 톰의 블록 얼굴에 그것을 마운트. 얼굴은 톰의 블록 얼굴 쪽으로 두뇌의 pial 표면. 중요: 샘플 크기;에 따라 동결 온도 조정 높은 온도 단면, 하는 동안 더 나은 섹션 무결성을 보장 하지만 큰 섹션 필요 낮은 온도 균일 하 게 샘플을 동결.</li>
		<li>(느리고 균일 한 절삭 속도 섹션 최상의 결과) 필요한 두께에서 접선 뇌를 잘라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 통에 15 분 동안 샌드위치에 섹션.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> 비디오 1: 쥐 중간 entorhinal 외피 및 parasubicular 및 entorhinal 모듈의 레이아웃에서 접선 단면 구조 동영상. 설치류 두뇌의 중간 entorhinal 외피 외피의 뒤 끝에 위치 하 고 중간과 복 부 측으로 기울어져 있다. 접선 섹션이이 각도 따라 칼 동쪽으로 향하게 하 여 얻을 수 있습니다. 따라서, 적절 한 세포 유형 특정 얼룩 중간 entorhinal 외피와 인접 한 parasubiculum에서 모듈형 구조를 계시 한다. 비디오 레이 브레히트8에서 적응. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
4. 시 토 크롬 산화 효소 얼룩을 사용 하 여 대뇌 피 질의 모듈의 시각화
참고: 다른 얼룩 프로토콜 웡 라일리17 에 의해 먼저 예를 들면, 시 토 크롬 산화 효소 활동의 조직화 학적인 탐지에 대 한 개발 되었고 나중 수정 Divac 외. 18 이 프로토콜 기반 Divac 외. 여 하나 18, 니켈 염화 황산 염 (니 아 스)를 사용 하 여 이후 높은 명암과 얼룩진된 피 질 영역에서 잘 정의 된 모듈에 발생합니다.
<ol><li>시 토 크롬 산화 효소 솔루션 얼룩을 준비 (참조 Divac 외. 18). 솔루션의 10 ml, 추가: 10 mL HEPES 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4), 400 mg 자당, 12.5 mg 니 아 스, 2 mg 시 토 크롬 C, 6 mg diaminobenzidine (한 덩어리). 주의: DAB 및 니 아 스는 발암 성입니다. 참고: 섹션의 부 화 직전 한 덩어리를 추가 합니다.</li>
	<li>15 분 동안 통에 HEPES 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4)에 섹션을 씻어.</li>
	<li>통에 실 온에서 착 솔루션에서 섹션을 품 어. 참고:는 얼룩의 속도 관찰 합니다. 보이는 반응이 있는 경우에, 37 ° c.에 외피로 변경 정착의 양에 따라 얼룩이 지 관찰할 수 있습니다 또는 10 분 후 몇 시간에.</li>
	<li>4%를 추가 하 여 반응을 중지 PFA; 이렇게 하면 원하지 않는 다시 죽어가 고 배경 신호 증가.</li>
	<li>섹션 3 시간 10 분 동안 HEPES 버퍼를 사용 하 여 씻는 다.</li>
	<li>탑재 하 고 유리 슬라이드에 섹션을 건조.</li>
	<li>탈수는 증가 알콜 행 섹션:<ol>
<li>워시 1 분 세척에 대 한 60% 에탄올에 슬라이드 슬라이드 80% 에탄올에 1 분 2 분 3 분 5 분 5 분 크 실 렌에 슬라이드를 씻어 한 소 프로 파 놀에 슬라이드 세척 한 100% 에탄올에 슬라이드 세척 한 96% 에탄올에 슬라이드 세척에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>즉시 빠른 경화 설치 매체를 추가 하 고는 coverslip 추가. 중요: 사용 하지 마십시오 물 기반 설치 매체, 니 아 스 밖으로 세척 될 것 이다 하 고 저하는 얼룩.</li>
	<li>장기 저장을 위한 4 ° C에서 섹션을 유지.</li>
</ol>5. 대뇌 피 질의 모듈 Immunohistochemical 얼룩을 사용 하 여 시각화
참고: 여러 개의 프로토콜 immunohistochemistry, 표본 및 조사 유형의 최적화에 대 한 사용할 수 있습니다. 적응을 만들 수 있습니다 필요에 따라, 항 체, permeabilizing 에이전트 및 보육 시간 다양 한 농도 의해. 다음 프로토콜 형광 프로브에 의해 항 체 및 시각화의 넓은 범위를 검색 하 여 좋은 결과 이끌어 낸다.
<ol><li>15 분 동안 PBS (0.1 m M, pH 7.4)에 섹션을 씻어.</li>
	<li>선택 사항: 정체 (Jiao 외 에 따라 물 목욕을 사용 하는 epitope를 항 원 복구 수행 19; 대체 참조 하십시오 Pileri 외. 20)입니다.<ol>
<li>80 ° c 물 목욕을 예 열 트라이-나트륨 시트르산 버퍼19 (pH 8.0)를 준비 하 고 80 ° c 물 목욕에 예 열</li>
		<li>트라이-나트륨 시트르산 버퍼 섹션을 전송 합니다. 80 ° C에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어</li>
		<li>차가운 실내 온도 아래로 섹션</li>
		<li>15 분에 대 한 PBS에 섹션을 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS-X에 두 번 섹션을 세척 (0.5 %0.1 M PBS에 트리톤-X) 15 분.</li>
	<li>잠복기 2 h에 대 한 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 2.5%)과 트리톤-X (0.75%) PBS에 솔루션에서 섹션으로 불특정 epitopes를 차단 합니다.</li>
	<li>1 차적인 항 체, 예를 들어, Calbindin-D28k에에서 섹션을 품 어 (1:5, 000, PBS-X에 1 %BSA), 4 ° c.에 셰이 커에 2-3 일 참고: 기본 항 체에 대 한 최적의 희석 사용 하는 특정 항 체에 따라 달라 집니다. 특정 항 체에 대 한 희석 기준을 제조 업체의 정보를 참조 하십시오. 여러 항 체 함께 사용 될 수 있다 그러나 다른 종에 대 한 발생 합니다.</li>
	<li>15 분에 대 한 PBS에 세 번 섹션을 씻어.</li>
	<li>통에 4 ° C에서 이차 항 체 (1: 200, PBS에서 1 %BSA)에서 하룻밤 섹션을 품 어. 참고: 여러 2 차 항 체 여러 기본 항 체 사용 되 면 다른 스펙트럼에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>10 분에 대 한 PBS에 세 번 섹션을 세척 하 여 이차 항 체를 씻어.</li>
	<li>탑재를 건조 한 유리에 대 한 섹션입니다. 참고: 섹션 여전히는 coverslip 장착 전에 촉촉한 이어야 한다.</li>
	<li>조직 섹션에 형광 염료에 대 한 적합 한 설치 매체를 적용 하 고는 coverslip 적용.</li>
	<li>1 시간에 대 한 섹션을 건조.</li>
	<li>장기 저장용 coverslip 매니큐어를 사용 하 여 밀봉 하 고 4 ° c.에 어둠 속에서 계속</li>
</ol>

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</ol>

저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

대뇌 피 질에서 모듈화는 다양 한 기법을 사용 하 여 확인 되었습니다. 어느 시각화 하 여 초기 연구는 일반적으로 식별 대뇌 피 질의 모듈 세포 밀도 영역 또는 섬유1의 부재. 후속 메서드 수지상 번들24, 특정 지역25, afferents의 존재 또는 신경 전달 물질26의 농축 활용 했습니다. 여기 두 가지 방법, (i) 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 및 (ii) immunohistochemical 얼룩이 보여 줍니다.
시 토 크롬 산화 효소 얼룩 그리고 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하는 가장 인기 있는 방법 중 하나 되었습니다 기본 감각 외피가27,28에 널리 사용 되 고 있다. 그것...

일부 계통에서 뇌 구조에서 가장 중요 한 변화는 대뇌 피 질에서 관찰할 수 있습니다. 중요 한 차이도 불구 하 고 동물의 피 질 일반적인 패턴 및 분할 될 수 있다 광범위 하 게 두 가지 방법으로 레이어 및 지역1. 대뇌 피 질의 레이어 두뇌의 표면에 평행이 고 파충류 외피가2 에 3 층에서 포유류 외피가16 레이어 숫자에서 다. 대뇌 피 질의 영역 다른 한편으로 주로 해당 고유 기능, 예를 들면하는 외피의 별개 영역, somatosensory 피 터치의 시각적 입력 처리에 시각 피 질 감각에 참여. 이러한 대뇌 피 질의 영역 수 종종 수 세분화 패치 또는 모듈3, 정기적으로 해 부 구조, 근본적으로 뇌의 pial 표면에 평행 하 게 반복 하는. 대뇌 피 질의 모듈 특정 레이어4에 갇혀 있을 수 있습니다 또는 여러 레이어5에서 확장.
두뇌의 표준 단면 방법 코로나 또는 화살 처럼 두뇌의 표면에 수직 섹션을 포함 한다. 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다, 하는 동안 대뇌 피 질의 모듈은 두뇌의 표면에 평행한 평면에 접선, 시각 때 다양 한 흥미로운 기능 계시 될 수 있습니다. 예를 들어, 수염, 대표 설치류 두뇌 somatosensory 모듈 배럴 때 뇌 표면에 정상적인 시각으로 나타나고 따라서 지역 파생 이름 신 피 질. 그러나, 접선 방향에서 배럴, 머릿속에 외부 몸 표면에 수염의 정확한 레이아웃을 미러링 지형 방향에 배치 되 고 배럴을 가진 수염-지도, 공개 그들은. 경우에 따라, 모듈 배열도 탈출 상당한 기간에 대 한 감지 비 접선 방식으로 시각화 하는 경우. 중간 entorhinal 외피, 표 셀, 동물 환경이 이동 될 때 일반 육각 패턴에 발생 하는 신경 세포의 존재에 대 한 알려져 있다. 비록 그것은 무 겁 게 조사 지역, 최근, 패치의 존재 또는 중간 entorhinal 외피에 있는 세포의 모듈까지,이 실제로 6 각형 패턴6, 레이아웃 탐지를 탈출 했다. 존재와 쥐 뇌에서 이러한 모듈의 중간 entorhinal 외피의 접선 섹션을 만들고 layer-wise 방식으로 cytoarchitecture를 조사에 의해 촉진 되었다.
단면, 후 대뇌 피 질의 모듈의 시각화의 특정 측면도 여러 가지 방법으로 실현 될 수 있습니다. 고전적인, 연구 모듈 세포 밀도 또는 섬유 레이아웃1에 따라 구분 된 있다. 또 다른 인기 있는 방법은 높은 활동8의 영역을 계시 한다 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry의 사용 이다. 새로운 접근 유전자 결정된 세포 유형, 그들의 단백질 식 프로필6,8기준으로 구별을 보고 포함 한다.
이 연구에서 우리는 하 포유류 두뇌에서 외피 분리 평평된 접선 섹션, 대뇌 피 질의 모듈 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 및 세포 형 특정 단백질의 immunohistochemistry 기반 시각화 방법을 강조 표시 합니다.

<table><tbody>말 심장에서 <tr><td>Cytochrome oxidase staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 니켈(II) 황산염 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>항원 회수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>구연산 일수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodium 수소 인산염 이수화물</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k puriefied 닭 내장, 마우스 단클론</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k 재조합 쥐 calbindin D-28k, 토끼 다클론</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>알부민 분획 V, 비오틴 무함유</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Mount or freezing media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt ( 조직화학)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>조직 동결 매체</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Alcohol dehydration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>크실렌 대체물</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</ strong</td></tr><tr><td>>Devices/tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF 펜치 - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>뼈 가위 - 24cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - 대형 루프</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - 날카롭고 무딘</td><td>미세 과학 도구</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>미세 홍채 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

포유류 두뇌의 대뇌 피 질은 별개 콘텐츠의 또는 모듈에 parcellated. 대뇌 피 질의 모듈 일반적으로 대뇌 피 질의 시트에 평행이 고 특정 immunohistochemical 조직화 학적인 방법에 의해 구분 된 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 대뇌 피 질의 시트 섹션 병렬을 얻기 위해 그들을 평평 하 게 포유류 두뇌에서 피 질을 분리 하는 방법을 강조 표시 합니다. 우리 더 강조 조직화 학적인 선택 하 고 이러한 처리 immunohistochemical 방법 평평 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하기 위해 접선 섹션. 다양 한 포유류의 somatosensory 피 질에 우리 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 몸 지도 나 동물의 신체의 다른 부분을 대표 하는 대뇌 피 질의 모듈을 수행 합니다. 중간 entorhinal 외피, 그리드 셀 생성 되는 지역에서에서 우리 immunohistochemical 메서드를 여러 종에 걸쳐 대뇌 피 질의 시트에 그리드 패턴에서 배열 되는 유전자 결정된 뉴런의 모듈을 강조 표시 사용 합니다. 전반적으로, 프레임 워크를 분리 하 고 layer-wise 준비 대뇌 피 질의 섹션, 평평 하 고 대뇌 피 질의 모듈 사용 하 여 조직화 학적인 방법과 immunohistochemical 포유류 두뇌의 다양 한 시각화 제공 합니다.

우리 somatosensory 피 다양 한 두뇌, 대뇌 피 질의 평평된 섹션을 획득 하 고 그들을 다른 신체 부위를 나타내는 somatotopic 모듈을 시각화 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry에 대 한 처리. 이 비교 방법을 공부 진화 세력 그 모양 피 질, 예를 들어, 설치류 그리고 토끼목 배럴21 (그림 2)로 mystacial 털의 높은 보존된 표현을 보여주는 수 있습니다. 반면, 발, 성 기 등 다른 신체 부위 표시에 그들의 친척 크기 변화와 생태 틈새 또는 성적 선택22,23전문화를 반영.
중간 entorhinal 외피의 ...

이 문서는 포유류 외피가에서 평평된 접선 섹션을 가져오고 피 질 조직화 학적인 사용 모듈과 immunohistochemical 방법을 시각화 하는 상세한 방법론을 설명 합니다.

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

피질 평탄화 및 염색을 위한 이 절차의 전반적인 목표는 피질 영역의 세포 모듈을 층별 방식으로 시각화하는 것입니다. 이 방법은 대뇌피질 구조가 어떻게 뇌로 퍼져 나가는지, 그리고 그것이 기능과 어떻게 관련될 수 있는지와 같은 신경 과학의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 피질 구조를 층상 방식으로 비교하고 클래스 진화를 어떻게 보존하는지 또는 기능이 어떻게 다양한지와 같은 다양한 측면을 비교할 수 있다는 것입니다.이 기술을 시연하는 사람은 Simon Lauer와 Michelle Black 교수 연구실의 학생이자 기술자인 Undine Schneeweib입니다. 우선, 균질하게 고정되고 혈액이 없는 뇌를 얻기 위해 동물을 경심 관류합니다. 뇌를 제거한 후 0.1 몰 인산염 완충액에 담그십시오.큰 피질 영역이 있는 절편이 필요한 경우, 추가 후고정(postfixation) 전에 뇌를 평평하게 만듭니다. 그러나 내측 내후각 피질과 같이 접근하기 어려운 영역의 부분을 얻으려면 평평해지기 전에 24시간 동안 뇌를 4% PFA로 후접미사로 만듭니다. 전체 해부 동안 완충제로 뇌를 촉촉하게 유지할 준비를 합니다.시작하려면 메스를 사용하여 반구를 분리합니다. 뇌가 후고정되지 않았다면 다룰 때 주의하십시오. 다음으로, 소뇌로 뇌를 고정하면서 주걱을 부드럽게 삽입하여 뇌량의 해부면을 엽니다.주걱의 둥근 끝은 피질에서 멀어져야 합니다. 그런 다음 주걱을 조작하여 시상과 피질을 나눕니다. 다음으로, 면도날을 사용하여 피질하 구조를 분리한다.다음으로, 메스나 주걱의 가장자리를 사용하여 피질하 구조를 분리합니다. 평탄화를 개선하려면 선조체, 측좌핵 및 안와 전두엽 피질을 깔끔하게 절단하십시오. 그런 다음 전전두엽 피질의 내부 영역 기저부에 완화 절단을 추가합니다.이것은 피질의 내측 부분의 전개를 허용한다. 이제, 반구 피질을 유리 슬라이드에 놓습니다. 그런 다음 조직의 양쪽에 두 개의 점토 실린더를 놓습니다.점토는 뇌 조직보다 10-20% 더 얇아야 하는데, 점토가 평평해지는 정도를 정의하기 때문입니다. 다음으로, 유리 면을 피질에 접선으로 놓고 측면 부분을 먼저 접촉시킵니다. 그런 다음 질량이 측면 부분의 중앙에 오도록 유리에 무게를 설정합니다.이제 어셈블리를 섭씨 4도의 인산염 완충액에 3-5시간 동안 그대로 두십시오. 이 준비의 진정한 핵심은 뇌를 가능한 한 평평하게 만드는 것인데, 이는 피질 지도를 보는

visualization-of-cortical-modules-in-flattened-mammalian-cortices

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스를 네크로 텍스에 삽입 마우스 오른쪽 단추로 각도 마이크로 일반적으로 통에 발견 관점 여러 피질 레이어의 깊은 화상을 허용합니다. 원 - mm 마이크로는 다양한 현장의 전망 (~ 900 μm의)와 돌기 쪽이를 해결하기 위해 충분한 공간 해상도를 제공합니다. 우리는 계층 V의 연결 이미지와 마이크로를 사용하여 neocortical 혈관 영상을 보여줍니다.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

이 비디오는 쥐 새끼의 뇌에서 콜리큘로-시상 피질 뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다. 고립된 뇌는 표시된 슬라이드에 정렬되고 청각 중뇌와 전뇌를 같은 평면에 정렬하기 위해 비스듬히 절단됩니다. 그런 다음 비브라톰을 사용하여 뇌를 절편화하고, 주요 청각 중뇌 및 전뇌 구조를 포함하는 절편을 보존을 위해 보관실로 옮깁니다.

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain(쥐 강아지 뇌의 Colliculo-Thalamocortical Slices)

출처 : Lauer, S. M.,  et al. Visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices. J. Vis. 특급 (2018) 이 비디오는 조직화학적 염색을 사용하여 편평한 뇌 단면에서 피질 모듈을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 사전 고정된 절편은 활성 신경 클러스터를 강조하는 변형 시약으로 처리되어 어둡고 대비가 높은 영역을 형성합니다. 장착 및 탈수 후, 피질 모듈은 명시야 현미경 아래에서 어둡고 고르지 못한 패턴으로 나타납니다.

편평한 뇌 절편에서 피질 모듈의 조직화학적 이미징

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기에서는 쥐와 생쥐의 고밀도 마이크로 전기 피질 검사(μEcoG) 기록을 위한 수술, 이식 및 기록 방법을 포함한 두 가지 프로토콜을 제시합니다. μECoG 기록은 쥐의 청각 피질에서 층류 다원(laminar polytrode) 기록 또는 쥐의 체성 감각 피질(somatosensory cortex)에서 신경 활동의 광유전학적 조작과 함께 수행됩니다.

설치류의 미세 전기 피질 조영술과 층류 폴리트로드 및 광유전학을 통합하여 피질 처리의 멀티스케일 조사

배우세요 포유류 대뇌 피질 평탄화 및 염색 기법으로 세포 모듈을 층별로 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 다양한 종 간 피질 구조 비교와 기능 연구에 활용됩니다.

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

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