Name: 교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 층류 유동 기반 분석을 통해 혈관 세포 및 혈소판에 부착하는 백혈구의 상호작용 메커니즘을 조사하는 방법을. 이 비용 효율적이고 사용자 친화적인 기술은 다양한 실험 조건에서 면역학 및 염증 연구에 활용됩니다.

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우리는 박사 마틴 M. 슈미트와 선 Fraemohs 감사합니다. 이 작품 (ZonMW VIDI 016.126.358, 혈액 수혈 연구 (LSBR Nr. 1638) Landsteiner 재단 및 도이치 가운데 (SFB1123/A2) R.R.K.에 게 수 여 과학적인 연구를 위한 네덜란드 기초에 의해 지원 되었다

여기에 설명 된 모든 메서드는 의료 윤리 및 동물 윤리 보드의 마스트리히트 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 플로우 기반 분석 결과 인간 세포와
<ol><li>
인간의 혈액에서 혈소판의 분리
	<ol>
<li>응고 제 시트르산 (3.2%)에서 정 맥 혈액을 그립니다.</li>
		<li>1/15 양의 산 시트르산 포도 당 추가 (ACD: 80mm trisodium 시트르산, 52 m m 구 연산 및 183 mM 포도 당) 피를.</li>
		<li>혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 15 분 동안 브레이크 없이 350 x g에서 원심.</li>
		<li>15 mL 원뿔 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 ACD의 1/20 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>혈소판 가난한 플라스마 (PPP)를 15 분 동안 브레이크 없이 1,110 g에서 원심.</li>
		<li>폐기는 상쾌한. 피펫으로 팁 (P 1000)의 끝을 잘라, 그것 넓은 구멍, 혈소판 활성화의 예방에는 에이즈 그리고 신중 하 게 혈소판 버퍼 ph 6.6 PRP와 동일한 볼륨에 혈소판 펠 릿을 일시 중단 (PB: 136 m m NaCl, 10 mM Hepes 2.7 m m KCl, 2 mM MgCl2, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 및 0.1% 포도 당). ACD의 20 분의 1 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 브레이크 없이 1,110 g에서 혈소판 작은</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 신중 하 게 위에 혈소판 1 mL 혈소판 버퍼 (pH 7.5) 일시 중단.</li>
		<li>자동된 혈액학 분석기 1/10 희석에서 혈소판 농도 측정 합니다.</li>
		<li>2 x 107/mL의 수를 달성 하기 위해 혈소판 버퍼 (pH 7.5)로 볼륨을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(Brinkmann 외. 에서 적응 하는 인간의 혈액에서 polymorphonuclear 세포의 고립 11 )
	<ol>
<li>헤 파 린 (10 U/mL)로 응고 제 24 mL의 혈액을 그립니다.</li>
		<li>1.077 g/mL 밀도 polysucrose 나트륨 diatrizoate 매체의 6 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 15 mL 원뿔 튜브, 그리고 신중 하 게 위에 레이어 5-6 mL 전 혈을.</li>
		<li>브레이크 없이 800 x g에서 20 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>발음 하 고 명확한 노란 가기 레이어를 삭제 낮은 붉은 단계 granulocytes 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 포함 된 전송. 2 mM EDTA 14 mL, 및 브레이크 없이 300 x g에서 10 분 원심 분리기의 최종 볼륨을 포함 하는 PBS를 추가 하 여 셀을 씻어.</li>
		<li>한편, 밀도 그라데이션 중간 준비 (예를 들어, percoll, 재료의 표참조) 2 mL PBS 재고 솔루션 x 10와 18 mL 밀도 그라데이션 매체를 혼합 하 여 작업 솔루션. PBS이 작업 솔루션을 희석 (1x) 85%, 80%, 75%, 70%, 그리고 65% 그라데이션 중간 솔루션 4.25 mL를.</li>
		<li>서로 모든 중간 비율의 2 개 mL를 레이어 링 하 여 밀도 그라데이션으로 2 원뿔 튜브를 준비 합니다. 가장 높은 농도 함께 시작 하 고 감소 하는 순서에서 계속. 튜브에 레이어 방수 표시와 함께 표시 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 각 두 준비 그라디언트에 세포 현 탁 액의 2 mL 레이어.</li>
		<li>신중 하 게 균형된 원심 분리기에서 브레이크 없이 800 x g에서 20 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>원심, 후 상위 계층 및 65%의 대부분을 제거 레이어 (첫 번째 링) PBMCs, 그리고 interphases 85% 계층까지 남은 화이트 새로운 튜브에 수집 (두번째 반지, PMN).</li>
		<li>PBS 2 m m EDTA, 튜브 및 브레이크 없이 300 x g에서 10 분 원심 분리기를 작성 하 여 세포를 씻어.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 행 크의 버퍼 (pH 7.45), 포함 10 mM Hepes 및 0.2% 인간의 알 부 민 (분석 결과 버퍼)의 1 mL에 sedimented 셀 (일반적으로 ≥95 %는 PMN) 일시 중단.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀 및 셀 1 x 106/mL에서 일시 중단.</li>
		<li>형광 라벨 및 관류 백혈구 (단계 3.3)의 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
준비의 부착 혈소판-혈관 세포-monolayers
	<ol>
<li>
세포 배양 접시 준비 (경작된 한 세포)
		<ol>
<li>미리 희석된 쥐 꼬리 콜라겐 (30 µ g/mL PBS 0.2 µ m 필터를 통해 필터링에 희석)의 1 mL와 함께 35 mm 셀 문화 요리 코트.</li>
			<li>37 ° C에서 30 분 동안 incubate 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고, 한 번 PBS 가진 접시를 세척.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
문화 요리에서 혈관 세포의 문화
		<ol>
<li>주 (예를 들어, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) 또는 (예를 들어, EA 불멸 하 게 혈관 세포 분리. Hy926, SVEC) 1.5 mL 셀 분리 솔루션 (예를 들어, accutase) T75 플라스 크에 합류를 성장. 세포 분리 솔루션 무력화 챔버 계산 셀 셀 농도 결정 하는 적절 한 성장 매체의 4.5 mL를 추가 합니다. 적절 한 성장 매체 (예를 들면, 완전 한 내 피 세포 성장 매체)에 105 셀/mL x 0.5에서 세포를 일시 중단 합니다.</li>
			<li>각 35 mm 접시에 세포 현 탁 액의 2 개 mL를 추가 합니다. 5% CO2 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 셀 (셀 유형에 따라 24-48 h 복용) 합류까지 문화.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
유리 coverslip 준비 (혈소판 부착)
		<ol>
<li>HCl EtOH에 한 번 유리 coverslip 담가 (1.2 M / 50 %v / v).</li>
			<li>초순에 2 번 coverslip 린스.</li>
			<li>N2coverslip 건조.</li>
			<li>사전 코트 유리 coverslip 희석된 쥐 꼬리 콜라겐의 관류 챔버의 채널의 위치에 따라 100 µ L와 난 (30 µ g/mL PBS 0.2 µ m 필터를 통해 필터링에 희석)을 입력 합니다.</li>
			<li>RT에서 30 분 동안 품 어 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고 씻어 coverslip 3 x PBS.</li>
			<li>실시간에서 0.5 h HEPES에 1 %BSA 콜라겐 코팅 coverslip 차단</li>
			<li>세척 하 고 건조는 coverslip 관류 챔버에 탑재. 격리에서 인간 혈소판 또는 각각 1.1 또는 2.1, 단계에 설명 된 대로 마우스 피.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
혈소판의 동원 정지
		<ol>
<li>채널당 2 x 107/mL 혈소판 정지의 70 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO21.5 h에 품 어.</li>
			<li>신중 하 게 형광 라벨 및 백혈구 (단계 3.3)의 재 관류와 실시간 계속에서 적어도 30 분 동안 차단 솔루션 (HEPES에 5 %BSA) 비 점착 혈소판 대체.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
혈관 세포 단층의 자극
		<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2에서 4 h에 대 한 신선한 미디어 10 ng/mL 종양 괴 사 인자 α (TNFα)를 포함 하는 미디어를 대체 하 여 혈관 세포를 자극.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 플로우 기반 분석 Murine 셀
<ol><li>
마우스의 혈액에서 혈소판의 분리
	<ol>
<li>심장 빵 꾸에서 21 G 바늘 (~ 1 mL)을 사용 하 여 그리기 피 취 (마 취 제 80 mg/kg 및 medetomidine 0.3 mg/kg) 6-8 주-오래 된 마우스 (C57Bl/6)로 응고 제 시트르산 (3.2%)에서.</li>
		<li>ACD의 1/6 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>220 x g에서 원심 분리기, 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 얻기 위해 5 분 동안 중간 브레이크.</li>
		<li>새로운 튜브에 적혈구의 1/3 플러스 상쾌한 (~ 600 µ L)를 전송</li>
		<li>6 분 브레이크 없이 95 x g에서 원심.</li>
		<li>상쾌한 (PRP)을 전송 하 고 Tyrode의 버퍼에 1/10 희석에서 혈소판 농도 측정 (TH 버퍼: 136 m NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 m m KCl, 0.42 m NaH2포4m m * H2O 2 m m MgCl2, 0.1% 소 혈 청 알 부 민, 0.1% 포도 당) 자동된 혈액학 분석기.</li>
		<li>ACD + 0.1 U/mL apyrase의 1/25 볼륨을 추가 하 여는 혈소판을 세척 하 고 2,870 g, 2 분 동안 중간 브레이크에서 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 600 µ L TH 버퍼, ACD의 1/10 볼륨 및 0.1 U/mL apyrase를 추가 합니다. 피펫으로 팁 (P 1000)를 잘라 넓은 만드는 보어, 혈소판 활성화의 예방에서 원조 하 고 부드럽게 펠 릿을 일시 중단.</li>
		<li>2,870 g에서 원심 분리기, 2 분 동안 중간 브레이크</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 부드럽게 일 버퍼에는 혈소판을 일시 중단.</li>
		<li>2 x 107/mL의 수를 달성 하기 위해 일 버퍼와 볼륨을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈소판 부착 monolayers의 준비
	<ol>
<li>1.3.3 당 유리 coverslip (부착 혈소판)를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈소판의 동원 정지
	<ol>
<li>채널당 2 x 107/mL 혈소판 정지의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO21.5 h에 품 어.</li>
		<li>신중 하 게 형광 라벨 및 백혈구 (단계 3.3)의 재 관류와 실시간 계속에서 적어도 30 분 동안 차단 솔루션 (HEPES에 5 %BSA) 비 점착 혈소판을 바꿉니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 혈소판 단층의 자극
	<ol>
<li>백혈구 (단계 3.3)의 관류, 전에 트 롬 빈의 관류에 의해는 혈소판을 자극 (0.5 nM) 37 ° c.에 3 분 동안 HHHSA 버퍼에</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 형광 라벨 및 백혈구 (PMN 또는 인간과 RAW264.7 THP-1 또는 Murine 플로우 기반 분석 결과 대 한 기본 마우스 Monocytes)의 관류
<ol><li>
형광 라벨
	<ol>
<li>셀 permeant 녹색 형광 핵 산 얼룩 (1 µ M) 백혈구 (1 x 106/mL) 레이블을. 37 ° c.에 30 분에 대 한 셀을 품 어</li>
		<li>5 분, 300 x g에서 원심 분리 하 여 PBS 가진 세포를 세척 하 고 0.5 x 106 셀/mL (5 mL 당 유량에 따라 테스트 조건) 분석 결과 버퍼에서의 농도에 세포를 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
흐름 챔버 시험 준비
	<ol>
<li>셀 단층에 백혈구 접착, 세포 배양 접시에서 삭제 하 고 흐름 챔버에 조립. 주사기에 튜브를 연결 합니다. 고정된 혈소판에서 백혈구 접착, 주사기에 마이크로 슬라이드를 연결 합니다. 미리 따뜻한 물 목욕 37 ° c</li>
		<li>받아 관류 주사기 (50 mL), 설치 주사기 주사기 홀더, 및 세트에 펌프 철회 모드. 0 ml, 펌프 볼륨을 설정 하 고 50 mL 주사기 26.70 m m 직경 설정.</li>
		<li>튜브의 한쪽 끝을 팔꿈치 luer 커넥터를 연결 합니다. 주사기에 luer 잠금 커플러 놓고 luer 잠금 커플러를 팔꿈치 luer 커넥터와 튜브를 연결 합니다. 흐름 약 실에 무료 튜브 끝을 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
백혈구 관류 및 접착
	<ol>
<li>셀 단층에 백혈구 접착, 세포 배양 접시에서 삭제 하 고 흐름 챔버에 조립. 주사기에 튜브를 연결 합니다. 고정된 혈소판에서 백혈구 접착, 주사기에 마이크로 슬라이드를 연결 합니다.</li>
		<li>백혈구 관류와 접착에는 혈관에 대 한-또는 혈소판 단층, 분석 결과 버퍼 채우기 1 mL 피펫으로와 튜브를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 두 번째 튜브 다음 놓고, 튜브를 집어넣은 흐름 챔버에 연결.</li>
		<li>백혈구 관류, 이전 세포 현 탁 액을 3mm CaCl2 와 2 mM MgCl2 를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</li>
		<li>챔버와 튜브에서 가능한 공기를 제거 하는 셀의 관류 사전 분석 결과 버퍼 perfuse</li>
		<li>꽉 그들을 당기고 하 여 튜브 끝을 닫고 갇혀에서 기포를 방지 세포 현 탁 액을 분석 결과 버퍼에서 튜브를 전환 합니다. 첫 번째 셀 도착할 때까지 적절 한 흐름 속도/전단 응력으로 셀을 perfuse.</li>
		<li>2 분에 대 한 적절 한 흐름 속도/전단 응력으로 셀 perfuse 및 (예를 들어, EVOS FL) 거꾸로 위상 대비/형광 현미경으로 압 연 및 부착 세포의 2-6 분 사이 6 사진을 캡처할 100 배 확대를 사용 하 여 연결 에 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라. 참고: 흐름 속도/전단 응력 흐름 챔버 크기와 perfusate의 점도에 따라 달라 집니다. 여기에서 사용 하는 관류 챔버에 대 한 ( 재료의 표참조): Τη= *Φ 97.1* Τ: 전단 응력 (1 dyn/cm2) Η: 점성 (0.015 dyn * s/cm2) Φ: 유량 (0.67 mL/min)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
백혈구 드 접착
	<ol>
<li>De-adhesion에서 덫을 놓아 되 고 기포를 방지 튜브를 압박 하 여 분석 결과 버퍼에 셀 서 스 펜 션에서 튜브를 전환 합니다.</li>
		<li>세포 관류 적절 한 흐름 속도/전단 응력 (참조 3.3.7 참고) 분석 결과 버퍼와 분리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
백혈구 환생
	<ol>
<li>백혈구 환생에 대 한 백혈구 (3 단계) perfuse는 적절 한 양의 백혈구 준수 (~ 50 셀/보기 분야) 때까지.</li>
		<li>분석 결과 버퍼에 백혈구 정지를 바꿉니다.</li>
		<li>시간 경과 의해 37 ° c.에 30-60 분 마다 10-15 s transmigrating 셀을 기록</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 생체 외에서 분석 결과 혈관 염증, 동안 백혈구 신규 모집의 기본 메커니즘을 조사 하는 간단한 방법 이지만 지적을 몇 가지 중요 한 포인트는. 이 분석 결과 성공적으로 수행 하기 위한 첫 번째 요구 사항은 백혈구는 그대로 고 confluent 혈관 또는 혈소판 단층의 살포 이다. 이 사전 코팅 콜라겐 유형 표면의 난에 의해 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 주요 혈관 세포를 작업할 때 그것은 부드럽게 권장된 콜라 포함 된 분리 솔루션을 사용 하 여 셀을 분리 하는 것이 중요 (참조 테이블의 자료), 덜 엄격한입니다, 하지만 효과적 트립 신으로. 혈소판 monolayers에 대 한 혈소판 활성화 및 집계를 방지 하기 위해 절연 동안 혈소판을 부드럽게 씻어 중요 하다.
또 다른 중요 한 고려 사항은 펌프의 연속성을 유지 하 고 있다 철수 모드는 불연속성을 리드 이후는 관류에 대 한 사용 방해 흐름 속도 전단 조건. 따라서, 부정확 실제...

부상, 염증, 또는 감염, 백혈구 신속 하 게 응답에 병원 체 또는 손상-관련 된 분자 패턴 (PAMPs, DAMPs)는 활성화 상태로 변경 하 고 혈 류 염증과 조직 손상의 사이트로 이동 합니다. 백혈구의 능력을 그들의 세포질이 고 분자 환경 상호 작용 하는 그들의 올바른 기능에 필수적 면역 세포, 백혈구 접착 결핍증1등 유전 질환에 의해 강조입니다. 백혈구 접착은 지난 수 십년 동안 강렬한 수 사의 대상이 되고있다 그리고 이것은 초기 1990 년대2,3백혈구 접착 폭포의 개념 귀착되. 백혈구 접착 일으키는 혈관 표면 롤오버 셀 피에 백혈구의 selectin-중재 캡처로 시작 됩니다. 이 압 연 백혈구를 endothelium 바인딩된 철새 신호, 예를 들면, 발산, integrins의 활성화를 유도 대 한 검색을 수 있습니다. 그 후, 활성화 integrins 회사 백혈구 체포 결과 내 피 ligands 바인딩 중재. 백혈구 수 있습니다 이후 크롤링 및 확산, 내 피 단층을 관통 하 고 기본 조직으로 transmigrating 하기 전에 extravasate를 준비 합니다. 정식 백혈구 캐스케이드의 기본 개념은 그것의 소개부터 크게 불변에 남아 있었다, 몇몇 중간 단계 추가4. 그럼에도 불구 하 고, 정확한 분자 메커니즘 및 백혈구 신규 모집에서 포함 된 많은 선수의 역할을가지고 하지 명확히 지금까지, 그리고 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동-) 면역 분야에서 중요 한 주제에 남아 있다 연구입니다.
예를 들어 동맥 경화 같은 혈관 염증 성 질병, 중 혈관 벽 드라이브 패 개발에 백혈구 신규 모집 증가. 불안정 한 동맥 경 화성 플 라크 파열 수, 혈소판 및 응고 시스템의 대규모 활성화 하 고 그 후 선박5의 폐색을 선도 합니다. 이 심근 경색 이나 뇌졸중 등 심각한 심장 혈관 결과 발생할 수 있습니다. 또한, 백혈구 및 혈소판 (예를 들어, 매트릭스 구성 요소와 부드러운 노출된 혈관 벽 내부에의 상호 작용의 수많은 연결 예: 관상 동맥의 stenting 후 그것으로 내 피 노출 발생 임상, 근육 세포)와 혈소판 혈관 상해 취재와 백혈구의. 이러한 상호 작용은 monocyte 혈소판 상호 작용 neointima 형성6,7드라이브 수 있습니다 질병의 추가 개발을 위한 중요 합니다. 또한, 혈소판-백혈구 상호 작용 백혈구 integrin 맥-1 (αMβ2)에 의해 중재 및 혈소판 GPIbα 최근 쥐8혈전 증의 새로운 드라이버 확인 되었습니다.
연구, 그리고 고립 된 매트릭스 분자의 광범위 한 스펙트럼, 불멸 하 게 세포 백혈구와 혈관 근원의 라인에 대 한 백혈구 및 혈소판의 원천으로 인간과 동물성 혈액의 넓은 가용성을 감안할 때, 그것은 백혈구를 시뮬레이션 가능 설정, 특별히 설계 된 흐름 관류 챔버를 사용 하 여 실험실에서 흐름에서의 상호 작용 많은 변종 접착 관류 챔버 진공 기반에서 지난 수 십년 동안 설계 되었습니다. 모든 이체는 공통점이 움직이지 부분 (예를 들어, 교양된 혈관 세포 또는 매트릭스 단백질)으로 더 큰 누출 방지 챔버를 움직이지 부분에 체액의 관류를 사용 하는 미리 정의 된 채널을 갖춘 조립. 또한, 성형 기술 진보 실리 카 폴리머9기반 맞춤 솔루션의 개발을 사용할 수 있습니다. 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 주로 흐름 관류 장치10의 전단 응력 특성을 결정합니다. 이 문서에서는, 우리는 생체 외에서 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 방법 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생 제시. 여기에 제시 된 방법의 장점은 그들은 일반적인 카메라 연결 된 형광 현미경을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 하 고 높은 기술 능력을 보유 하는 경험을 필요 하지 않습니다. 생체 외에서 시험 (예를 들어, 추가 억제제 또는 항 체를 차단 하 여), 여러 가지 방법으로 조작할 수 있습니다 따라서 혈관 염증의 다른 모델에 적용 그리고 접착의 조사 단백질 기능을 허용 또는 특정 화합물의 평가입니다.

<table><tbody><tr><td>역 형광 현미경 예: EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펌프 예: 모델: 210-CE</td><td>&nbsp; 월드 정밀 기기</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td><td>corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>엘보우 루어 커넥터 남성</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>암 루어 록 커플러</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>플로우 챔버</td><td>대학 병원 RWTH Aachen</td><td></td><td>특허 DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&ouml; mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml; Zelloberfl&auml을 사용하십시오. 첸. 2005년.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ibidi 스티키 슬라이드 VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>스티키 슬라이드용 커버슬립&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 I, 쥐 꼬리</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-&알파;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>펩타이드 6 용 트롬빈 수용체 활성제 (TRAP - 6)</td> <td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 녹색 형광 핵산 염색</td>제 <td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks ' 균형 잡힌 소금 용액 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼 용액 1M, 액체</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE 알부민, 25%&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>주사용 물</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 디하이드레이트</td><td>Merck</td><td>102382&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium (ready-to-use)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>혈관 세포 기저 매체&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 키트-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>기본 인간 대동맥 평활근 세포(HAoSMC)ATCC</td><td></td> <td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>혈관 평활근 세포 성장 키트</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>인간 내피 세포주, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>마우스 내피 세포주, SV 40 형질전환(SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>인간 단핵 세포주, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with Ultra-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monocyte/macrophage RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer 플라스틱 혈액 채취 튜브와 나트륨 Heparin</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 9 ml 9NC 응고 나트륨 시트레이트 3.2%&nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>HCl/EtOH 혼합물(1.2 mol/L HCl 및 50% 에탄올)</td> 물 <td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>흄 후드에서 0.3L HCl(4 mol/L)과 0.7L의 70% v/v 에탄올을 혼합하여 준비합니다.</td><td></td></tr></tbody></table>

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

부상이 나 염증 부상 또는 조직 손상의 사이트에 따라 백혈구의 채용 최근 수십 년 동안 조사 되 고 백혈구 접착 폭포의 개념에 결과 있다. 그러나, 정확한 분자 메커니즘 백혈구 신규 모집에 참여 하지 아직 완전히 확인 되었습니다. 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동) 면역 연구 분야에서 중요 한 주제를 유지, 이후 우리 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 간단한 층 플로우 기반 분석 결과 제시 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생. 생체 외에서 분석 결과 백혈구와 혈관 염증의 다른 모델에서 세포 파트너 간의 상호 작용을 기초 분자 메커니즘 연구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 설명 층 플로우 기반 분석 결과 사용 하 여 병렬 흐름 챔버는 거꾸로 단계 대조 현미경 카메라에 연결 된 백혈구 내 피 세포 및 혈소판, 시각 다음 기록 될 수 있는 상호 작용을 공부 하 오프 라인 분석. 내 피 세포, 혈소판, 또는 백혈구 억제제 또는이 프로세스 동안 특정 분자의 역할을 결정 하는 항 체와 pretreated 될 수 있습니다. 전단 조건, 즉 동맥 또는 정 맥 전단 응력, 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 의해 쉽게 적응 될 수 있다.

공부 하 고 내 피 백혈구 접착, 붙일 레이블된 THP-1 셀 했다 3 다 인/c m2에서 2 분에 대 한 TNFα 또는 비 자극 하는 내 피 단층 위에 끼얹는다. 부착 monocytic 세포의 총 수는 2-6 분 동안 6 독립 필드를 캡처하여 관류의 2 분 후 결정 되었다. 부착 세포 6 사진 거꾸로 위상 대비/형광 현미경 (예를 들어, EVOS FL)으로 캡처한 계량 했다 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라에 연결 된 10 배 확대를 사용 하 고 평균 부착 세포로 표현 되었다 / mm2. TNFα와 내 피 자극 시 THP 1 체포 크게 unstimulated endothelium에 비해 증가. 대표 현미경과의 정량화 단단히 부착 THP-1 비-또는 TNFα-자극 내 피 세포를 그림 1에 표시 됩니다. 혈소판-백혈구 접착 1 다 인/c m2에...

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

이 실험의 전반적인 목표는 유동 조건에서 백혈구와 부착 혈관 세포 또는 혈소판의 상호 작용 뒤에 있는 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이 방법은 백혈구가 염증 부위로 어떻게 동원되는지와 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용 효율적이고 사용자 친화적이며 다양한 실험 조건을 조사할 수 있다는 것입니다.이 방법은 백혈구 부착에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 유동 조건에서 고정된 세포 또는 기질에 종양 세포를 접착하는 것과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실에서 일하는 엔지니어이자 박사 과정 학생인 Annemiek Dickhout입니다.혈액 샘플을 채취한 후 1/15 부피의 산성 시트레이트 포도당을 혈액에 첨가합니다. 다음으로, 350배 g에서 15분 동안 브레이크를 해제하여 혈액 샘플을 원심분리하여 혈소판이 풍부한 혈장을 얻습니다. 그런 다음 얻은 상등액을 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 1/10 부피의 산 시트르산 포도당을 첨가합니다.다시 말하지만, 15분 동안 1, 120회 g에서 브레이크를 해제하여 서스펜션을 원심분리하여 혈소판이 부족한 혈장을 얻습니다. 다음으로 상등액을 버립니다. 다음으로, 넓은 구멍이 있는 파스퇴르 피펫을 사용하여 pH 6.6으로 유지되는 혈소판 완충액에 혈소판 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.그런 다음 1/10 부피의 산성 시트레이트 포도당을 넣고 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 혈소판을 1, 120 회 g에서 15 분 동안 원심 분리하여 펠렛을 형성합니다. 원심분리가 끝난 후 상층액을 버리고 pH 7.5로 유지되는 1ml의 혈소판 완충액에 혈소판을 재현탁합니다.그런 다음 자동 혈액 분석기를 사용하여 1/10 희석으로 혈소판 농도를 측정합니다. 마지막으로, pH 7.5로 유지된 혈소판 완충액으로 세포 수를 조정합니다. 부착 혈소판을 고정하려면 유리 커버슬립을 1.2몰 50% 부피의 염산 에탄올 혼합물에 담그십시오.담근 후 커버슬립을 초순수로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 질소를 사용하여 커버 슬립을 건조시킵니다. 다음으로, 쥐 콜라겐 유형 1 1 밀리리터당 30마이크로그램 100마이크로리터를 사용하여 유리 커버슬립을 사전 코팅합니다.유리 커버슬립을 코팅한 후 실온에서 30분 동안 커버슬립을 배양합니다. 그런 다음 콜라겐 용액을 배출하고 인산염 완충 식염수로 커버슬립을 세 번 씻

laminar-flow-based-assays-to-investigate-leukocyte-recruitment-on

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

혈소판 유착 계단식는 전단 흐름의 존재에서 일어나는, 요인은 종래의 (정적) 잘 철판 assays에서 차지하는 없습니다. 이 문서의 생리 전단 흐름 조건을 에뮬레이트하는 microfluidic 잘 플레이트 형식을 이용한 혈소판 - 집계 분석에 대한 보고서.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

이 비디오는 백혈구와 내피 세포와 같은 세포 파트너의 상호 작용을 특성화하기 위한 층류 기반 분석을 보여줍니다. 이 방법은 혈관 세포의 손상되지 않고 합류하는 층에 관류될 때 백혈구의 접착, 데데젼 및 전이에 대한 동적 통찰력을 제공합니다.

백혈구와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위한 층류 기반 분석

이 비디오는 백혈구 동원에 대한 기질 세포의 영향을 조사하는 방법을 보여줍니다. 평행 플레이트 유동 챔버 모델에서, 전염증성 사이토카인은 내피 세포에 의한 접착 수용체의 발현을 유도하여 호중구 모집 및 이동을 촉진합니다. 기질 세포와 내피 세포 사이의 누화는 내피 세포로의 호중구 모집을 감소시킵니다.

백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

흐름에서 백혈구를 모집 염증이 혈관 내피 세포의 기능은 중간 엽 기질 세포에 의해 조절된다. 우리는 흐름 호중구 모집을 평가하고 간엽 기질 세포가 이러한 과정을 조절하는 것을 재생 역할을 조사하는데 사용될 수있다 일차 인간 세포를 통합 두 시험 관내 모델을 설명한다.

흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

배우세요 층류 유동 기반 분석을 통해 혈관 세포 및 혈소판에 부착하는 백혈구의 상호작용 메커니즘을 조사하는 방법을. 이 비용 효율적이고 사용자 친화적인 기술은 다양한 실험 조건에서 면역학 및 염증 연구에 활용됩니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

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