Name: 마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 학습하세요 마우스 망막 안료 상피 세포 분리 및 1차 배양 방법을. Dispase II 소화와 현미경 하 절제술을 활용하여 세포의 원래 특성을 유지하면서 신경망막 연구에 필수적인 기술을 습득할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 BrightFocus 재단 (DS)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

동물 주제와 관련 된 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 피츠버그 대학에 의해 승인
1. 준비 솔루션
<ol><li>성장 매체에 의해 보충 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린/스, 2.5 m L-글루타민, m 및 1 x 메모리 불필요 한 아미노산이 포도 당을 준비 합니다. 미리 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 미디어 따뜻한.</li>
	<li>2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션을 준비:<ol>
<li>300 µ L HEPES 버퍼링 염 분 (50 mM HEPES/코 pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dispase II의 30 mg를 용 해 하 여 100mg/mL dispase II의 재고 솔루션을 준비 합니다. 이 볼륨은 3-4 마우스에 대 한, 그것은 최대 크기를 조정 하거나 아래 실험을 위해 쥐의 수에 따라 수). 이 주식은 4 ° c.에 적어도 1 주 동안 저장 될 수 있다</li>
		<li>살 균 DMEM, 높은 포도 당 및 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링의 1.2 mL dispase II 재고 100 mg/mL의 300 µ L을 추가 하 여 2 %dispase 작업 솔루션을 준비 합니다. 이 단계는 층 류 살 균 조건 하에서 캐비닛에서 수행 되어야 합니다. 미리 준비 된 dispase II 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 따뜻한.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 취득 마우스 눈
<ol><li>모든 승인 된 방법을 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 흡수 성 패드에 두십시오.</li>
	<li>장갑, 입고 엄지와 검지로 눈 주위 넣고 부드럽게 피부 proptose 안구에 밀어.</li>
	<li>피부와 안구 사이 각도 위 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 눈을 잘라. 오염을 방지 하려면 70% 에탄올에 눈을 찍어 잠시.</li>
	<li>즉시 눈에는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 페 트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>2.2-2.4 두 번째 눈을 제거 하려면 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>3. 눈 해 부
<ol><li>조심 스럽게 해 현미경 눈에서 결합 조직 제거. 이것은 건조 배양 접시 또는 PBS에 행 해질 수 있다.<ol>
<li>봉합 집게를 사용 하 여 안구에서 결합 조직 고 욕실이 위를 사용 하 여 밖으로 그들을 잘라. 그것은 거의 경우에 공 막 잘라 그대로 후부 eyecups를 얻을 수 있기 때문에 여 sclera를 자르지 않는다.</li>
		<li>결합 조직, 청소 후 다음 세척 단계에 대 한 PBS에 결과 눈알을 유지. 참고: 모든 다음 단계는 캐비닛 무 균 조건 하에서 층 류에서 수행 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 두 번 눈을 씻으십시오. 신중 하 게 미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 눈알 집게를 사용 하 여 전송 합니다. 새로운 요리에 신선한 매체 매체 및 전송 눈알 발음</li>
	<li>DMEM (높은 혈당) 매체를 발음 하 고 37 ° C 배양 기에서 45 분을 위한 미리 데워 진된 2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션에 눈을 품 어. 참고: 다음 단계에 놓고 눈 조직을 보호 하 고 해 부에 대 한 좋은 매체를 제공 하는 성장 매체에서 eyecups를 조작 합니다.</li>
	<li>Dispase II 솔루션을 제거 하 고 오래 된 매체를 발음 하 고 새로운 37 ° C에 미리 데워 진된 성장 매체 (그림 1a)를 추가 하 여 성장 매체에 두 번 눈을 씻고. 참고: dispase II에 의해 분리, 후 시선 될 부드러운.</li>
	<li>집게와 눈을 누른 층 류 캐비닛 배치 해 현미경 욕실이 위를 사용 하 여 각 눈의 오 라 참나무 주위 절 개 합니다.<ol>
<li>솔루션에 안구 유지, 조심 스럽게 ora 참나무 둘레 컷을 확장 하 고 컷 완료 후 멀리 앞쪽 막 당기 앞쪽 각 막 제거.</li>
		<li>부드럽게 teethed 집게 (그림 1b, 1c)으로 아이피에서 그들을 당겨 렌즈 캡슐과 관련 된 홍 채 색소 상피를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE 신경 망막의 분리를 촉진 하기 위하여 37 ° C에서 20 분에 대 한 성장 매체에 결과 후부 eyecups를 품 어.</li>
	<li>층 류 캐비닛 배치 해 현미경 4 꽃잎에 후부 eyecups 잘라. 인하 충분히 짧은 만큼 꽃잎을 연결 (그림 1의 d)를 유지 하지만 아이피를 평평 하 게 해야 합니다.<ol>
<li>아이피를 평평 하 게 하 고 나머지를 잡고 집게와 매우 부드럽게 당겨 신경 망막 분리 RPE 맥락 막 sclera 복합 다른 집게 (그림 1e). 가장자리에서 보다 중심에서 철수 시작.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새로운 메 마른 문화 접시에 4 등분된 모든 조직으로 가득 전송 사전 37 ° C 성장 매체를 따뜻하게 합니다.</li>
</ol>4입니다. 기본 RPE 세포의 고립
<ol><li>함께 4 등분 RPE 맥락 막 sclera 단지 보유 한 꽃잎 집게 슈퍼 파인, 부드럽게 해 현미경 microsurgical 초승달 모양의 칼을 사용 하 여 기본 지하실 막 (Bruch의 막)에서 RPE의 그대로 시트를 벗기다 층 류 캐비닛 (그림 1 층)에 배치.<ol>
<li>RPE 시트 P200 micropipette를 사용 하 여 성장 매체를 포함 하는 새로운 메 마른 문화 접시에 전송 합니다. RPE 시트를 전송할 때 여러 번 pipetting으로 성장 매체와 피 펫 팁을 젖은 조직 팁 내부 고정 하지 않도록. RPE 맥락 막에서 명확 하 게 구별할 수 있을 것입니다: RPE 보이는 더 갈색, 맥락 막 어두운 보이는 끈 적 하 고 무성 한 하는 동안.</li>
		<li>맥락 막14RPE 분리 효소 소화와 집게 없이 부드러운 분리 또는 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3 번 사용 하 여 미리 데워 진된 37 ° C RPE 시트 세척 살 균 배양 접시에 성장 매체. 각 세척 단계 후 신중 하 게 다른 조직 파편 망막 또는 맥락 막 등을 피하는 동안 RPE 시트를 수집 합니다. 마지막 세척의 끝에 P200 micropipette RPE 시트를 수집 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 참고: 저기 RPE 시트 원심을 필요 없다: 그들은 1 분 이내 중력에 의해 침전 물 것 이다.</li>
	<li>P200 micropipette를 사용 하 여 추가 성장 매체를 제거 합니다. 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 P200 micropipette를 사용 하 여 그들을 triturate. 거품의 형성을 하지 마십시오. 단일 세포 현 탁 액 이상적 이지만 또한 너무 많은 분쇄를 하지 마십시오, 그렇지 않으면 RPE 세포는 살아남을 수 없습니다. 좋습니다 매우 부드럽게 분쇄를 40-50 시간.</li>
</ol>5. RPE 세포 배양
<ol><li>문화 접시에 셀 접시<ol>
<li>RPE 세포의 다운스트림 응용 프로그램 그들의 극성의 유지 필요, 접시는 RPE 12 잘 배양 배지에서 미리 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입 2 쥐에서 세포. 높은 밀도에서 셀 도금 경우 RPE 세포 6 각형 모양 및 착 색 등 원래 속성을 유지할 수 있기 때문에 원하는입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시를 이동 하거나 경작의 첫 번째 72 h에 대 한 성장 매체를 변경 마십시오. 3 일 후, 오래 된 매체를 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체 바꿉니다. 그 후 문화 매체를 매일 변경 합니다. 일단 RPE 세포 confluency, 2% 성장 매체에서 FBS를 줄일 수 있습니다. 참고: 셀 수 있는 분할 0.25 %trypsin 사용 하 여. 그러나, 분한 후 셀 그들의 6 각형 모양 및 다음 구절에 염색 잃을 수 있습니다. 우리는 셀 분할 하지 않는 것이 좋습니다 있지만 문화권의 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 경우 기본 셀 무기한 passaged 수 없습니다: 그들은 해제 후 5-7 구절 차별화 하는 데 알려져 있다.</li>
</ol>

<ol><li>Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development%3A+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li>
<li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li>
<li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells%3A+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li>
<li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li>
<li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li>
<li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li>
<li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+%28RPESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li>
<li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+culture%3Ba+potential+source+of+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmic+Vis+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li>
<li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li>
<li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1%2F%CE%B2A3%2FA1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li>
<li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin%2C+complex+1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li>
<li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium%3A+Special+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li>
<li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li>
<li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li>
<li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li>
<li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa%2C+the+Usher+syndrome+1B+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li>
<li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li>
<li>Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+retinal+pigment+epithelium%3A+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li>
<li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li>
</ol>

DS는 연구 바이엘 헬스케어, 독일 및 F. 호프만-라 로슈, 스위스에서 자금을 받았다. 나머지 작가 아니 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 이 작품은 방지 실명 (무제한 보조금 Wilmer 눈 연구소와 피츠버그 대학교) 연구에 의해 지원 됩니다.  이 작품도 안과, 피츠버그 대학에서에서 DS 시작 자금에 의해 지원 됩니다.

제시 상세한 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 1 주 후 confluency를 도달 6 각형 모양 및 2 주 후 착 색 등 주요 RPE 특성을 제시 하는 신뢰할 수 있는 설립을 수 있습니다. 얻은 RPE 세포 다양 한 비타민 A 대사9,10 의 포토 리셉터 외부 세그먼트 식 균 작용 및 이온 전송11, 상피 세포 극성2, lysosomal 같은 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 항상성 그리고 autophagy12,13. 파생 문화 형태학 전송에 의해 유효성을 검사할 수 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 설명 된 대로 자세히 다른14다운스트림 응용 프로그램에 따라. RPE 세포의 극성을 보여주는 문화의...

망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 편광 된 상피 세포의 층 이다. RPE 세포의 기능과 RPE 단층의 무결성 비전에 대 한 중요 하다는 RPE 외부 혈액 망막 방 벽, 물과 망막 사이의 이온의 수송을 유지 등 여러 프로세스에서 중요 한 역할을 담당 하기 때문에 고 맥락 막, 빛 흡수, 산화 스트레스, retinoid 대사의 제어 및 대뇌1,2의 외부 세그먼트의 식 균 작용 으로부터 보호 유리 체를 혈액에서 통과에서 체계적으로 관리 하는 마약 방지의 장벽 기능 뿐 아니라, 눈 뒤쪽 RPE의 위치는 RPE 기능에서 vivo에서의 복잡성을 연구 하기 어려울. 따라서, 유연 하 고, 제어 환경3,4RPE 세포 연구 RPE 세포 배양의 설립에 대 한 중대 한 필요가 있다.
설립 RPE 세포 선의 수 존재, 및 셀; 저장의 간단 하 고 편리한 방법을 제공 그러나, passaged 세포 1 차 셀2,,34에 비해 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 그들은 종종 세포 형태학에 있는 변화에 의해 특징은. 예를 들어 기존 셀 라인의 셀 극성 표현 형의 손실 및 단단한 접속점4의 부분 실종 RPE 장벽 속성의 신뢰할 수 있는 연구에 대 한 적합을 발견 했다. 극성 및 적절 한 셀에 셀 연결의 손실 뿐만 아니라 RPE 세포 선을 신속 하 게 성인 RPE5키 melanogenesis 효소의 부재로 인해 그들의 착 색을 잃게됩니다. 색소를 복원할 수 있습니다, 하지만 다시 염색 전송 전자 현미경 검사 법의 조합 포함의 메커니즘의 포괄적인 분석, 멜 라 닌의 존재를 확인 하 진 식 분석, 화학 분석 적 되어 수행된6. 한 가지 더 한계는 RPE 세포 라인 확장된 셀 생활 (때로는-불멸) 있고, 특정 조건에서 양식 식민지7, 부동 고 기판에서 분리 하는 자기 갱신 multipotent 줄기 세포로 변형 시킬 수 있다 8.이 제한 이식 실험3셀 라인 사용을 불가능 하 게.
설립된 RPE 세포 라인의 단점을 고려 하면 신선한 조직에서 얻은 기본 RPE 세포 배양 수는 RPE 공부를 좀 더 생물학적으로 관련 모델 역할을 합니다. 뿐만 아니라와 같은 비타민 A 대사9, 먹어서 포토 리셉터 외부 세그먼트10 이온의 수송11, RPE 특정 기능을 공부 뿐만 아니라와 같은 기본적인 세포 생물학 공부 기본 RPE 세포 사용 된 상피 세포 극성2 , lysosomal 항상성 그리고 autophagy12,13.
지난 몇 년간 수의 기본 RPE 문화에 게시 되었습니다, 연구3,,1415의이 지역에 있는 성장 관심사를 나타내는. 인간의 RPE 세포와 비 인간 RPE 세포 소 및 돼지 RPE 세포 등 수많은 프로토콜 했다 게시 된16,17,,1819. 그러나, 그들의 매우 더 작은 크기 때문에 마우스 RPE 세포를 처리 하기 위해 더 어렵습니다. 비록 꽤 간행물의 수는 마우스14,,2021에서 RPE 세포 격리 프로토콜, 지금도 많은 연구 없이 RPE 세포를 분리 하 고 투 맥락 막 셀 또는 셀 신경 망막에서의 오염. 여기 선물이 기본 마우스 RPE 세포 배양, 마우스, 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리에서 눈을 얻는 등을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 비디오 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 작업 필요 해 부 기법에 대 한 지침을 시작 하는 연구자에 대 한 특히 유용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3주 된 야생형 마우스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 1X, pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(200mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 항체</td><td>Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td>의 선물</tr>인 <tr><td>Fluorescein Phalloidin&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-토끼 IgG (H+L), Alexa Flour 568&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>A11011&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Polyclonal 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td><>instrumentsand equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경 (Zoom 실체 현미경)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator with hot air sterilization</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 폴리에스터 멤브레인 인서트 12-웰 배양 플레이트에 사전 로드, 기공 크기: 0.4 &마이크로; m, 멸균</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott 건절개 가위, 표준 블레이드, 날카로운</td><td>STEPHENS 기구</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 봉합 겸자 0.12mm</td><td>Stroz 안과 기구</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>초승달 모양 직선 칼</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 #5, 11cm, 직선, 0.1x0.06mm 팁, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 가위, 8 cm, 45°; 각도, 표준</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS 주사기 필터 장치, 0.22 &마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>도립 실험실 현미경&nbsp; 라이카 DM IL LED</td><td>&nbsp; 라이카&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier 및 비여과 피펫 팁</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 높은 편광된 다기능 상피가 이다. Hexagonally 포장 및 단단한 접속점에 의해 연결 된 색소 세포의 단일 시트입니다. RPE의 주요 기능은 시각적 사이클에 빛, 창 고 포토 리셉터 외부 세그먼트의 식 균 작용, 이온의 공간 버퍼링, 영양분, 이온 물 뿐만 아니라 적극적인 참여의 전송의 흡수를 포함 합니다. 이러한 중요 하 고 다양 한 기능, RPE 세포의 생물학 연구에 매우 중요입니다. RPE 세포 선의 수 설립 되었습니다; 그러나, passaged와 불멸 하 게 세포는 신속 하 게 일부를 잃고 자연 RPE 세포의 형태학 적 및 생리 적 특성의 알려져 있습니다. 따라서 1 차 셀은 RPE 세포 생물학 및 기능의 다양 한 측면을 공부 하는 데 더 적합. 그러나 마우스 기본 RPE 세포 배양 연구원에 게 유용 이후 마우스 모델 생물학 연구에서 널리 이용 된다, 마우스에서 세포 수집 RPE는 또한 그들의 작은 크기 때문에 매우 도전. 여기, 선물이 enucleation 및 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리를 포함 하는 기본 마우스 RPE 세포 배양을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 메서드는 효율적인 셀 복구를 수 있습니다. 두 쥐에서 얻은 RPE 세포 문화와 디스플레이 일부 선의의 RPE의 원래 속성의 6 각형 모양 및 2 후 착 색 등 세포의 1 주 후 문화 접시에 사전 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 confluency를 도달할 수 있다 문화의 주.

마우스 기본 RPE 문화권 문화에 1 주 후 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 도달 90-95 %confluency 2 쥐에서 설립. 2 주 후 문화, 셀 100 %confluency 도달 하 고 6 각형, 안료, 및 이중 nucleated 세포의 모자이크를 형성 하기 시작 했다. 문화, 모양 및 착 색, 형성 하기 위하여 계속 하는 세포의 3 주, 4 주 후 셀의 일부 있어 hyperpigmented (그림 2).
기본 RPE 세포 배양의 순도 immunostaining RPE65 항 체 (retinoid isomerohydrolase, 11-시스-retinol 동안 모든-트랜스-아이리스 에스테 르의 변환할 수 있도록 척추 시각적 주기에서 중요 한 효소를 사용 하 여 평가할 수 있습니다. phototr...

망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 세포를 얻고 원래의 특성을 유지하면서 체외에서 배양할 수 있는 실현 가능한 방법을 입증하는 것입니다. 이 방법은 RPE 연구자가 마우스 RPE 세포 배양을 확립하는 데 필요한 해부 기술을 습득하고 이를 수행하는 방법을 쉽게 시연하는 데 도움이 됩니다. 이 절차의 주요 장점은 간단하고 실현 가능하다는 것입니다.필요한 것은 연습뿐이며, RPE 분리 및 현미경 검사의 시각적 시연은 말 그대로 필요한 기술을 습득하는 방법을 보여줍니다. 쥐 안구를 분리하려면 먼저 승인된 방법을 사용하여 두 마리의 쥐를 안락사시키고 장갑을 낀 후 흡수 패드에 놓습니다. 엄지와 검지를 눈 주위에 대고 피부를 부드럽게 밀어 안구가 부풀어 오르도록 합니다.안구가 튀어나오면 각진 가위의 끝을 피부와 안구 사이에 끼우고 눈 주위 조직이 풀릴 때까지 조심스럽게 자릅니다. 그런 다음 분리된 눈을 70% 에탄올에 잠시 담그고 페트리 접시의 PBS에 담그십시오. 각 마우스에서 두 눈을 채취한 후 해부를 진행합니다.해부 현미경으로 눈 주위의 결합 조직 대부분을 조심스럽게 제거합니다. 이 단계에서 눈을 물에 담그고 있을 필요는 없습니다. 이렇게 하려면 봉합 집게를 사용하여 안구에서 결합 조직을 들어 올리고 Vannas 가위를 사용하여 잘라냅니다.공막이 절단되면 온전한 후방 안구 컵을 얻는 것이 실질적으로 불가능하므로 공막을 절단하지 마십시오. 결합 조직을 청소한 후 안구를 PBS에 담그고 멸균 상태에서 층류 캐비닛에서 작업하도록 전환합니다. 이제 집게를 사용하여 고농도의 포도당이 들어 있는 따뜻한 DMEM 접시에 눈을 옮깁니다.20-30초 후 두 번째 세척을 위해 흡인을 사용하여 세척 용액을 교체하십시오. 15mL 튜브에 담긴 2%Dispase II 작업 용액을 가열한 안구로 옮기고 눈을 섭씨 37도에서 45분 동안 배양하여 해리시킵니다. 배양 후에는 안구가 부드러워야 합니다.다음으로, 따뜻한 성장 배지로 같은 용기에서 눈을 두 번 씻습니다. 두 번째 세척 후 성장 배지를 새 배지로 교체하고 안구와 배지를 새 접시에 옮겨 해부를 계속합니다. 해부 현미경의 도움으로 깨끗한 벤치에서 계속 작업하십시오.집게로 눈을 고정하여 해부를 시작하고 Vannas 가위를 사용하여 ora serrata 주위를 절개합니다. 안구를 용액에 고정하고 오라 세라타 둘레 주위로 절단면을 확장하여 전방 각막을 조심스럽게 제거합니다. 절단이 끝나면 앞쪽 각막을 당겨냅니다.다음으로, 톱니가 있는 집게를 사용하여 눈컵에서 부드럽게 당겨 렌즈 캡슐 및 관련 홍채 색소 상피를 제거합니다. 그런 다음 나머지 눈에 대한 해부를 반복하고 섭씨 37도에서 20분 동안 성장 배지에서 후방 안구컵을 배양하여 RPE에서 신경 망막을 쉽게 분리할 수 있도록 합니다. 20분 후, 뒤쪽 눈컵을 4개의 꽃잎으로 자릅니다.아이컵이 평평해질 만큼 길게 자르되 꽃잎이 계속 연결될 수 있을 만큼 짧게 자릅니다. 다음으로 아이컵을 평평하게 펴서 신경 망막을 제거합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 나머지 RPE 맥락막 공막 복합체를 고정하고 가장자리에서 망막을 매우 부드럽게 잡아당깁니다.신경 망막이 제거되면 4등분된 RPE 맥락막 공막 복합체를 따뜻한 성장 배지로 채워진 새로운 멸균 배양 접시로 옮깁니다. 페트리 접시에 4등분된 RPE 맥락막 공막 복합체의 꽃잎 하나를 초미세 집게로 고정하고 미세 수술용 초승달 칼을 사용하여 아래에 있는 기저막에서 손상되지 않은 RPE 시트를 부드럽게 벗겨냅니다. 갈색을 띤 RPE는 어둡고 끈적거리며 푹신푹신한 맥락막과 명확하게 구별할 수 있어야 합니다.그런 다음 p200 마이크로피펫 팁을 성장 배지에 적시고 팁을 사용하여 RPE 시트를 예열된 성장 배지가 들어 있는 새 접시에 옮깁니다. 이제 가온 성장 배지에서 RPE 시트를 세 번 세척합니다. 각 세척 단계 후에는 망막이나 맥락막의 파편과 같은 다른 조직을 피하면서 RPE 시트를 조심스럽게 수집합니다.마지막 세척 후 RPE 시트를 1.5mL 튜브로 옮기고 중력에 의해 침전되도록 합니다. 그런 다음 층류 캐비닛에서 여분의 성장 배지를 제거하고 갓 만든 따뜻한 성장 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 이제 거품을 만들지 않고 p200 마이크로피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 분쇄합니다.40회에서 50회 사이로 단일 세포 현탁액을 만들 수 있을 만큼만 분쇄합니다. 너무 많은 트리투레이션은 치명적일 수 있으므로 주의하십시오. 이제 두 마우스에서 채취한 RPE 세포를 12mL 폴리에스테르 멤브레인 인서트 하나에 12웰 배양 플레이트의 웰에 플레이트합니다.RPE 세포가 육각형 모양과 색소를 유지할 수 있도록 높은 세포 밀도가 필요합니다. 12mm 폴리에스테르 멤브레인 인서트에서 두 마리의 마우스에서 확립된 마우스 1차 RPE 배양은 배양 1주일 후 90-95%의 포화도에 도달했습니다. 배양 2주 후, 세포는 100% 융합되었고 육각형 색소 세포와 이중 핵 세포의 모자이크를 형성하기 시작했습니다.3주 차가 되자 세포의 모양과 색소 침착이 계속 변했습니다. 그러나 4주가 지나자 세포의 일부가 과색소 침착이 되었습니다. 1차 RPE 세포 배양의 순도는 척추동물의 시각 주기에 중요한 효소인 레티노이드 이소메로가수분해효소(retinoid isomerohydrolase)를 표지하는 RPE65 항체를 사용하여 평가되었습니다.세포 접합부 및 육각형 세포 모양에 대한 세포의 무결성은 팔로이딘(phalloidin)으로 염색하여 입증되었습니다. 밀접 연접은 ZO-1 단백질 발현 분석을 통해 시각화되었으며, 이는 아미노 염색을 사용하여 시각화하고 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 검증할 수 있었습니다. 전반적으로 배양물은 증식하고 색소 침착 및 육각형 모양을 유지하면서 긴밀한 접합을 형성하고 RPE65와 같은 기능적 마커를 발현할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 쥐의 눈에서 RPE 세포를 분리하고 체외에서 적절하게 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 눈을 적시고 가능한 한 빨리 수술하도록 노력하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

팔일 세 마우스의 신경 망막은 4 % 젤라틴 블록의 상단에있다. 에 vibratome에 의한 광 수용체 층 (200 μm의)의 분리 후, 광 수용체는 문화 기계 및 효소 분해 후 씨앗을 품고있다. 감광체 층은 분자량, 생화학 적 분석 또는 이식에 사용될 수있다.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

프로토콜은 혈청과 항생제가 없는 R16 정의 배지에서 망막 색소 상피 (RPE)와 함께 재배 된 마우스 신경망막의조직화 각질을 설명합니다. 이 방법은 생체 내 실험과 비교할 때 비교적 간단하고, 비용이 적게 들고, 시간이 많이 소요되며, 수많은 실험 응용 프로그램에 적응할 수 있다.

통가 경사진 마우스 망막의 장기, 세럼 없는 재배는 그대로 망막 색소 상피와 함께 익스처스

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

여기서, 시험 관 내에서 일차 돼지 망막 색소 상피세포를 배양하는 방법을 제시한다.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

우리는 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포의 세포를 분리하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 절차를 통해 유전자 발현 분석을 포함하여 분리된 RPE에 대한 후속 분자 생물학 연구가 가능합니다.

기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리

이 프로토콜은 국소에서 공급된 돼지 눈에서 원발성 망막 색소 상피(RPE) 세포를 얻고 배양하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 세포는 줄기 세포의 고품질 대안 역할을 하며 체외 망막 연구에 적합합니다.

In vitro 모델링을 위한 Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells의 분리

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

학습하세요 마우스 망막 안료 상피 세포 분리 및 1차 배양 방법을. Dispase II 소화와 현미경 하 절제술을 활용하여 세포의 원래 특성을 유지하면서 신경망막 연구에 필수적인 기술을 습득할 수 있습니다.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

더 많은 동영상 탐색