마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 세포를 얻고 원래의 특성을 유지하면서 체외에서 배양할 수 있는 실현 가능한 방법을 입증하는 것입니다. 이 방법은 RPE 연구자가 마우스 RPE 세포 배양을 확립하는 데 필요한 해부 기술을 습득하고 이를 수행하는 방법을 쉽게 시연하는 데 도움이 됩니다. 이 절차의 주요 장점은 간단하고 실현 가능하다는 것입니다.

필요한 것은 연습뿐이며, RPE 분리 및 현미경 검사의 시각적 시연은 말 그대로 필요한 기술을 습득하는 방법을 보여줍니다. 쥐 안구를 분리하려면 먼저 승인된 방법을 사용하여 두 마리의 쥐를 안락사시키고 장갑을 낀 후 흡수 패드에 놓습니다. 엄지와 검지를 눈 주위에 대고 피부를 부드럽게 밀어 안구가 부풀어 오르도록 합니다.

안구가 튀어나오면 각진 가위의 끝을 피부와 안구 사이에 끼우고 눈 주위 조직이 풀릴 때까지 조심스럽게 자릅니다. 그런 다음 분리된 눈을 70% 에탄올에 잠시 담그고 페트리 접시의 PBS에 담그십시오. 각 마우스에서 두 눈을 채취한 후 해부를 진행합니다.

해부 현미경으로 눈 주위의 결합 조직 대부분을 조심스럽게 제거합니다. 이 단계에서 눈을 물에 담그고 있을 필요는 없습니다. 이렇게 하려면 봉합 집게를 사용하여 안구에서 결합 조직을 들어 올리고 Vannas 가위를 사용하여 잘라냅니다.

공막이 절단되면 온전한 후방 안구 컵을 얻는 것이 실질적으로 불가능하므로 공막을 절단하지 마십시오. 결합 조직을 청소한 후 안구를 PBS에 담그고 멸균 상태에서 층류 캐비닛에서 작업하도록 전환합니다. 이제 집게를 사용하여 고농도의 포도당이 들어 있는 따뜻한 DMEM 접시에 눈을 옮깁니다.

20-30초 후 두 번째 세척을 위해 흡인을 사용하여 세척 용액을 교체하십시오. 15mL 튜브에 담긴 2%Dispase II 작업 용액을 가열한 안구로 옮기고 눈을 섭씨 37도에서 45분 동안 배양하여 해리시킵니다. 배양 후에는 안구가 부드러워야 합니다.

다음으로, 따뜻한 성장 배지로 같은 용기에서 눈을 두 번 씻습니다. 두 번째 세척 후 성장 배지를 새 배지로 교체하고 안구와 배지를 새 접시에 옮겨 해부를 계속합니다. 해부 현미경의 도움으로 깨끗한 벤치에서 계속 작업하십시오.

집게로 눈을 고정하여 해부를 시작하고 Vannas 가위를 사용하여 ora serrata 주위를 절개합니다. 안구를 용액에 고정하고 오라 세라타 둘레 주위로 절단면을 확장하여 전방 각막을 조심스럽게 제거합니다. 절단이 끝나면 앞쪽 각막을 당겨냅니다.

다음으로, 톱니가 있는 집게를 사용하여 눈컵에서 부드럽게 당겨 렌즈 캡슐 및 관련 홍채 색소 상피를 제거합니다. 그런 다음 나머지 눈에 대한 해부를 반복하고 섭씨 37도에서 20분 동안 성장 배지에서 후방 안구컵을 배양하여 RPE에서 신경 망막을 쉽게 분리할 수 있도록 합니다. 20분 후, 뒤쪽 눈컵을 4개의 꽃잎으로 자릅니다.

아이컵이 평평해질 만큼 길게 자르되 꽃잎이 계속 연결될 수 있을 만큼 짧게 자릅니다. 다음으로 아이컵을 평평하게 펴서 신경 망막을 제거합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 나머지 RPE 맥락막 공막 복합체를 고정하고 가장자리에서 망막을 매우 부드럽게 잡아당깁니다.

신경 망막이 제거되면 4등분된 RPE 맥락막 공막 복합체를 따뜻한 성장 배지로 채워진 새로운 멸균 배양 접시로 옮깁니다. 페트리 접시에 4등분된 RPE 맥락막 공막 복합체의 꽃잎 하나를 초미세 집게로 고정하고 미세 수술용 초승달 칼을 사용하여 아래에 있는 기저막에서 손상되지 않은 RPE 시트를 부드럽게 벗겨냅니다. 갈색을 띤 RPE는 어둡고 끈적거리며 푹신푹신한 맥락막과 명확하게 구별할 수 있어야 합니다.

그런 다음 p200 마이크로피펫 팁을 성장 배지에 적시고 팁을 사용하여 RPE 시트를 예열된 성장 배지가 들어 있는 새 접시에 옮깁니다. 이제 가온 성장 배지에서 RPE 시트를 세 번 세척합니다. 각 세척 단계 후에는 망막이나 맥락막의 파편과 같은 다른 조직을 피하면서 RPE 시트를 조심스럽게 수집합니다.

마지막 세척 후 RPE 시트를 1.5mL 튜브로 옮기고 중력에 의해 침전되도록 합니다. 그런 다음 층류 캐비닛에서 여분의 성장 배지를 제거하고 갓 만든 따뜻한 성장 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 이제 거품을 만들지 않고 p200 마이크로피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 분쇄합니다.

40회에서 50회 사이로 단일 세포 현탁액을 만들 수 있을 만큼만 분쇄합니다. 너무 많은 트리투레이션은 치명적일 수 있으므로 주의하십시오. 이제 두 마우스에서 채취한 RPE 세포를 12mL 폴리에스테르 멤브레인 인서트 하나에 12웰 배양 플레이트의 웰에 플레이트합니다.

RPE 세포가 육각형 모양과 색소를 유지할 수 있도록 높은 세포 밀도가 필요합니다. 12mm 폴리에스테르 멤브레인 인서트에서 두 마리의 마우스에서 확립된 마우스 1차 RPE 배양은 배양 1주일 후 90-95%의 포화도에 도달했습니다. 배양 2주 후, 세포는 100% 융합되었고 육각형 색소 세포와 이중 핵 세포의 모자이크를 형성하기 시작했습니다.

3주 차가 되자 세포의 모양과 색소 침착이 계속 변했습니다. 그러나 4주가 지나자 세포의 일부가 과색소 침착이 되었습니다. 1차 RPE 세포 배양의 순도는 척추동물의 시각 주기에 중요한 효소인 레티노이드 이소메로가수분해효소(retinoid isomerohydrolase)를 표지하는 RPE65 항체를 사용하여 평가되었습니다.

세포 접합부 및 육각형 세포 모양에 대한 세포의 무결성은 팔로이딘(phalloidin)으로 염색하여 입증되었습니다. 밀접 연접은 ZO-1 단백질 발현 분석을 통해 시각화되었으며, 이는 아미노 염색을 사용하여 시각화하고 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 검증할 수 있었습니다. 전반적으로 배양물은 증식하고 색소 침착 및 육각형 모양을 유지하면서 긴밀한 접합을 형성하고 RPE65와 같은 기능적 마커를 발현할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 쥐의 눈에서 RPE 세포를 분리하고 체외에서 적절하게 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 눈을 적시고 가능한 한 빨리 수술하도록 노력하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.