Name: 세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 배우세요 근육병 환자 세포의 세포막 복구 능력을 2광자 레이저 현미경으로 실시간 정량화하는 방법을. 이 기술은 살아있는 세포에서 막 재봉합 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 의학 및 치과,이 친구의 개렛 Cumming 연구의 자 기금, HM Toupin 신경 과학 연구의 자 기금, 근 위축 증 캐나다, 캐나다 재단의 앨버타의 대학 교수진에 의해 혁신 (CFI) 지원 되었다 앨버타 고급 교육 및 기술 (AET), 건강 연구 (CIHR), 제시의 여행-유전자 및 세포 치료, 여성 및 아동 건강 연구소 (WCHRI)에 대 한 재단의 캐나다 학회 및 앨버타 혁신적인 건강 솔루션 (AIHS ).
우리는 박사 스티븐 발 전체 길이 dysferlin 플라스 미드와 함께 우리를 공급 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 기술 조언을 박사 가쓰야 미 야 케를 감사 하 고 싶습니다.

이 연구에 사용 된 인간 섬유 아 세포 세포는의 학부와 앨버타의 대학에 치과의 인간의 윤리 위원회에서 승인 된 사용 되었다.
1. 전체 길이 DYSF 플라스 미드를 가진 세포의 transfection
<ol>
	<li>문화 fibroblast 세포 성장 미디어-36 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS)의 4 mL와 20 µ L의 페니실린/스 (P/S)-37 ° c.에 CO2 배양 기에서의 40 mL를 포함 하는 T225 플라스 크에 참고: 셀 약 70-80 %confluency 경작 해야 하 고 완전히 confluent 될 수 없다는.</li>
	<li>시드 셀 준비, 40 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 셀을 두 번, 린스 다음 셀을 분리를 0.05 %trypsin 5 mL을 추가 합니다. 2 보육 37 ° c 공동 셀을 반환 하 고 5 분에 대 한 셀을 품 어.<ol>
		<li>셀은 완벽 하 게 분리, 성장 미디어 트립 신 반응을 중지를 40 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀 또는 다른 세포 장치를 계산 계산 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>씨앗 1 x 105 셀/mL에서 세포의 2 mL 35mm 콜라겐 코팅 유리 하단 요리도. 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어 참고: 셀 이어야 한다 약 50-60% 합칠 다음날.</li>
	<li>성장 매체를 제거 하 고 혈 청을 박탈 미디어 (FBS 없이 성장 매체)의 2 mL와 함께 그것을 대체.</li>
	<li>Lipotransfection를 사용 하 여 전체 길이 dysferlin 플라스 미드와 셀 transfect.<ol>
		<li>1.5 mL 튜브 (페 수를 각 요리에 대 한 1 개의 관)에서 혈 청을 박탈 미디어의 150 µ L를 준비 합니다.</li>
		<li>혈 청을 박탈 미디어를 포함 하는 각 1.5 mL 튜브에 transfection 시 약의 3 µ L를 추가 합니다. 그것은 실내 온도에 적어도 5 분 품 어.</li>
		<li>별도 1.5 mL 튜브에 175 µ L의 혈 청을 박탈 미디어와 플라스 미드 DNA의 3.5 µ g을 추가 합니다. 참고: 각 추가 요리 페 수를 위의 금액을 곱하면 됩니다.</li>
		<li>플라스 미드 DNA의 혈 청을 박탈 미디어와 transfection 시 약 150 µ L 튜브에 들어 있는 미디어의 150 µ L를 결합 한다. 실 온에서 20 분 동안 그것을 품 어.</li>
		<li>균등 하 게 플라스 미드 및 transfection 시 미디어의 300 µ L 분산 접시. 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 24 시간을 위한 요리를 품 어</li>
	</ol>
	</li>
	<li>혈 청을 포함 하는 신선한 성장 매체와 미디어를 교체 하 고 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 추가 24 h에 대 한 그것을 품 어</li>
</ol>
2. 셀 2 광자 부상 분석 결과 대 한 준비
<ol>
	<li>미디어 pipetting 및 Tyrode의 솔루션의 1 mL와 함께 한 번 셀 린스 다음 신선한 Tyrode 솔루션 포함 된 2.5 m m FM 1 µ L의 1 mL을 추가 4-64 염료. 참고: FM 4-64 염료의 최종 농도 2.5.</li>
	<li>칼슘 고갈 환경에서 막 수리의 평가, 필요한 경우 1 mL의 PBS로 세포를 씻어 하 고 1mm EGTA를 포함 하는 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 참고: PBS 시간이 지남에 따라 분리 하는 세포를 일으킬 것입니다, 부상 분석 결과 가능한 한 빨리 완료 한다.</li>
</ol>
3. 2-광자 레이저 부상 분석 결과
<ol>
	<li>거꾸로 confocal 현미경 및 관련된 프로그램 소프트웨어를 사용 하, 0.2 µ m x 2 µ m 대상 생성 하 고 대상 줄 중복 하 고 세포 막 (그림 2)의 방향에 수직인 거짓말 세포 막의 가장자리에 놓습니다.</li>
	<li>543 nm HeNe 레이저를 사용 하 여 FM 염료 신호를 자극 하 고 600-760 nm에 대 한 검색 범위를 설정. 488 nm의 아르곤 레이저를 사용 하 여 GFP 신호 (그림 4)을 자극 하 고 500-550 nm에 대 한 검색 범위를 설정.<ol>
		<li>만들기 5 분 시간 일련의 연속 이미지 검사, 세포 이미징 모든 5 s.</li>
		<li>생성 하려면 막 병 변, 820-nm, 15%를 사용 하 여 설정 2 광자 레이저를 사용 하 여 표 백제 셀 레이저 10 반복 출력 하 고 시계열의 시작 후 셀 25 s 표 백제.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>척도 FM 4-64 염료 형광, 관심 (ROI) 6 µ m x 6 µ m 영역을 그리는 부상 위치 및 셀 (그림 3) 내 인접 배치 하는 소프트웨어를 사용 합니다. 참고:이 응용 프로그램에서 소프트웨어-"범위 표시기" 기능을 사용 하 여 샘플링 영역 픽셀 oversaturation의 방지, 빨강 픽셀 포화 픽셀을 나타냅니다. 통계 분석에 대 한 전자 스프레드 시트에 원시 형광 값을 내보냅니다.</li>
	<li>배경 값 (막 부상 이전 timepoints의 평균 형광 값)을 빼서 각 시간 지점에 대 한 상대적인 형광 값을 계산 하 고 t 값 형광으로 순 증가 나누는 = 0 (그림 5, 6) .</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

세포 막의 2 광자 레이저 부상 resealing 에 체 외막의 역학을 평가 하기 위한 정확 하 고 다양 한 기술입니다. 이 문서에서는, 우리 세포 막 resealing 분석 결과 부상 2 광자 레이저를 사용 하 여 dysferlinopathy 환자 세포 능력을 결정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 결과 보여 dysferlinopathy 환자 세포는 세포 막 resealing, 결함이 있는 다른 연구자에 의해 연구 결과와 일치 하는 있는 추가 근육 사이의 역학 resealing 세포 막에 눈에 띄는 유사성을 강조 하 고 비 근육 세포 유형3,11,,1522. 우리는 또한 관찰 전체 길이 dysferlin 시퀀스를 포함 하는 플라스 미드와 페 환자 세포 표현 형, reseali...

더블-레이어 인지질 단백질에 박 혀의 셀의 내부/세포 외 환경 정의 하 고 세포질 항상성 및 세포 생존을 유지 하기 위한 필수적 이다 진 핵 세포의 세포 막에 의하여 이루어져 있다. 세포 막 상해 기계적 또는 화학 모욕에서 발생 하는 다양 한 포유류 세포 유형에서 평범, 등 골격과 심장 근육, 위, 및 폐 세포1,2,,34. 매일 생리 기능에 따른 부상, 뿐만 아니라 세포 막도 환경 모욕, 세균 독 소, 그리고 허 혈 성 reperfusion5에 의해 손상 될 수 있습니다. 세포 막에 있는 파열을 봉인에 실패 리드의 extracellular 캘리포니아2 +-다른 잠재적으로 유독한 세포 외 구성 요소-함께 관계가 없는 유입에 셀에 셀에 신속 하 게 발생할 수 있습니다 다운스트림 신호 폭포를 트리거링 죽음1,4,,56.
날짜 하려면, 셀에 막 복구에 대 한 몇 가지 제안 된 모델 되었습니다. 다른 복구 메커니즘은 막 파열의 자연과 크기에 따라 활성화 될 수 있습니다. 예, 그것은 측면 흐름 또는 작은 중단 복구 막는 단백질 세포 막 사용할 수 제안 (&#60; 1 nm). 측면 퓨전 모델 제안 막 파열 포함 하는 dysferlin의 측면 모집을 통해 급속 하 게 고치는 막7, 모델을 막는 단백질 단백질 집계를 통해 작은 구멍 고치는 제안 하는 동안 (주로 annexins) 8. 반대로, 큰 막 병 변을 일으킬 캘리포니아2 +-의존, dysferlin 중재 소포 융해 및 수리 패치의 형성. 수리 패치 모델에서 셀으로 빠른 Ca2 + 유입 트리거 복잡 한 또는 "패치", 융합 함께 세포내 vesicles의 형성 하는 여러 단백질 (dysferlin, annexins, mitsugumin-53, 및 EDH 단백질)의 채용 또는 막의 사이트에서 리소좀 손상4,,910,,1112. 그것은이 모델 반드시 상호 배타적이 고 막 수리를 촉진 하기 위하여 연주회에서 작동 수 있습니다 해야 합니다. 세포 막 손상 제대로 봉인에 실패는 근이 영양 증 (dysferlinopathy-미요시 myopathy, 등 다리 띠 근이 영양 증 유형 IIB, 전방 tibial 발병 원심 myopathy)를 포함 하 여 여러 질병 상태와 관련 13,14, 심근 그리고 Chediak-히가시 증후군 (CHS)15.
그 적절 한 세포 막의 무결성 및 놀이 resealing 건강과 질병에 중요 한 역할 세포 막 복구의 기본 분자 메커니즘에 대 한 깊은 이해 것에 도움이 될 새로운 치료 전략에 대 한 검색. 그것은, 그러므로, 활동을 모니터링 하 고 세포 막 수리 능력 평가를 적절 한 실험 기법을 보유 하는 데 필요한입니다. 막 복구를 모델링 하기 위한 여러 가지 생체 외에서 방법은 설계 되었습니다. 한 전략 셀 된다고 피 펫/외과 블레이드/면도기를 사용 하거나 셀16유리 구슬 롤링을 통해 촉진 될 수 있는 기계적 상해를 포함 한다. 그러나, 기계적 상해의이 유형은 더 큰 병 변, 생성 하 고 셀 부상, 내와 문화 사이에서 변이의 고차를 만듭니다.
막 상처를 생성 하는 또 다른 방법은 두 광자 현미경 검사 법에 의해 레이저 절제입니다. 전통적인 레이저 confocal 현미경 검사 법 단일 광자 여기를 고용 하 고, 달리 2 광자 레이저는 동시에 고 에너지 전자17의 흥분을 촉진 하기 위하여 두 긴 파장, 저 에너지 광자를 사용 합니다. 이 아닌-선형 프로세스 여기 초점 평면 내에서 독점적으로 그리고 전체 빛 경로17 (그림 1) 따라 하지 발생합니다. 이 때 라이브 셀18,19이미징 photodamage를 최소화 하기 위해 여기 볼륨 수 감소. 연구원은 따라서 정확한 병 변 세포 막 및 모니터 막 resealing 실시간으로 세포 막 파열 그리고 reseals로 형광 강도 변화를 관찰 하 고 형광 염료를 사용 하 여 생성할 수 있습니다.
이 이렇게는 반복적으로 막 부상 생체 외에서 그리고 vivo에서 공부 하는 데 사용 되었습니다 그리고 여러 셀에20,21종류. 예를 들어 막 섬유 아 세포 및 환자가 기술을22,23을 사용 하 여 평가 했다 dysferlinopathy에서 파생 된 myotubes 결함을 복구 합니다. 또한, 마우스에서 분리 한 근육 섬유 수리 패치 형성13,,2425를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 붙일 태그가 단백질의 움직임 또한 단일 근육 섬유9막 수리 하는 동안 관찰할 수 있습니다. 또한, sarcolemmal 수리 2 광자 레이저 zebrafish 태아에 부상 다음 과정 실시간 vivo에서26에 관찰할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는이 방법론은 원형질 막 resealing 능력 측정을 위해 다양 한 셀 형식에 적용 될 수 있지만 두 광자 레이저 부상를 사용 하 여 섬유 아 세포의 세포 막 수리 역학을 평가 하기 위한 방법론 개요 생체 외에서. 이 방법에서는, 세포는 인 큐베이 팅 FM4-64, 신속 하 게 그것을 부정적으로 결속으로 fluoresces 닥터지, 셀 스며들 지 않는 염료 충전 막 병 변 통해 셀 입력 시 세포질 내에서 인지질 (그림 2&#38; 3). 염료 형광 막 병 변에 인접 한의 정량화 세포 막 자체를 봉인 하는 데 걸리는 시간을 모니터링 하기 위한 수 있습니다. 이 방법의 유틸리티를 예증 하 사용 dysferlinopathy 환자 fibroblasts GFP 활용 전체 길이 dysferlin (DYSF) 플라스 미드와 페 세포 막 복구의 구조를 평가 합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm 콜라겐 코팅 유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>혈청 결핍 배지</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Dye</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode ' s Salts Solution</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td>, <td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr>, <tr><td>카멜레온 이광자 레이저</td>, <td>Coherent</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

수많은 pathophysiological 모욕 세포 막에 손상을 줄 수 있다 그리고, 세포 막 복구 또는 무결성, 타고 난 결점과 결합 될 때 질병 귀 착될 수 있다. 세포 막 복구를 둘러싼 근본적인 분자 메커니즘 이해은, 그러므로, 세포 막 기능 장애 역학과 관련 된 질병에 대 한 새로운 치료 전략의 개발에 중요 한 목표. 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 이해 하는 다양 한 질병 상황에서 세포 막 resealing 겨냥 실험적 치료를 수행 하는 기능 결과 결정 하기 위한 표준으로 2 광자 레이저 절제를 사용 합니다. 이 분석 결과, 세포 막 세포 막 파열 및 형광 염료는 세포에 침투 하면 2 광자 레이저로 부상 대상이 됩니다. 셀 내에 형광의 강도 다음 자체를 봉인 하는 셀의 능력 척도를 모니터링할 수 있습니다. 세포 막 응답 부상, 뿐만 아니라 접근 자체를 부상 2 광자 레이저에 큰 변화를 평가 하기 위한 여러 다른 방법이 있다, 그러므로, 셀 부상의 통합 모델 것 군인이 감소 하는 이러한 방법론 사이 변화. 이 문서에서는, 우리는 간단한 2 광자 레이저 부상 세포 막 수리에서 생체 외에서 둘 다 건강에 고 dysferlinopathy 환자 fibroblast 세포 페 전체 길이 dysferlin 플라스 미드의 유무에 관계 없이 평가 하기 위한 프로토콜 개요.

건강 한 인간의 섬유 아 세포, 비 치료 dysferlinopathy 환자의 섬유 아 세포 및 환자 fibroblasts 전체 길이 dysferlin 시퀀스 2 광자 레이저 부상 능력 resealing 막 평가 대상이 됐다을 포함 하는 플라스 미드와 페 진짜 시간에서. 건강 한 인간의 fibroblast 세포 표시 레이저 부상 다음 FM 4-64 형광 활성화의 낮은 수준 및 비 치료 환자 fibroblasts 전시 상대 형광 강도 상해 다음의 높은 수준의 (그림 5&amp; 6 ). 전체 길이 dysferlin 플라스 미드와 페 했다 환자 셀 보여 감소 상대적인 FM 4-64 형광 강도 비 치료 환자 컨트롤에 비해 건강 한 컨트롤 (그림에서 형광 값 비교 했다 5&amp; 6).
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두 광자 레이저를 통해 세포 막 부상 막 resealing 능력을 평가 하기 위한 널리 사용 되는 방법 이며, 여러 개의 셀 형식에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리가 시험관에서 라이브 이미징 막 resealing dysferlinopathy 환자 셀 다음 2 광자 레이저 절제에에서의 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

이 절차의 전반적인 목표는 근이영양증 환자 세포에서 원형질막 복구 가능성을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 주어진 돌연변이와 막 재밀봉 역학 사이의 관계와 같은 근이영양증의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 멤브레인 재밀봉 역학을 실시간으로 정량화할 수 있다는 것입니다.먼저 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 40ml의 성장 배지가 포함된 T225 플라스크에서 섬유아세포 세포를 배양합니다. 배양액이 70-80% 농도에 도달하면 세척당 40ml의 PBS로 세포를 두 번 헹구고 섭씨 37도에서 5분 동안 0.05%트립신 5ml를 첨가합니다. 세포가 분리될 때, 신선한 성장 매체의 40 밀리리터를 가진 반응을 멈추고 37 섭씨 온도와 5%carbon 에 밤새 배양을 위한 35 밀리미터 교원질 입히는 유리 바닥 판으로 100, 밀리리터 당 000 세포 농도로 세포의 2 밀리리터를 씨를 뿌린다.transfection 배양당 1개의 1.5ml 튜브에 150마이크로리터의 신선한 혈청이 결핍된 배지를 추가합니다. 다음으로, 각 튜브에 3마이크로리터의 transfection 시약을 첨가하고 실온에서 최소 5분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브가 배양되는 동안 플레이트당 1.5ml 튜브에 175마이크로리터의 혈청 유래 배지와 3.5마이크로그램의 디스펄린 플라스미드 DNA를 추가합니다.그런 다음 150 μl의 plasmid DNA solution과 150 microlit의 transfection 시약을 플레이트당 하나의 새 tube에 결합하여 실온에서 20분 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 성장 배지를 2ml의 혈청 유래 배지로 교체합니다. 배양이 끝나면 300마이크로리터의 플라스미드 용액 전체를 각 플레이트에 고르게 분배하고 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.다음 날, 플라스미드 상등액을 신선한 성장 배지로 교체하고 플레이트를 다시 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이광자 상처 분석을 위해 세포를 준비하려면 형질 주입된 배양액을 1ml의 Tyrode 용액으로 한 번 헹굽니다. 그런 다음 1ml의 신선한 Tyrode 용액에 1마이크로리터의 2.5mmolar FM4-64 염료를 첨가합니다.다음으로, 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 현미경 소프트웨어에서 0.2 x 2 미크론 타겟을 생성하고 타겟을 세포막의 가장자리에 배치하여 타겟 라인이 겹치고 세포막에 수직이 되도록 합니다. FM 염료 신호를 여기시키려면 543나노미터 헬륨 네온 레이저를 선택하고, GFP 신호를 여기시키려면 488나노미터 아르곤 레이저를 선택하고, 감지 범위를 각각 600-760나노미터와 500-550나노미터로 설정합니다. 그런 다음 순차적 이미지 스캔의 5분 시계열을 만듭니다.막 병변을 생성하려면 2광자 레이저를 사용하여 15% 레이저 출력에서 820나노미터까지 10회 반복하여 시계열 시작 후 25초 후에 세포를 표백합니다. FM4-64 염료 형광을 정량화하려면 소프트웨어를 사용하여 6 x 6 미크론의 관심 영역을 그리고 관심 영역을 세포 내 상처 위치에 인접하게 배치합니다. 그런 다음 배경 값을 빼고 순 증가를 시간 0에서의 형광 값으로 나누어 각 시점에 대한 상대 형광 값을 계산합니다.건강한 인간 섬유아세포 세포는 레이저 상처 후 낮은 수준의 FM4-64 형광 활성화를 나타내는 반면, 치료되지 않은 환자 섬유아세포는 손상 후 높은 수준의 상대 형광 강도를 나타냅니다. 전장 디스펄린 플라스미드로 transfection된 환자 세포는 치료하지 않은 환자 대조군에 비해 상대적 FM4-64 형광 강도가 감소했지만 건강한 대조군에서 관찰된 형광 값과는 유사합니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포가 완충 용액에서 천천히 죽을 것임을 기억하는 것이 중요하므로 신속하게 작업하고 일정한 간격으로 새로운 세포로 변화해야 합니다.이 동영상을 시청한 후에는 이광자 현미경을 사용하여 막 병변을 재생하는 방법과 실시간으로 멤브레인 재밀봉을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

cell-membrane-repair-assay-using-a-two-photon-laser-microscope

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

전체 동물 MG53 - 중재 세포막 수리 및 세포 수준에서 동적 프로세스를 시각화하는 데 사용되는 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 방식은 플라즈마 막 resealing 및 재생 의학 세포 생물학을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

이 비디오는 포유류 세포에서 원형질막 재밀봉 효율을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 세포막에 기공을 형성하는 박테리아 독소에 노출됩니다. 세포 외 칼슘 이온이 존재하면 기공은 칼슘 유입을 일으켜 막 재밀봉 사건을 유발합니다. 재밀봉 효율은 DNA 결합 프로피듐 요오드화물 염료를 사용하여 평가되며, 이 염료는 재밀봉된 멤브레인 없이 세포에만 들어갑니다.

원형질막 재밀봉 효율을 측정하기 위한 In vitro Fluorescence-based Assay

친 유성 염료 FM1-43에 노출 된 세포의 라이브 영상은 기공 형성 독소는 세포막에서 제거되는 반응 속도의 정밀한 결정을 허용한다. 이것은 CA에 대한 요구 사항이 +, sphingomyelinase 및 세포막 수리 및 다른 인자를 평가하는 데 사용될 수있는 민감한 분석이다.

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

치유 손상균의 처리는 세포막 손상의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 포함한다. 이 프로토콜은 이러한 프로세스를 모니터링하는 분석을 설명합니다.

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

AlPcS2a 매개 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)는 살아있는 세포에서 세포내 소포(IV)의 시공간 손상을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.

세포내 소포 파열의 기능을 연구하기 위한 광역학적 접근

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

열플라즈몬 천공법은 공초점 현미경, 광학 핀셋 및 금 나노 입자를 통합하여 세포 및 거대 단층 소포에서 원형질막 복구 중 단백질 반응을 연구합니다. 이 기술은 빠르고 국소적인 막 천자를 가능하게 하여 복잡한 원형질막 수리 기계에서 주요 단백질과 그 기능적 역할을 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포 및 모델 막의 원형질막 복구를 조사하기 위한 열플라즈몬 접근법

배우세요 근육병 환자 세포의 세포막 복구 능력을 2광자 레이저 현미경으로 실시간 정량화하는 방법을. 이 기술은 살아있는 세포에서 막 재봉합 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

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