Name: 육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 학습하세요 육종 환자 유래 이종이식에서 HLA-I 음성 종양 유발 세포를 FACS로 분리하고 특성화하는 방법. 이 기술은 암 줄기세포 연구와 면역 탈출 메커니즘 분석에 활용됩니다.

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이 연구는 NCI-P01-CA087497 (C.C.-C에 의해 지원되었습니다. 및 NIH-U 54-0OD020353 (C.C.C., D.H., J.D.D.), 민첩한 사고 리더 상 (C.C.C.에), 마르텔 재단 (C.C.C.와 J.D.D.).

여기에서 논의된 마우스 실험을 위한 모든 프로토콜은 기관 지침에 따라 및 마운트 시나이 의료 센터 기관 인간 연구 윤리 위원회 및 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 육종 조직 샘플 및 PDX 형성 처리
<ol><li>기관 검토 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 병리학 서비스 직원이 수술 표본에서 육종 샘플을 준비하고 각 샘플을 즉시 100mm 페트리 접시에 얼음에 넣습니다.</li>
	<li>10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토미신으로 보충된 6 mL의 차가운 로스웰 공원 기념 연구소(RPMI) 1640 배양 배지가 있는 15 mL 폴리스티렌 원뿔 튜브에 샘플을 넣습니다. 조직 샘플을 즉시 처리하십시오.</li>
	<li>
(선택 사항) 골육종의 경우 연조직 육종을 건너 뛸 수있는 다음 단계를 따르십시오.
	<ol>
<li>메스를 사용하여 조직을 20mm3 개로 자릅니다. 콜라게나제 용액 3 mL을 함유한 15 mL 튜브로 조직 조각을 옮니다 (RPMI 1640 과 1 mg /mL 콜라게나아제).</li>
		<li>튜브를 37°C의 수조에 넣고 30분 동안 넣습니다.</li>
		<li>튜브를 철저히 소용돌이치며, 10% FBS로 보충된 RPMI 1640 3 mL을 첨가하여 콜라게나제 활성을 중화시다.</li>
		<li>실온에서 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. 상급체를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸균 된 생물 안전 성 캐비닛에서 작업, 100mm 페트리 접시에 조직 샘플을 배치합니다. 500 μL의 멸균 1x 인산완충식염수(PBS)를 조직에 추가합니다. 멸균 메스를 사용하면 눈에 보이는 조직 조각이 0.1 mm보다 크지 않은 때까지 조직을 작은 조각으로 기계적으로 삼각화합니다.</li>
	<li>500 μL 세포 현탁액을 35 μm 셀 스트레이너로 옮기고 50 mL 폴리스티렌 튜브로 여과된 현탁액을 수집합니다. 이 50 mL 폴리스티렌 튜브를 얼음에 셀 현탁액으로 넣습니다.</li>
	<li>조직에 PBS의 또 다른 500 μL을 추가합니다. 2회째, 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 옮기고, 동일한 50 mL 튜브로 수집한다.</li>
	<li>조직 섹션이 완전히 해리 될 때까지이 단계 (단계 1.5-1.6)를 반복, 일반적으로 6 x - 8x.</li>
	<li>실온에서 10 분 동안 350 x g에서 원심 분리에 의해 세포 현탁액을 펠렛. 상복부를 버리고, 용혈 완충액 5 mL (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3및 0.1 mM EDTA)을 사용하여 펠릿을 다시 중단하고 실온에서 5 분 동안 용액을 배양하여 적혈구를 제거하십시오.</li>
	<li>실온에서 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 제거하고 용혈 완충액을 제거하십시오. 5 mL의 PBS로 펠릿을 씻으십시오. 350 x g에서 5 분 동안 다시 원심 분리하고 상류를 제거하십시오.</li>
	<li>PBS의 1 mL로 펠릿을 다시 중단하고 혈세포계 또는 다른 대체 방법을 사용하여 가능한 세포 번호를 계산합니다. PBS의 200 μL에서 1 x 107 세포의 최종 농도로 세포를 희석시다. 셀 서스펜션을 얼음 위에 두십시오.</li>
	<li>녹을 수 있도록 얼음에 지하 멤브레인 매트릭스를 둡니다. 200 μL 세포 현탁액에 지하 멤브레인 매트릭스 200 μL을 추가합니다. 부드럽게 섞어서 얼음위에 보관하세요.</li>
	<li>피하 세포 현탁액을 주입: 지하실 막 매트릭스 (1:1) 그들의 측면에 두 개의 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 혼합물. 각 주입에 대해 200 μL을 사용하십시오.</li>
	<li>일주일에 2회 마우스의 주사 부위를 확인하여 PDX 형성을 모니터링한다. 직경이 1cm에 도달하면 종양 이종이식을 제거하십시오.</li>
</ol>2. PDX에서 FACS에 의한 종양 자극 세포의 격리
<ol><li>앞서12일설명한 바와 같이 마우스로부터 PDX를 외과적으로 제거한다.</li>
	<li>종양을 반으로 자른다. 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 이종이식의 절반을 수정합니다. 이것은 조직학적 분석을 위한 것입니다. 전술한 바와 같이 조직의 나머지 절반을 처리(단계 1.3-1.8) 종양 세포 현탁액을 얻을 수 있다.</li>
	<li>PBS로 펠릿을 다시 일시 중단하고 실행 가능한 셀 번호를 계산합니다.</li>
	<li>5% FBS로 보충된 PBS에서 세포 현탁액을 2 x 106 세포/mL의 농도로 희석시켰다. 30 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 둡니다. 동위원소 제어 및 항체로 튜브를 각각 표시합니다. 각 튜브의 셀 수를 기록합니다.</li>
	<li>5% FBS(1:250)로 보충된 PBS로 항체를 희석시킴으로써 2x HLA-1-PE 항체를 준비한다. 동일한 조건으로 부정적인 등유형 대조군 항체를 희석한다. "항체" 튜브로부터 세포 현탁액을 희석된 항체(1:1)와 혼합하여 최종 항체 희석을 1:500으로 한다. "동위원소 제어" 튜브의 세포 현탁액을 동위원소 대조군(1:1)과 혼합합니다. 90 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 넣어.</li>
	<li>4 °C에서 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상류를 제거합니다. 10 mL의 PBS를 추가하여 펠릿을 2x 씻습니다.</li>
	<li>PBS에 4',6-디아미디노-2-페니린들(DAPI)을 넣고 최종 농도가 10 μg/mL에 추가합니다. 이 DAPI 용액을 세포 펠릿에 추가하여 107 셀/mL의 세포 현탁액을 만듭니다(단계 2.4의 셀 번호를 사용).</li>
	<li>35 μm 스트레이너 캡을 통해 셀 서스펜션을 12mm x 75mm 폴리스티렌 튜브로 필터링합니다.</li>
	<li>유량 세포계를 사용하여 HLA-1 음수 TIC하위 모집단 6을 정렬합니다. 게이트 생존 세포(DAPI-음성)는 HLA-1-음성 및-양성 하위 집단을 2개의 15 mL 수집 튜브로 수집하고, 각각 4 mL의 RPMI 1640 배양 배지를 함유한다.</li>
</ol>3. 종양 을 자극하는 세포의 특성화
<ol><li>사르코스피어 형성
	<ol>
<li>알파-MEM 세포 배양 배지를 사용하여 사르코스피어 성장 배지를 만든다. B-27 보충제 (1x), N2 보충제 (1x), 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) (20 ng/mL), 표피 성장 인자 (EGF) 및 페니실린/스트렙토마이신(100 IU/mL)의 최종 농도를 만들기 위해 보충제를 추가하십시오. 사용하기 전에 0.2 μm 세포 배양 필터로 배지를 걸.입니다.</li>
		<li>2.9단계에서 분류된 HLA-1-음극 및-양성 하위 모집단을 펠렛하고 각 하위 집단의 세포 수를 계산한다.</li>
		<li>1.5 x 106 세포를 15 mL의 유골 성장 배지로 희석하여 1 x 105 세포 /mL의 세포 희석을 만듭니다.</li>
		<li>신선한 사르코스피어 성장 배지로 세포를 연속적으로 희석하여 각 세포 희석액10 4, 103및 102 세포/mL을 희석합니다. 이어서, 세포 희석을 위해 각각 4개의 96웰 초저 부착 세포 배양 플레이트를 준비한다.</li>
		<li>100 μL의 세포 현탁액을 105개의 세포/mL 희석으로부터 제96웰 초저 부착 세포 배양 플레이트의 각 웰로 이송한다. 이 플레이트에는 각 우물에 10개의 4 개의 세포가 있습니다.</li>
		<li>다른 3개의 96웰 초저 부착 세포 배양 플레이트를 사용하여 다른3개의 세포 희석: 10 4, 103,및 102 세포/mL. 96웰 초저 부착 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100 μL의 셀 현탁액을 전달한다. 이 3개의 배양 플레이트에는 각각 1,000개의 세포/우물, 100개의 세포/우물 및 10개의 세포/우물이 있습니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C, 5%CO2 세포 배양 인큐베이터에 넣는다.</li>
		<li>새로운 bFGF 및 EGF를 세포 배양 배지에 직접 첨가(최종 농도 20 ng/mL)을 3일마다 주현탁 배양에서 손실된 세포를 피하기 위해 배지를 변경하지 않고.</li>
		<li>그림 2A와같이 광 현미경을 사용하여 3주 동안 매일 사르코스피어 형성을 모니터링합니다.</li>
		<li>3 주 후, HLA-1 음성 및 HLA-1 양성 세포 모두에 대한 각 세포 희석의 사르코 스피어 양성 웰 및 사르코 스피어 음성 웰의 수를 계산합니다.</li>
		<li>푸아송 확률분포(13)를기준으로 구형 세포 주파수를 계산한다. HLA-1-음성 TICs를 HLA-1 양성 벌크 셀과 비교합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>직렬 희석 종양 형성 분석
	<ol>
<li>2.9단계에서 HLA-1 음수 및 양성 하위 집단을 계산합니다.</li>
		<li>106,10 5, 104,103 세포 / mL의 농도에 PBS와 세포의 직렬 희석을합니다. 10 마우스에서 종양 형성을 위해 각 희석의 1 mL을 사용하십시오.</li>
		<li>각 희석의 1 mL 세포 현탁액에 지하 막 매트릭스 1 mL을 추가합니다 (1:1). 얼음에 각 혼합물의 2 mL을 유지합니다.</li>
		<li>피하 주사 200 세포의 μL: NGS 마우스의 측면에 지하실 막 매트릭스 혼합물, 하나의 측면에 대한 HLA-1 음성 세포를 사용하여 동일한 마우스의 다른 측면에 대한 HLA-1 양성 세포. 희석할 때마다 10개의 마우스를 사용하십시오. 주사를 위해 바늘로 25G 주사기를 사용하십시오.</li>
		<li>종양 성장의 속도에 따라 4~ 8주 동안 마우스에서 종양 형성을 모니터링한다.</li>
		<li>상이한 입력 세포 수에서 종양 형성의 백분율로 종양 을 자극하는 세포 빈도를 계산합니다. HLA-1-음성 TICs를 HLA-1 양성 벌크 셀과 비교합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>중간 엽 통로를 따라 유도된 분화
	<ol>
<li>이전 단계(3.1.9 단계)에 형성된 사르코스피어를 사용합니다. 사르코스피어를 새로운 6웰 플레이트로 옮김. 2.5 mL의 알파-MEM을 사용하여 육액구를 배양하여 10% FBS로 보충하여 세포가 배양 판 표면에 부착할 수 있도록 하였다.</li>
		<li>2일 동안 부착한 후, 배양 배지를 10% FBS로 보충한 알파-MEM에서 10% FBS 및 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 성장 배지로 보충된 알파-MEM 혼합물로 전환하였다.</li>
		<li>이틀 후, 완전한 hMSC 성장 매체로 전환한다.</li>
		<li>세포가 90% 응합에 도달하면 hMSC 배지를 흡인하고 분화 배지를 추가합니다. 골형성 분화를 위해 골생성 분화 배지(hMSC 성장 배지에 10 nM 덱사메타손, 5 mMβ-글리세로포스페이트, 50 μg/mL L-아스코르브산, 10 mMM 염화리튬)를 첨가합니다. 지질 분화를 위해, 지방세포 분화 배지(hMSC 성장 배지0.5 μM 덱사메타손, 0.5 μM 이소부틸메틸산틴, 50 μM 인돔타신)를 첨가합니다.</li>
		<li>3일마다 분화 매체를 변경합니다.</li>
		<li>3 ~4 주 후, 분화를 중지하고 PBS로 세포를 씻어. 이어서, PBS를 흡인하고 고정을 위해 세포에 10% 포르말린의 2 mL를 추가한다. 세포가 실온에서 45 분 동안 앉아있게하십시오. 탈이온수로 씻으십시오. 세포는 이제 알리자린 적색 S 염색(단계 3.3.6.1) 또는 오일 레드 O 염색(단계 3.3.6.2)에 대한 준비가 되었습니다.<ol>
<li>골성 분화를 감지하려면 알리자린 레드 S 염색을 수행합니다. 물을 흡인하고 알리자린 레드 S 작업 용액 2 mL (2 % 알리자린 레드 S, pH 6.0)을 세포에 넣고 염색을 위해 5 분 동안 앉게하십시오. 탈이온수로 세포를 세척하고 미세하게 반응을 관찰하십시오.</li>
			<li>지방 분화를 감지하려면 오일 레드 O 염색을 수행합니다.<ol>
<li>오일 레드 O 솔루션을 확인합니다. 이소프로판올 100 mL에 오일 레드 O 파우더 300 mg을 추가하여 재고 솔루션을 준비하십시오.</li>
				<li>사용하기 전에 2 시간 이내에 오일 레드 O 스톡 솔루션의 3 개 부분 (30mL)을 탈이온 수의 두 부분 (20 mL)과 혼합하십시오. 혼합물을 실온에서 10 분 동안 앉습니다.</li>
				<li>사용하기 전에 사용하여 작업 솔루션을 필터링합니다.</li>
				<li>3.3.6단계에 따라 제조된 세포로부터 물을 제거한다. 세포 단층을 덮기 위해 60 % 이소 프로판올 2 mL을 추가하고 세포를 2 분 동안 앉습니다.</li>
				<li>이소프로판올을 제거하고 오일 레드 O 작동 용액 2 mL를 추가합니다. 세포가 실온에서 5분 동안 앉아 있게 하십시오.</li>
				<li>탈이온수로 세포를 헹구고 가벼운 현미경으로 반응을 관찰하십시오.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

인간 육종 PDXs에서 종양 개시 세포를 분리하고 특성화하기 위하여 이 프로토콜의 성공을 제한하는 몇몇 중요한 단계가 있습니다. 우리는 PDX 대형이 육종 아류형에 매우 의존한다는 것을 관찰했습니다. 조직학적으로 미분화 된 표현형을 가진 임상 적 육종 (예를 들어, 다형성 미분화 육종 [성공률 100%, n = 2], 탈분화 지방 육종 [성공률 100%, n = 2], 및 활액 육종 [ 성공률 100%, n = 3])는 PDX 형성의 높은 성공률을 가지고 있다. 한편, 분화된 표현형(예를 들어, 잘 분화된 지방육종[성공률 0%, n=3])을 가진 육종은 더 낮은 PDX 형성률을 보여준다. 종양 을 자극하는 세포가 덜 악성, 분화 된 아류형보다 더 높은 비율로 더 악성 아류형에 존재할 수 있습니다. 또한, 우리는 세포 생존의 손실을 최소화하기 위해 어떤 정지없이 하루 이내에 종양 을 자극하는 세포 격리 절차를 마무리하는 것이 좋습니다.
우리는 HLA-1 음성 세포가 인간 육종에서 넓게 존재한다는 것을 확인했습니다. 그러나 HLA-1 음성 세포의 백분율은 다른 환자에게서 견본 사이에서 변화할 수 있습니다. 이 방법으로, 우리는 HLA-1 음성 세포가 0.5% 미만에서 30% 12 이상에 구역 수색하는 견본에서종양 자극 세포를 성공적으로 격리했습니다. 단리된 HLA-1-음성 세포의 종양-자극 세포 정체성을 확인하기 위해 구체 형성 및 종양 형성 분석에 의해 HLA-1-음성 세포를 기능적으로 특성화하는 것이 중요하다.
그러나 여기에 제시된 프로토콜에도 제한이 있습니다. 이전 데이터는 HLA-1 발현이 후성유전학적으로 조절되는 것으로 나타났으며, 이는 동일한종양(12)내에서 HLA-1 발현의 세포 이질성의 관찰과 일치한다. HLA-1 게놈 돌연변이는 육종 및 그밖 암 모형에서 검출되었습니다. HLA-1 유전자의 돌연변이는 전체 종양에서 세포 표면상에서 HLA-1의 완전한 손실로 이어질 수 있거나 또는 비기능성 돌연변이 HLA-1을 발현한다. 두 경우 모두, HLA-1 부정성은 종양 내의 TIC를 확인하기 위해 사용될 수 없다.
HLA-1을 음성 마커로 사용하여 다양한 인간 육종 하위 형으로부터 TiC를 성공적으로 분리하고 기능 분석을 통해 결과를 검증했습니다. 따라서, 우리는 이러한 TiCs를 표적으로 하는 특정 처리를 개발하기 위하여, TiCs에 유전자 발현 분석을 포함하여 분자 연구를 능력을 발휘할 수 있었습니다.

인간 암의 종양 내 세포 이질성은 지난 10 년 동안증가 증거에 의해 지원되고있다 1. 정상 조직과 유사하게, 암 조직은 종양 형성 능력을 전시하는 TICs (또한 암 줄기 세포라고도 함)의 작은 소집단으로 구성됩니다; 한편, 암세포의 대부분은 분화된 표현형2를나타낸다. 이러한 TICs는 줄기 세포 마커의 발현 및 자가 재생 및 비대칭 세포 분열의 능력을 포함하는 줄기 세포 유사 특성을 나타내며,따라서, 세포 이종 종양 3의 형성을 시작할 수 있다. 최근 연구에 따르면 TICs는 종양 개시에 대한 책임이있을뿐만 아니라 종양 공격성4,전이5및약물 내성과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 따라서, TICs의 생물학을 이해하고, 따라서, 이 TiCs를 표적으로 하는 특정 처리 전략을 개발하는 것이 중요합니다.
FACS 기반 방법은 CD133, CD24 및 CD441을포함한 TICs 마커를 사용하여 TIC를 식별하는 데 사용되었습니다. 이러한 마커의 대부분은 또한 정상 줄기세포7에서 발현된다. 그러나 이러한 마커 중 어느 것도 전적으로 TiC를 표시하지 않습니다. 이 분자가 TiCs의 악성에서 재생하는 역할은 아직도 명확하지 않습니다. 예를 들어, CD133은 DNA 메틸화에 의해 빈번하게 비활성화될 수 있으며, 따라서, 이러한 종양간 이질성은 이들 마커8의 정확도를 렌더링할 수 있다. ALDH1은 또한 TICs 9의 줄기를 유지하는기능을 하는 마커입니다. 그것은 유방암 TICs를 확인하는 에서 더 효과적인 것처럼 보이지만 그밖종양 모형 9에서 아직도 의심스럽습니다. 몇몇 신호 통로는 Wnt (날개 없는 관련 통합 사이트), TGF-β (변형 성장 인자 베타),및 고슴도치 1을 포함하여 줄기 세포 생물학에 있는 중요한 역할을 합니다. 그러나 이 통로가 TIC 특이적임을 증명하고 1 차적인 종양에서 TiCs를 격리하기 위하여 이 통로의 활동을 이용하기 어렵습니다. 따라서, 신뢰할 수 있는 새로운 TIC 마커가 절실히 필요하다.
HLA-1이라고도 불리는 인간 MHC 클래스 I은 거의 모든 핵세포에서발현되는 세포 표면 단백질(10)이다. HLA-1은 CD8 T 세포(10)에 의해 특별히인식되는 분자를 제시하는 항원으로서의 기능을 한다. CD8 T 세포의 세포독성 효과는 암세포가 HLA-1에 의해 종양 항원을 제시할 때 활성화될 수 있다. 따라서, 암세포의 세포 표면에 HLA-1이 결여되면 세포독성 CD8 T 세포로부터의 면역탈출을 유도할 수 있다. HLA-1의 하향 조절은 인간 암의 상이한 모형에서 기술되고 나쁜 예후, 전이 및 약 저항성11와상관됩니다. 우리는 세포 표면에 HLA-1 발현의 손실이 육종에서뿐만 아니라 전립선 암6,12에서TICs를 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여 주었다.
여기에서는 HLA-1을 음성 마커로 사용하여 FACS에 의한 인간 육종 PDX에서 TiCs를 분리하고 이러한 HLA-1 음성 TICs를 더욱 검증하고 특성화하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &무; m 세포 배양 필터</td><td>ThermoFisher</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 페트리 디쉬</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50mL 폴리스티렌 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96웰 초저 부착 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>D4902</td><td></td></tr>, <tr><td>EGF</td>, <td>인비트로겐</td><td>PHG0311</td><td></td></tr>, <tr><td>HLA-1-PE 항체</td>, <td>Abcam</td><td>ab43545</td><td></td></tr>, <tr><td>hMSC 성장 매체</td>, <td>ATCC</td><td>, PCS-500-030</td><td></td></tr>, <tr><td>인도메타신</td>, <td>시그마-알드리치,</td><td>I7378</td><td></td></tr>, <tr><td>이소부틸메틸크산틴</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>, W292907</td><td></td></tr>형, <tr><td>제어 항체</td>, <td>Abcam</td>, <td>ab103534</td><td></td></tr>, <tr><td>L-아스코르브산</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>A5960</td><td></td></tr>, <tr><td>염화리</td><td>튬, 시그마-알드리치</td>, <td>62476</td><td></td></tr>, <tr><td>마트리겔, 기저막 매트릭스</td>, <td>코닝</td><td>354230</td><td></td></tr>, <tr><td>MEM 알파</td>, <td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NSG 마우스</td><td>The Jackson Lab</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>바늘이 있는 주사기</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-글리세로포스페이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

종양 을 자극하는 세포의 존재와 중요성 (TICs)는 지난 10 년 동안 증가 증거에 의해 지원되었습니다. 이러한 TICs종양 개시, 전이 및 약물 내성에 대한 책임이 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 현재 화학요법 전략 이외에 특정 TIC 표적 치료를 개발하는 것이 중요합니다, 이는 주로 비 TiCs의 대량에 집중합니다. TiCs의 악성 종양 뒤에 있는 기계장치를 더 이해하기 위하여는, 우리는 인간 육종에 있는 TiCs를 격리하고 특성화하는 방법을 기술합니다. 본 명세서에서, 인간 육종의 환자 유래 이종이식(PDXs)을 생성하고 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-1)를 음의 마커로서 사용하여 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 의해 TiCs를 분리하는 상세한 프로토콜을 보여준다. 또한, 구형 형성 분석및 종양 형성 분석법을 포함하는 이러한 TICs를 기능적으로 특성화하고 중간엽 경로를 따라 분화를 유도하는 방법을 설명합니다. PDX TICs의 격리 및 특성화는 잠재적인 표적 치료 시약의 발견을 위한 단서를 제공합니다. 더욱이, 증가하는 기록은 이 프로토콜이 인간적인 암의 그밖 모형에서 TICs를 격리하고 특성화하기 위하여 더 확장될 수 있다는 것을 건의합니다.

인간 육종 PDX가 생성되고 염색되었다. 종양내 이질성은 HLA-1 항체를 이용한 면역조직화학에 의해 나타났다. 이종이식은 HLA-1 양성 및 부정(그림1A)12와같은 두 개의 뚜렷한 하위 집단으로 구성되었다. 육종 PDX는 부모 1 차 종양과 조직학적유사성을 보였다 (그림 1A). 육종 PDX TICs는 FACS에 의해 격리되었다. 이중 선별 방법을 사용하여, HLA-1-음성 세포는 부모 세포 집단으로부터 고도로 농축되었다(도1B)12.
줄기 세포에서 발현된 유전자(예를 들어, Oct4, Nanog, 및 Myc)는 HLA-1 양성 대조군과 비교했을 때 단리된 HLA-1-음성 세포에서 고도로 발현되는 것으로 나타났다(도1C). Sox-9, 유방암과 같은 다른 암 줄기 세포에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 발달 유전자는 HLA-1-음성세포에서 구체적으로 발현되었다(그림 1D).
단리된 HLA-1-음성 하위 집단을 검증하기 위해, 세포의 자가 재생 능력을 조사하기 위해 사르코스피어 형성 분석이 수행되었다. HLA-1-음성 세포는 10개의 초기 입력으로 구를 형성할 수 있었다(도1E)12. 종양 형성 능력을 검사하기 위해, 직렬 희석 종양 형성 분석이 수행되었다. 동일한 수의 HLA-1 음성 및 -양성 세포를 동일한 마우스의 각 측면에 피하 주사하였다. HLA-1-음성 세포는 상당히 높은 종양 형성 능력을 보였으며(도1F)12,HLA-1 음성 및-양성 소집단 모두에 의해 형성된 이종이식은 세포 이질성 종양이었다(도1H).
우리는 단리된 HLA-1 음성 TICs12의유전자 발현 분석을 수행하였다. 정상 중간엽 세포 분화와 관련된 유전자는 TICs12에서상승하였습니다. 따라서, 우리는 또한 HLA-1 TICs가 말단 분화로 유도될 수 있고 감소된 종양 형성 능력을 초래할 수 있는지 시험했습니다. 결과는 HLA-1-음성 세포가 지질 및 골생성 경로를 모두 따라 분화하도록 유도될 수 있고 강한 오일 레드 O 및알리자린 레드 S 염색을 보일 수 있음을 보여주었다(도 1G). 대조적으로, HLA-1 양성 세포는 동일한 조건하에서 분화하지 않는다. 따라서, 이러한 결과는 육종 TiCs를 표적으로 하기 위하여 이용될 수 있는 유망한 차별화된 치료 전략을 표시합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg"> 그림 1: 종양 내 이종 육종 국종 PDXs로부터 HLA-1 음성 세포의 분리. (a) HLA-1-음성 세포(화살표)는 면역화학(IHC)에 의해 인간 육종의 상이한 아류형에서 발견되었다. (a 및 b) 명확한 세포 육종. (c 및 d) 다형성 지방육종. (e 및 f) 레이오묘육종. (g 및 h) 악성 말초 신경 외피 종양. (i 및 j) 지방 육종, 달리 지정되지 않았습니다. (k 및 l) 탈분화 된 지방 육종. 스케일 바 = 100μm. (B) 육종 PDXs는 부모 종양(헤마톡실린 및 에오신[H&amp;E] 얼룩)과 조직학적으로 유사하였고 IHC에 의한 HLA-1 발현에서 세포 이질성을 보였다. 여기에 명확한 세포 육종 (CCS), 탈분화 된 연골 육종 (DCS) 및 탈분화 된 지방육종 (DDL)을 포함하는 육종 PDXs의 대표적인 사진이 도시된다. 스케일 바 = 100μm. (C) HLA-1-음성 세포의 소집단을 이중 정렬 방법으로 유세포측정법에 의해 분리하였다. 위에서 아래로 : 첫 번째 정렬, 두 번째 정렬 및 순도 검사. 단리된 HLA-1 음성 및 HLA-1 양성 세포는 종양 형성 분석을 포함하는 후속 기능 분석을 실시하였다. 이 그림의 결과는 이전 발행물12에서나온 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg"> 그림 2: 기능성 분석에 의한 HLA-1 음성 TICs의 특성화. (a) 구형 분석에서는 10HLA-1-음성 세포가 육종 구체를 형성할 수 있는 것으로 나타났다. 왼쪽: 육종구의 대표 사진. 오른쪽: 구 형성 주파수; 평균 ± SD. 스케일 바 = 100 μm. (B) 육종 PDX로부터 단리된 HLA-1-음성 세포는 매우 종양성이었다. 여기서 도시된 것은 DDL로부터HLA-1 음성 및-양성 세포에 의해 형성된 종양의 대표적인 사진이다. HLA-1 음성 및 HLA-1 양성 DDL 세포의 천 세포를 동일한 마우스의 별도의 측면에 주입하였다. (C) 줄기세포 유전자의 mRNA 수준은 104, Nanog,및 MycHLA-1 양성 세포에 비해 HLA-1 음성 세포에서 더 높은 수준으로 발현되었다. 데이터는 평균 ± SD(n=5)를 나타낸다. (D) 오일 레드 O 및 알리자린 레드 S의 강한 양성 염색은 육종 TiCs로부터 유도되는 지질 및 골생성 경로를 따라 말단 분화를 나타낸다. (E) HLA-1 양성 (왼쪽) 및 -네거티브 (오른쪽) 하위 집단에 의해 형성 된 PDX의 HLA-1 면역 염색. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 결과는 이전 발행물12에서나온 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 형광 활성화 세포 선별에 의한 인간 육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 자극하는 세포의 분리를 위한 상세한 프로토콜을 설명하고, 인간 백혈구 항원-1(HLA-1)을 음성 마커로 사용하고, 추가검증및 이러한 HLA-1 음성 종양 을 자극 하는 세포의 특성.

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

우리는 HLA-I가 줄기 세포 속성 및 종양 시작 용량을 전시하는 암세포의 하위 인구에서 후성 유전학적으로 통제된다는 것을 것을을 발견했습니다. HLA-I 다운규제는 면역 탈출과 직접적인 관련이 있으며, 암 줄기 세포에 대한 생존 이점을 제공하므로 HLA-I 부정성을 이러한 세포에 대한 정확한 기능적 마커로 만듭니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 포스트 닥, Sudeh Izadmehr 될 것입니다.시료를 획득하면 조직을 멸균 된 생체 안전 캐비닛에 100mm 페트리 접시에 넣고 500 마이크로리터의 멸균 PBS를 접시에 넣습니다. 멸균 메스를 사용하여 조각이 0.1 밀리미터보다 크지 때까지 조직을 작은 조각으로 기계적으로 세살합니다. 35마이크로미터 모공 세포 스트레이너를 통해 PBS의 전체 500마이크로리터 부피를 50밀리리터 원유형 튜브로 옮킨다.조직 단편에 PBS의 또 다른 500 마이크로 리터를 추가하고 조직을 다시 다진다. 그런 다음 셀 스트레이너를 통해 상체를 동일한 수집 튜브로 필터링하고 샘플이 완전히 해리 될 때까지 조직 조각을 계속 다진다. 세포의 마지막 부피가 수집되면, 원심분리에 의해 종양 세포를 스핀다운하고, 용혈 완충제의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.실온에서 5 분 후, 다른 원심 분리와 세포를 수집하고 PBS의 또 다른 5 밀리리터와 펠릿을 세척. PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 실행 가능한 세포를 계산합니다. 얼음에 PBS 농도의 200 마이크로 리터 당 일곱 번째 세포에 10 에 10에 세포를 희석하고 부드러운 혼합으로 세포에 지하 막 매트릭스의 200 마이크로 리터를 추가합니다.그런 다음 NOD scid 감마 마우스의 측면에 셀 서스펜션-지하 막 매트릭스를 피하로 주입하고 주 2회 주사 부위에서 종양의 성장을 확인한다. 종양이 직경 1센티미터에 도달하면 종양을 반으로 자르고 조직학적 분석을 위해 하룻밤 사이에 4 %의 파라포름알데히드로 xenograft의 절반을 수정합니다. 종양의 후반을 공정한 바와 같이 단하나 세포 현탁액을 달성하고, 5%의 FBS 농도로 보충된 PBS의 밀리리터 당 6개의 세포로 세포를 2회 10으로 희석시켰다.1개의 등류형 대조군과 1개의 항체 관 사이 세포 현탁액을 분할하기 전에 30 분 동안 얼음에 세포를 유지합니다. 각 튜브내의 세포의 수를 주목하고, 항체 관내세포를 항체 및 동종형 대조관 관내세포와 혼합하여 얼음에 대한 90분 배양에 적합한 항등형 대조군 항체를 갖는다. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 두 세포 집단을 수집하고, 두 개의 10 밀리리터 PBS는 원심 분리에 의해 세서징.두 번째 세척 후, 탄환을 다시 중단 10 밀리리터 당 마이크로 그램 DAPI의 밀리 리터 당 마이크로 그램 10 밀리 리터 농도 당 7 세포에 10. 그런 다음 35 마이크로미터 모공 여과기를 통해 각 세포 현탁액을 개별 12 x 75 mm 폴리스티렌 튜브로 필터링합니다. 형광 활성화 세포 분류 후, HLA-I-음성 및 양성 세포 집단을 10번으로 희석하여 서브세트당 육사권 성장 배지의 15 밀리리터에서 제5 세포 농도로 1회 씩 희석한다.세포를 10대 4, 10대 3, 희석당 15밀리리터에서 10개 농도로 연속적으로 희석하고, 희석당 96-매우 낮은 부착세포 배양플레이트 1개 각각에 각 희석으로부터 100마이크로리터의 셀을 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터5%에 넣고, 광 현미경으로 매일 육각구 형성을 모니터링하고, 3일마다 배지를 변경하지 않고 신선한 기본 섬유아세포 성장 인자 및 표피 성장 인자를 각 웰에 첨가한다. 3주 후, HLA-I-음성 및 HLA-I 양성 세포의 각 세포 희석에 대해 육구 양성 및 육사권-음수 웰의 수를 계산하여 푸아송 확률 분포를 기반으로 구형성 세포 주파수의 계산을 허용한다.전형적으로, 인간 환자 유래 육종 이식은 부모 1 차종양에 의해 입증된 것과 유사한 히스토로지와 함께 두 개의 별개의 HLA-I 양성 및 부정적인 집단으로 구성됩니다. 유언증이 입증된 바와 같이 육종 환자 유래 xenograft 종양 개시 세포의 형광 활성화 세포 분류는 부모 세포 집단으로부터 많은 수의 HLA-I-음성 세포의 농축을 용이하게 한다. HLA-I-음성 세포는 10개의 세포의 초기 입력으로 구체를 형성하고 HLA-I 양성 육종 환자보다 더 높은 종양 형성 능력을 나타낼 수 있다.HLA-I 음성 및 양성 세포의 동일한 수의 주사는 HLA-I-음성 세포가 상당히 높은 종양 형성 능력을 가지고 있음을 보여줍니다. HLA-I 음성 및 양성 하위 인구 모두에 의해 형성된 이종이 이식은 세포적으로 이질적인 종양입니다. 또한, 종양 개시 세포의 유전자 발현 분석은 HLA-I-음성 세포가 줄기 세포 분화 마커를 발현하고 리포겐성 및 골성 경로를 따라 분화하도록 유도될 수 있음을 밝혀, 강한 오일-레드-O 및 알리자린-레드-S 염색 및 배양.이 방법은 다양한 인간 암에서 암 줄기 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 분자 탄화, 예를 들어, 차세대 시퀀싱에 의하면 세포를 치료적으로 표적화하기 위한 일반적인 마커를 드러낼 수 있다. 우리의 발견은 HLA-I의 복원이 기능성 단위 면역 세포 확대 전략의 성공을 위한 중요한 단계이다는 것을 보여줍니다.

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<em&gt; OVO에서</em육종을위한 Xenograftmodel으로&gt; CAM-분석

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육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

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