Name: 단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 초기 배아에서 고해상도 Hi-C 라이브러리 생성 프로토콜을 통해 크로마틴 3D 구조와 유전자 발현의 관계를 밝히는 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 최대 Planck 학회에 의해 투자 되었다. C.B.H. 분자 의학 국제 최대 Planck 연구 학교-에서 장학금에 의해 지원 되었다. 우리 친절 하 게 제공 eGFP PCNA 초파리 melanogaster 라인에 대 한 셸 비 블 라와 에릭 Wieschaus 감사 합니다.

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저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 프로토콜은 초기 초파리 배아에 높은-품질 지도 chromatin 아키텍처의 생성에 매우 효과적입니다. 이전 프로토콜34에 비해, 설명 하는 방법은 여기는 최신 제자리에 C 절차5, 빠른 처리, 높은 해상도, 그리고 시 약 사용에 더 적은 결과로 사용 합니다. 제자리에 이 C 프로토콜을 포함 하 여 전반적인 절차는 다양 한 단계와 외에 초파리실험 시스템에서 작동 하도록 예정입니다. 프로토콜은 낮은 입력된 요구, 이후는 고립 된 세포 인구에 또한 사용 될 수 있습니다. 초파리에서 범위 밖에 배아에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 여기에 설명 된, 몇 가지 매개 변수 때 특히 소재, 고정 해야 조정 합니다. 이후 이전 배아 개발 높게 불 침투성 표 피, 포 름 알 데히드의 농도 제기 하 고 고정 연장 될 수 있습니다. 핵 주기 14 이외의 단계에서 배아의 컬렉션에 대 한 단계 1.4에서에서 25 ° C에서 배아의 부 화 시간이 다음과 같이 조정 될 필요가: 핵 주기 12, 70 분; 핵 주기 13, 90 분; 3-4 hpf, 3시 30분
13 분열 분열 (단계 1-4), 중 핵 밀도 대략 각 부서와 복식. 핵은 그들의 밝은 GFP 형광에 의해 쉽게 식별할 수 있습니다. 유사 분열, 동안 eGFP PCNA는 핵에 위치한 되지 않습니다 그리고 신호 태아에 걸쳐 분산 됩니다. 이 특징은 식별 배아 가능한 동기 분열 분열을 겪고 있다. 염색 질 구조를 공부에 대 한 이러한 mitotic 배아 없습니다 일반적으로 바람직한, chromatin의 mitotic 기구 interphase 조직35보다 크게 다르기 때문. 특히 동기 mitotic 사단을 겪고 배아를 선택 하는 프로토콜에 맞게 가능 하다. 이 경우에, 유일한 배아 eGFP PCNA의 분산, 비 핵 분포 유지 되어야 한다, 그리고 모든 다른 배아를 폐기 해야 합니다. 이후 핵 밀도 결정할 수 없는 단계 배아 전송된 가벼운 현미경 검사 법에서 그들의 형태에 의해 대체 방법은 사용 해야 합니다. 극 세포 및 배아 주변에서 핵의 존재 반면 주변에 보이는 cellularization 나타냅니다 핵 주기 1412태아가 적어도 핵 주기 9, 완료 되었음을 나타냅니다.
안녕하세요 C 실험은 다양 한 제한 효소5를 사용 하 여 성공적으로 수행 수 있습니다. 현재 접근은 일반적으로 어느 4 기반 시퀀스, MboI, HindIII 등 6 기반 인식 사이트 등을 인식 하는 효소를 사용 합니다. 6 자료 커터 4 기반 커터의 장점은 그들은 충분 한 시퀀싱 깊이 그리고 더 조차 범위 제한 사이트의 게놈에서 주어진 더 높은 잠재적인 해상도 제공 하는 이다. 또 다른5,23,,3637에 한 4 기반 커터를 선택에 명확한 이점이 있다. 두 개의 가장 일반적으로 사용 되 효소, MboI 및 DpnII, 둘 다 동일한 GATC 인식 사이트 인식. DpnII는 CpG 메 틸 화, 초파리에서 관심사의에 덜 민감합니다. 여기에 제시 된 프로토콜 수 있습니다 또한 성공적으로 완료 제한 효소로 DpnII를 사용 하 여. 섹션 4.2에. 제한 효소와 버퍼 제조 업체의 권장 사항에 따라 DpnII의 호환성을 위해 조정 될 수 있다.
시퀀싱 라이브러리의 조각 크기 그림 2A에 표시 된 범위에서 크게 벗어나는, 시퀀싱 하는 동안 클러스터 형성 덜 효율적일 수 있습니다 또는 완전히 실패. 이 경우에, 전단 후 크기 분포를 확인 한다 하 고 적절 하 게 조정 매개 변수를 기울이기. 매우 작은 DNA 파편의 분포에 봉우리 (< 100 bp) 또는 매우 큰 (> 1000 bp) 크기 구슬 또는 폐기 해야하는 상쾌한 이상 크기 선택, 수행 등으로 문제를 나타냅니다. 종종 이러한 바람직하지 않은 크기로 한 사진된는 여전히 같은 작은 봉우리 이러한 라이브러리 시퀀싱 클러스터링 효율에만 작은 감소와 성공적으로.
PCR 복제의 높은 속도이 획기적으로 사용 가능한 시퀀스 읽기 수를 줄일 수 있기 때문에 피해 야 한다. PCR 중복의 속도 입력된 자료의 양을 직접 관련이 있습니다. 더 많은 입력을 사용 하 여 따라서 일반적으로 완화 한다 PCR 중복 문제를.
읽기 때문에 읽기 방향그림 2B) (필터링 수가 부족 한 소화, 너무 작은 효소, 너무 많이 입력된 자료, 또는 태아의 불완전 한 균질을 사용 하 여 결과 될 수 있는 나타냅니다.

염색 질 구조 캡처 (3 C)는1핵에서 chromatin의 토폴로지를 공부 하는 매우 유용한 방법으로 떠오르고 있다. 3 C 변종 안녕 C 단일 실험2에서 핵에서 발생 하는 모든 chromatin 상호 작용의 연락처 주파수 측정 가능 안녕-C의 응용 프로그램은 chromatin 조직, TADs, 구획, 루프3,,45등의 많은 기본 원리의 발견에 중요 한 역할을 했다.
Chromatin 아키텍처 개발 및 세포 분화의 맥락에서의 연구는 점점 더 이러한 프로세스6,,78, 동안 유전자 규칙의 메커니즘을 해명 하는 데 사용 됩니다. 9. 하나 큰 관심의 모형 유기 체 초파리 melanogaster, 그 개발 및 게놈 잘 특징 이다. 그러나, 몇 가지 설정 되었습니다 조직 문화 체 외에 외부 초파리 에서 chromatin 아키텍처 조사 연구10,11. 배아에서 16-18 h 게시물 수정, TADs와 구획 포유류에서 비슷한 구조의 연상 했다 확인 된10, 그들은 초파리 배아 중 유전자 규칙에서 연주하는 역할의 질문을 제기 개발입니다. Gastrulation, 이전 개발의 초기 단계에서 특히 이러한 학문은 기술적으로 도전. Gastrulation, 전에 초파리 배아 주기12,13당 8-60 분의 매우 빠른 속도로 진행 13 동기 핵 분열을 겪는 다. 이것 이외에, 다른 단계를 구별 하기 시각적 특징의 부족 어렵게 충분 한 수량에 밀접 하 게 준비 된 배아 자료를 얻기 위해.
Chromatin 핵 주기 해상도에서 초기 초파리 개발에서 건축을 공부 하 고 수 있는 프로토콜을 개발 하기 위하여 우리는 기존 하는 두 가지 기술을 결합: 제자리에서 안녕-C를, 높은 해상도의 세대 전체를 수 있는 게놈 연락처 지도5, 그리고 배아 준비 eGFP PCNA transgene13,14표현 유전자 변형 초파리 라인을 사용 하 여. 이 transgene interphase 동안에 핵 localizes 및 유사 분열 동안 syncytial blastoderm 통해 분 광. 이 속성을 사용 하 여, 그들의 핵 밀도 의해 다른 단계와 mitotic 배아 GFP 신호의 분산에 의해 쉽게 구별이 가능 하다.
함께, 이러한 기술을 활성화 chromatin 적게 20 초파리 배아에서 고해상도 3 차원 구조를 공부 하 고. 이 프로토콜 단일 핵 사단 주기에서 배아의 인구를 수확 하 고 초파리 배아를 정렬에 대 한 지침을 포함 합니다. 더 얻은 배아에서 수행 현장에 이.를 사용 하는 방법 설명 최종 결과 다음 세대 시퀀싱 컴퓨터에서 시퀀싱을 위해 적당 한 뉴클레오티드 라이브러리입니다. 결과 연속 읽기 다음 자세한 chromatin 상호 작용 지도 전체 초파리 게놈을 다루는으로 처리할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Biotin-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524016</td><td></td></tr><tr><td>MboI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0147L</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I Klenow 단편</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0012</td><td>T4 DNA 리가제 완충액 포함</td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>AppliChem</td><td>A4392</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Complete Ultra EDTA-free 프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&nbsp;( 색인 프라이머 세트 1)</td> 라이브러리 준비 섹션에서 사용되는 <td>New England Biolabs</td><td>E7335</td><td>염기서열분석 어댑터, 정방향(색인되지 않은) PCR 프라이머 및 리버스(색인화된) PCR 프라이머 및 USER 효소는 이 키트의 구성 요소입니다</td></tr>. 라이브러리 준비 <tr><td>섹션에서 사용되는 NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 준비 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645</td><td>엔드 프렙 효소 믹스, 엔드 프렙 반응 버퍼, 결찰 인핸서, 결찰 마스터 믹스 및 중합효소 마스터 믹스는 다음과 같습니다. 이 키트의 구성 요소</td></tr>: <tr><td>Covaris S2 AFA 시스템</td>, <td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA, LoBind 튜브, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon cell strainer 100 &micro; m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>배아 수집 바구니</td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>VWR</td><td>437536C</td><td></td></tr><tr><td>헵탄</td><td>AppliChem</td><td>122062.1612</td><td></td></tr><tr><td>M165 FC 형광 스테레오 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC DFC 카메라</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal 마이크로 유봉</td><td>Carl Roth</td><td>P985.1</td><td>배아를 용해하는 데 사용됩니다. step 4.1.4</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>AppliChem</td><td>A3832,0050</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65002</td><td>Streptavidin 코팅 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>Ampure XP 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 어세이 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 dsDNA HS 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-PCNA 플라이</td><td>S. Blythe 및 E. Wieschaus</td><td></td><td></td>의 선물</tr><tr><td>차아염소산나트륨 13%</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학을 위한 트리스 완충액 pH 8.0 (1 M)</td><td>AppliChem</td><td>A4577</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr> 분자생물학을 위한 <tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart 완충액</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>제한 효소 완충액</td></tr><tr><td>PCR 뉴클레오티드 혼합물</td><td>시그마-알드리치</td><td>11814362001</td><td>비수정 dCTP, dGTP, dTTP</td></tr><tr><td>BSA, 분자 생물학 등급</td> 분자생물학용 <td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5M 용액</td><td>AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨 3M pH 5.2</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>자기 스탠드</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L</td><td>Omnilab</td><td>5729802</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td>믹서</td></tr><tr><td>소형 배아 수집 케이지</td><td></td><td>Flystuff.com 59-100</td><td>알 수집 케이지</td></tr><tr><td>원심분리기 5424&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브 스트립</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673275</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td>T4 DNA 중합효소 완충액</td></tr></tbody></table>

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Chromatin의 3 차원 구조를 조사 하 고 유전자 규칙의 메커니즘에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공 합니다. 여기, 우리는 염색 질 구조 캡처 기술에서 수행 제자리에 안녕-C에 대 한 프로토콜 설명 초파리 melanogaster 태아 인구를 벌였다. 결과 단 하나 실험에서 핵에서 발생 하는 모든 chromatin 상호 작용의 매핑을 허용 시퀀싱 라이브러리입니다. 배아 정렬 형광 스테레오 현미경 및 핵 마커를 포함 하는 유전자 변형 플라이 라인을 사용 하 여 수동으로 이루어집니다. 이 기술은, 배아 인구 정의 된 세포 주기 상태, 각 핵 사단 주기에서와 사용 하 여 매우 높은 순도로 얻을 수 있습니다. 프로토콜은 gastrulation 넘어 이전 배아 정렬에 적응 될 수 있습니다. 정렬 된 배아 제자리에 이-C에에 대 한 입력으로 사용 됩니다. 모든 실험, 도서관 준비, 시퀀싱 등 5 일 이내에 완료할 수 있습니다. 프로토콜은 낮은 입력된 요구 사항 입력된 자료로 20 blastoderm 단계 배아를 사용 하 여 안정적으로 작동 하며 최종 결과 다음 세대 시퀀싱 시퀀싱 라이브러리입니다. 시퀀싱, 후 데이터 도메인 (TAD) 구조, chromatin 루프, 및 chromatin 토폴로지가 연결에 대 한 정보를 얻기 위해 다양 한 사용할 수 있는 도구를 사용 하 여 분석할 수 있는 게놈 넓은 chromatin 상호 작용 지도로 처리할 수 있습니다. 초파리 개발 하는 동안 구획입니다.

핵 주기 12, 13 및 14에 배아 인구를 정렬 (1:30, 해당 1:45, 그리고 2:10 시간 게시물 수정, 각각12)와 3-4 h 게시물 수정 (hpf) 프로토콜에서 설명 하는 절차에 따라 가져온. 각 정렬 된 배아의 eGFP PCNA 신호의 사진을 찍고, 여 다운스트림 실험에 사용 되는 모든 단일 배아의 정확한 단계와 세포 주기 상태를 가능 하다. 정렬 된 인구에서 배아의 예제 사진은 그림 1B-E에 표시 됩니다. 현장에 이 C 프로토콜의 출력은 뉴클레오티드 라이브러리 다음 세대 시퀀싱 컴퓨터에서 시퀀싱을 준비. 이 위해 적어도 2-4 nM의 최종 라이브러리 농도 일반적으로 필요 합니다. 입력된 자료의 권장된 금액을 사용 하 여,이 농도 안정적으로 (표 1)를달성.
DNA 파편 크기 선택은 약 500 bp (그림 2A), 정확한 전단에 따라 크기 선택 매개 변수에서 최대 300-600 bp 사이 후의 예상된 크기 분포. 시퀀싱, 게놈에 매핑할 금지 파편의 수를 최소화 하기 위해 적어도 75 bp 길이의 쌍 간 읽기를 하는 것이 좋습니다. 1-2 kb 빈 크기와 고해상도 지도 400 백만 읽기에서 얻을 수 있습니다. 매우 높은 깊이에 단일 복제를 시퀀싱 하는 대신 각각 읽습니다 ~ 150 백만의 낮은 깊이에서 여러 생물 복제를 시퀀싱 하는 것이 좋습니다. 이 생물 학적 변이의 평가 허용 하 고 PCR 중복으로 인해 폐기 읽기의 낮은 수에 이르게. 시각적 표현에 대 한 복제는 결합할 수 있습니다. 높은 농도로 샘플 시퀀싱에 투입 하기 전에 그림 2B에서 같이 기본 라이브러리 품질 파라미터를 결정 하기 위해 얕은 시퀀싱 (샘플 당 몇 백만 읽기)을 사용 하 여 샘플을 실행 하는 것이 좋습니다.
안녕하세요 C 데이터의 분석 중요 한 전산 자원 및 생물 정보학 전문을 필요합니다. 거친 개요로 서 짝된 읽기 참조 게놈에 독립적으로 매핑되는 결과 정렬에 품질 필터링 됩니다 차례로 주어진된 빈 해상도 또는 조각 수준 연락처의 매트릭스를 생성할 수 있는 필터링에서 정렬입니다. 연락처 매트릭스 TADs, 루프, 및 구획을 탐험 하는 모든 추가 다운스트림 분석을 위한 기초 이다. 연속 읽기의 초기 분석을 위해 여러 생물 정보학 파이프라인은 사용할 수를 사용 하는 많은 전문된 생물 정보학 기술18,19, 없이 연락처 행렬에 원시 읽기의 처리 20,21,,2223. 추가 분석을 수행 하는 방법으로 연구에서 정확한 생물학 질문에 크게 의존 하 고 R 또는 파이썬 스크립팅 및 프로그래밍에서 중요 한 경험을 해야 할 수도 있습니다. 그러나, 여러 가지 도구와 알고리즘 TADs를 호출 하는 분석 하는 소프트웨어 뿐만 아니라 사용할 수 있는5,,2425,26,27,28및 웹 브라우저에서 독립 실행형 데스크톱 응용 프로그램29,30,,3132로-C 데이터를 탐험해 보세요.
일단 처리, 도서관의 품질 다른 통계 (그림 2B)를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 첫째, 동일한 원래 분자에서 발생 하는 시퀀스 읽기 쌍의 수는, PCR 중복의 속도 낭비 시퀀스 읽기의 양을 제한 하려면 가능한 한 낮게 이어야 한다. 그러나, 심지어와 함께 라이브러리 &gt; 중복 필터링 하는 경우 높은 품질 연락처 지도로 40 %PCR 복제를 처리할 수 있습니다. 둘째, 그들의 방향으로 필터링 된 읽기 속도4에 설명 된 대로 일관 되 게 해야 합니다 정렬된 읽기 쌍의 10% 보다 낮은.
핵 주기 12와 14 사이 초파리 의 사전 gastrular 개발, 중 핵 건축은 크게 리 모델링된33 (그림 3). 핵 주기 12, 몇 TADs 감지 하 고 연락처의 전반적인 분포는 많은 뚜렷한 특징 없이 아주 부드러운. 이것은 극적으로 변경 핵 주기에서 13 및 14, TADs는 점점 저명 하 고 불특정 장거리 연락처는 고갈.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> 그림 1: 정렬 하는 동안 eGFP PCNA 배아의 대표 사진. (A) eGFP PCNA 신호 후 60 분 수집 및 핵 주기 12 (B), 핵에 정렬 된 인구에서 배아의 25 ° C (B-E) 예 2 h 인큐베이션 주기 13 (C), 핵 주기 14 (배아의 정렬 되지 않은 인구에서 D) 그리고 동기 유사 (E) 분열을 겪고 배아에서. 스케일 바 = 200 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> 그림 2: 제자리에 이 C 라이브러리 품질 통계의 예. (A) Bioanalyzer 추적 성공이 C 라이브러리 (도서관 1, 최고)와 시퀀싱 (도서관 2, 아래쪽)에 대 한 너무 큰 파편의 절정을 표시 하는 라이브러리에서 DNA 조각 크기의 분포를 보여 주는. 도서관 2는 시퀀스 성공적으로, 하지만 원치 않는 DNA 파편의 더 큰 양을 감소 시퀀싱 수율으로 이어질 수 있습니다. (B) 두이 C 라이브러리의 통계 필터링: 표시는 읽기 방향 및 거리 (안쪽, 바깥쪽)4 또는 PCR 이중 (중복) 추가 분석에서 제외 하는 정렬 된 읽기 쌍의 수입니다. 각 막대에서 읽기 (남은) 필터 통과 및 실패 (필터링 됨)의 수가 그려집니다. 읽기는 필터를 전달의 비율 또한 텍스트로 표시 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> 그림 3: 안녕 C 상호 작용 지도 준비 된 배아에서. 안녕하세요 C 상호 작용 지도 10 kb 해상도 범주화 하 고33전에 설명한 대로 균형. 표시는 염색체 2에 지역 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>라이브러리</td>
			<td>단계</td>
			<td>배아의 수</td>
			<td>(Ng)을 기울이기 전에 금액 DNA</td>
			<td>PCR 주기</td>
			<td>마지막 도서관 농도 (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>핵 주기 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>핵 주기 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>핵 주기 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>핵 주기 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>핵 주기 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>핵 주기 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>핵 주기 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>핵 주기 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>핵 주기 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 대표 시퀀싱 도서관 통계 목록. 목록 생성, biotin 풀 다운 및 큐 비트에 의해 측정 기울이기 전에 총 DNA의 금액에 대 한 사용 된 배아의 수에서에서 각 라이브러리에 대 한 PCR의 수 확대, 그리고 시퀀싱 라이브러리의 최종 농도 대 한 사용 주기 정화 및 크기 선택 후 표시 됩니다.

이 작품 설명 프로토콜 위한 고해상도 제자리에 이 C 라이브러리에서의 세대 단단히 준비 사전 gastrulation 초파리 melanogaster 태아.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

이 방법은 크로마틴의 3D 구조가 유전자 발현 및 발달에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지와 같은 크로마틴 아키텍처 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 크로마틴 아키텍처와 정밀하게 준비된 플라이 배아의 고해상도 뷰를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 크로마틴 조직 및 개발에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 형질전환 플라이 라이브러리의 기존 라인을 사용하여 크로마틴 조직에서 의 영향을 테스트할 수도 있습니다.프로토콜을 시작하려면 이전에 수집된 배아의 총 부피를 PBST를 사용하여 2밀리리터로 조정합니다. 6 밀리리터의 헵탄과 100마이크로리터를 37%의 포름알데히드를 물에 넣습니다. 포름알데히드를 추가한 후 1분 동안 튜브를 위아래로 힘차게 흔들어 줍니다.수성 및 유기 단계는 샴푸와 같은 일관성을 형성하기 위해 결합됩니다. 로터리 믹서에 혼합물을 10분 동안 교반합니다. 튜브의 바닥에 배아를 수집하기 위해 실온에서 1 분 동안 500 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.샴푸와 같은 액체 전체를 흡인하고 폐기하여 배아를 흡인하지 않도록 주의하십시오. 포름알데히드를 첨가한 후 15분 후, 125밀리머 글리신으로 PBST의 5밀리리터에서 배아를 재보습한다. 배아를 1분 동안 힘차게 위아래로 흔들어 줍니다.원심 분리 후, 슈퍼 나티를 흡인. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 100개의 배아를 정렬에 적합한 작은 유리 용기로 옮기고, 바람직하게는 어두운 배경에 얼음 위에 놓습니다. 바늘 또는 주사기 팁을 사용하여 핵 밀도 및 세포 주기 상태에 의해 배아를 정렬합니다.부분적으로 비핵 GFP 신호를 보여주는 EGFP PCNA 및 배아의 분산, 비핵 분포에 의해 인식되는 모든 미토틱 배아를 제거합니다. 선별을 돕기 위해 각 배치에서 12, 13 및 14의 참조 배아를 참조 배아 중 하나와 일치시도록 하십시오. 파이펫은 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 원하는 배아를 증가시다.신선한 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 계획된 실험을 위해 충분한 배아가 정렬될 때까지 계속하십시오. 실온에서 100배 g로 튜브를 짧게 회전시다.상체를 제거하고 태아가 동결을 위해 가능한 한 건조하도록 하십시오. 액체 질소에 튜브를 잠그고 영하 80도에 저장하여 배아를 동결 플래시. 얼어붙은 배아를 얼음 위에 놓습니다.얼음 차가운 리시 버퍼의 500 마이크로 리터에서 배아를 다시 중단합니다. 배아가 튜브 의 바닥에 정착 할 수 있도록 1 분을 기다립니다. 다음으로, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 단단히 맞도록 설계된 얼음에 미리 냉각 된 금속 마이크로 유봉으로 배아를 갈아.배아를 동요하지 않으려면 튜브 바닥에 닿을 때까지 유봉을 천천히 삽입하십시오. 아래로 밀어 두 방향으로 유봉을 두 번 회전하여 갈기. 봉제봉을 매우 약간 들어 올립니다.튜브 의 바닥에 다시 밀어 10 번 또는 배아가 완전히 lysed 될 때까지 연삭 절차를 반복합니다. 해결책은 균질해야 하며, 배아의 잔류 큰 조각은 남아 서는 안됩니다. 15분 동안 얼음에 균질화된 서스펜션을 배양합니다.섭씨 4도 에서 섭씨 1, 000배에서 5분간 회전합니다. 500 마이크로리터 얼음 차가운 리시스 버퍼로 재연하고 위아래로 파이펫을 하여 상체를 버리고 펠릿을 씻으십시오. 또 다른 스핀 후, 상체를 폐기합니다.도데실 설페이트 나트륨 0.5% 나트륨 도데실 설페이트 또는 SDS의 100 마이크로리터에서 세척된 펠릿을 재중단합니다. 그런 다음 가열 블록에서 섭씨 65도에서 10 분 동안 샘플을 배양하여 핵을 침투합니다. 10%트리톤 X100과 120마이크로리터의 마이크로리터 50기를 추가합니다.튜브를 플릭하여 내용물들을 섞고 튜브를 37도에서 15분간 열블록에서 배양합니다. 10X 제한 효소 버퍼 25마이크로리터와 마이크로리터 MBO1당 5단위 20대를 추가합니다. 튜브를 플릭하여 내용을 혼합하고 열을 차단하여 튜브를 배양하여 DNA를 소화합니다.MBO1의 20 단위를 추가합니다. 잠복기를 90분 동안 계속하십시오. 두 번째 90분 배양 후 샘플을 섭씨 62도에서 20분 동안 배양하여 MBO1을 비활성 상태로 합니다.다음으로, 0.4 밀리몰러 비오틴 14-dATP의 18 마이크로리터, 수정되지 않은 3.3 밀리머 dCTP-dGTP-dTTP 믹스의 마이크로리터 2.25개, 마이크로리터 DNA 폴리머라제 I Klenow 단편당 5단위의 8개의 마이크로리터를 추가한다. 튜브를 플릭하여 내용물들을 혼합하고 샘플을 섭씨 37도에서 90분간 배양합니다. 다음으로, 657 마이크로리터의 물, 10X T4 DNA 리구아제 완충제 120마이크로리터, 100마이크로리터 100마이크로리터 10%트리톤 X100, 밀리리터 소 혈청 알부민 당 20밀리그램의 6마이크로리터, 그리고 마지막으로 마이크로리터 T4 DNA ligase당 5단위의 마이크로리터를 추가합니다.다음으로, 2 시간 동안 실온에서 20 RPM에서 튜브를 부드럽게 회전시십시오. 마이크로리터 T4 DNA 리그아제당 5개의 마이크로리터를 추가합니다. 2시간 더 회전한 다음 5분 동안 2, 500배 g에서 핵을 회전시합니다.원심 분리 후, 상체를 폐기하십시오. 추출 버퍼 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 밀리리터 단백질 제 K.Flick 당 20 밀리그램의 마이크로 리터를 추가하고 튜브를 배양하여 단백질을 소화합니다. 염화 나트륨 5개미130마이크로리터를 넣고 하룻밤 동안 배양하여 크로스링크를 해제합니다.다음 날, 낮은 DNA 결합 특성을 가진 새로운 2 밀리리터 튜브로 견본을 피펫합니다. 3 개의 어금니 나트륨 아세테이트와 밀리리터 글리코블루 당 15 밀리그램의 마이크로리터 2개를 0.1X 부피를 추가합니다. 순수한 절대 에탄올 1.6 볼륨을 추가하고 내용물 왜곡한 다음 샘플을 섭씨 영하 80도에서 15분 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 원심분리내용을 분리합니다. 글리코블루에서만 발견할 수 있는 DNA 펠릿을 찾아보세요. 피펫 팁을 DNA 펠릿에서 반대 쪽 벽을 따라 튜브로 이동하여 주체를 조심스럽게 제거합니다.70%에탄올의 800 마이크로리터로 펠릿을 씻으십시오. 샘플을 반역하여 원심분리기를 실온에서 20, 000배에서 5분간 섞는다. 이 단계에서 남은 액적을 제거하고 다음 세차처리는 P10 팁으로 튜브에서 밀어 낸 다음 뚜껑을 열어 최대 5분 동안 공기 건조시합니다.액체가 남지 않은 후 10 밀리머 트리스 염화물의 50 마이크로리터를 추가하십시오. 반복적으로 펠릿이 DNA를 용해시키기 위해 위치한 영역에 대한 용액을 피펫. 튜브를 가볍게 하여 밀리리터 RNase A.Mix당 20 밀리그램의 마이크로리터 1개를 추가합니다.RNA를 소화하기 위해 15분 동안 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 마지막으로, 도서관 준비 까지 냉동실이나 냉장고에 샘플을 저장합니다. 각 정렬된 배아 배치의 EGFP PCNA 신호의 이미지는 다운스트림 실험을 위한 모든 단일 배아의 정확한 단계 및 세포 주기 상태를 드러냅니다.Bioanalyzer 추적은 크기 선택 후 DNA 조각의 크기 분포가 약 450 개의 기본 쌍에서 최대300 ~ 700 개의 기본 쌍 사이임을 보여줍니다. Hi-C 상호 작용 맵은 핵 사이클 12에서 TAD가 점점 더 두드러지고 특이하지 않은 장거리 접촉이 고갈될 때 핵 사이클 13과 14에서 극적으로 변경되는 토폴로지 관련 도메인 또는 TAD가 감지되는 것을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 그것은 철저하게 구슬을 세척하고이 낮은 품질의 Hi-C 라이브러리로 이어질 수 있기 때문에 특히 높은 온도에서 불필요하게 잠복 시간을 연장하지 기억하는 것이 중요합니다.정확한 스테이징과 고해상도 크로마틴 확인 매핑을 결합한 이 기술은 후성 유전학 분야의 연구원들이 생체 내 발달 환경에서 3차원 크로마틴 조직의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

generation-genome-wide-chromatin-conformation-capture-libraries-from

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

최근 높은 처리량 시퀀싱 기술은 크게 염색질 Immunoprecipitation (칩) 실험의 감도를 증가하고 정화 셀 또는 해부 조직을 사용하여 응용 프로그램을하라는 메시지가있다. 여기에 칩 기술을 사용하는 방법을 윤곽을...

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

학습하세요 Drosophila melanogaster 초기 배아에서 고해상도 Hi-C 라이브러리 생성 프로토콜을 통해 크로마틴 3D 구조와 유전자 발현의 관계를 밝히는 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

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