세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

이 절차의 전반적인 목표는 근이영양증 환자 세포에서 원형질막 복구 가능성을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 주어진 돌연변이와 막 재밀봉 역학 사이의 관계와 같은 근이영양증의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 멤브레인 재밀봉 역학을 실시간으로 정량화할 수 있다는 것입니다.

먼저 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 40ml의 성장 배지가 포함된 T225 플라스크에서 섬유아세포 세포를 배양합니다. 배양액이 70-80% 농도에 도달하면 세척당 40ml의 PBS로 세포를 두 번 헹구고 섭씨 37도에서 5분 동안 0.05%트립신 5ml를 첨가합니다. 세포가 분리될 때, 신선한 성장 매체의 40 밀리리터를 가진 반응을 멈추고 37 섭씨 온도와 5%carbon 에 밤새 배양을 위한 35 밀리미터 교원질 입히는 유리 바닥 판으로 100, 밀리리터 당 000 세포 농도로 세포의 2 밀리리터를 씨를 뿌린다.

transfection 배양당 1개의 1.5ml 튜브에 150마이크로리터의 신선한 혈청이 결핍된 배지를 추가합니다. 다음으로, 각 튜브에 3마이크로리터의 transfection 시약을 첨가하고 실온에서 최소 5분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브가 배양되는 동안 플레이트당 1.5ml 튜브에 175마이크로리터의 혈청 유래 배지와 3.5마이크로그램의 디스펄린 플라스미드 DNA를 추가합니다.

그런 다음 150 μl의 plasmid DNA solution과 150 microlit의 transfection 시약을 플레이트당 하나의 새 tube에 결합하여 실온에서 20분 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 성장 배지를 2ml의 혈청 유래 배지로 교체합니다. 배양이 끝나면 300마이크로리터의 플라스미드 용액 전체를 각 플레이트에 고르게 분배하고 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

다음 날, 플라스미드 상등액을 신선한 성장 배지로 교체하고 플레이트를 다시 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이광자 상처 분석을 위해 세포를 준비하려면 형질 주입된 배양액을 1ml의 Tyrode 용액으로 한 번 헹굽니다. 그런 다음 1ml의 신선한 Tyrode 용액에 1마이크로리터의 2.5mmolar FM4-64 염료를 첨가합니다.

다음으로, 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 현미경 소프트웨어에서 0.2 x 2 미크론 타겟을 생성하고 타겟을 세포막의 가장자리에 배치하여 타겟 라인이 겹치고 세포막에 수직이 되도록 합니다. FM 염료 신호를 여기시키려면 543나노미터 헬륨 네온 레이저를 선택하고, GFP 신호를 여기시키려면 488나노미터 아르곤 레이저를 선택하고, 감지 범위를 각각 600-760나노미터와 500-550나노미터로 설정합니다. 그런 다음 순차적 이미지 스캔의 5분 시계열을 만듭니다.

막 병변을 생성하려면 2광자 레이저를 사용하여 15% 레이저 출력에서 820나노미터까지 10회 반복하여 시계열 시작 후 25초 후에 세포를 표백합니다. FM4-64 염료 형광을 정량화하려면 소프트웨어를 사용하여 6 x 6 미크론의 관심 영역을 그리고 관심 영역을 세포 내 상처 위치에 인접하게 배치합니다. 그런 다음 배경 값을 빼고 순 증가를 시간 0에서의 형광 값으로 나누어 각 시점에 대한 상대 형광 값을 계산합니다.

건강한 인간 섬유아세포 세포는 레이저 상처 후 낮은 수준의 FM4-64 형광 활성화를 나타내는 반면, 치료되지 않은 환자 섬유아세포는 손상 후 높은 수준의 상대 형광 강도를 나타냅니다. 전장 디스펄린 플라스미드로 transfection된 환자 세포는 치료하지 않은 환자 대조군에 비해 상대적 FM4-64 형광 강도가 감소했지만 건강한 대조군에서 관찰된 형광 값과는 유사합니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포가 완충 용액에서 천천히 죽을 것임을 기억하는 것이 중요하므로 신속하게 작업하고 일정한 간격으로 새로운 세포로 변화

이 동영상을 시청한 후에는 이광자 현미경을 사용하여 막 병변을 재생하는 방법과 실시간으로 멤브레인 재밀봉을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.