Name: 단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 배우세요 초파리 애벌레 뇌의 ex vivo 배양 및 단일 세 해상도 형광 타임랩스 이미징 방법을 통해 신경유전학에서 특정 뉴런 집단의 유전자 발현 변화를 장기간 관찰하는 기술을.

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우리는 그의 멘토링에 대 한 마이클 Rosbash를 감사 하 고이 방법의 개발의 초기 단계 지원. 이 작품은 JST 프레스 토 프로그램, 스위스 국립 과학 재단 (31003A_149893 및 31003A_169548), 유럽 연구 회의 (ERC-StG-311194), 노바 티 스 의료 생물 의학 연구 (13A39)에 대 한 재단과 제네바의 대학에 의해 투자 되었다 .

1. 문화 후드 재고 솔루션의 준비
<ol><li>400 mL 슈나이더 활성 매체 (SAM) x 1 (참조24,25수정) 애벌레 머리의 비보 전 문화에 대 한 최적화의 준비 (표 1). 5 mL 및 플래시 약 수-80 ° c.에 저장, 액체 질소 (선2) 고정</li>
	<li>재고 솔루션 (참조26수정) x 10 희석 Dissecting 염 (DSS) x 1을 준비 (표 2).</li>
	<li>Aliquot fibrinogen 10mg을 4 ° c 단일 사용에 대 한 저장소. 주의: 층 류, 장갑, 그것은 유해한 입고 아래 fibrinogen 무게.</li>
	<li>SAM에서 트 롬 빈 재고 솔루션을 준비 (1500 NIH 단위/밀리 그램) 및 10 µ L aliquot, 플래시 LN2 에 고정 시키고-80 ° c.에 주의: 그것은 유해한 트 롬 빈을 처리할 때 장갑을 착용 한다.</li>
	<li>100의 aliquot 재고 솔루션 페니실린 스 x. -20 ° c.에 계속</li>
	<li>소계 (PTFE) 멤브레인의 동그라미를 잘라 (자료 표 참조) 유리 하단 접시의 안쪽에 맞는 크기를. 70%에 그들을 씻어 EtOH와 다음에 압력가 dH2O. Sterilize UV와 층 류에서 건조. 멸 균 페 트리 접시에 계속. 단일 사용 합니다. 참고: PTFE 가스 교환을 허용 하 고 장기적인 기록 중 증발에서 매체를 방지 하는 다공성 유연한 멤브레인입니다.</li>
</ol>2. 시간 경과 현미경 설치
참고: 다음 설치 연동 스캐너 거꾸로 confocal 현미경에 대 한 (자료 표 참조) 갖추고 있다 공명 스캐너 (8000 Hz). 시스템 공명 스캐너 함께 phototoxicity 및 photobleaching를 방지 하는 매우 중요 한 사진 배율 검출기를 포함 되어 있습니다. 온도 및 습도 제어 됩니다 현미경 환경 챔버 내에서 하는 현미경의 대부분을 커버 ( 자료 표참조).
<ol><li>무대-가기 습기 장소입니다.</li>
	<li>25 ° C와 80% 습도에 현미경 챔버 equilibrate를 온도 및 습도 컨트롤러를 켭니다.</li>
	<li>지속적인 암흑 (DD)에서 실험을 수행, (현미경 챔버는 불투명 재료의 만든) 않으면 불투명 천으로 현미경 환경 챔버를 커버.</li>
	<li>물 침수 목표를 사용 하 여 목표 위에 물 침수 마이크로 디스펜서 놓고 하는 동안 시간 경과 영상 일정 한 속도로 물 걸 Autoimmersion 목표 컨트롤러 소프트웨어 프로토콜 프로그램. 참고: 물 디스펜서 또는 건조 렌즈 물 침수 목표는 권장 장기 라이브 이미징, 침수 매체의 다른 유형을 건조 것입니다.</li>
	<li>무대, 습도 챔버 내부에 페 트리 접시 홀더를 배치 합니다.</li>
	<li>현미경 소프트웨어를 실행 하 고 첫 번째 대화 상자에서 스캐너를 공 진 모드를 선택 합니다. 메시지가 표시 되 면 단계를 초기화 하는 확인을 선택 합니다. 구성 탭에 하드웨어 구성 관련 레이저 라인에 스위치를 이동 합니다.</li>
	<li>XY 패널 양방향 모드를 선택 하 고 이미지 수집 매개 변수를 설정 하 고 취득 탭 이동 합니다. 참고: 설명된 영상 설치 여기에 제시 된 (그림 2, 그림 3 과 영화 1) 관찰 circadian 표현의 특정 형광 기자 최적화 됩니다. 다음 매개 변수는 가장 우리의 사양에 맞게 선정 됐다: 40 X 물 침수 목표, 8 X 선 평균 512 × 512 이미지 해상도. 멀티 컬러 이미징에 대 한 순차적 이미지 수집이 필요한 때 한 fluorophore와 다른 중복 (여기, 노란 형광 성 단백질 (YFP) 방출 및 토마토 여기 오버랩의 파장)의 여기 파장의 방출 파장. 그것은 빠른 고 Z 스택의 인수 중 시계 뉴런의 이동은 무시할 수 "스택" 사이 순차 모드를 선택 합니다. 현미경 설정을 각 실험의 목표에 맞게 적응 해야 합니다.</li>
</ol>3입니다. 애벌레 두뇌 Explant 문화의 설치
참고: 뇌 explants의 포함 해 부에서 전체 절차 ~ 30 분 걸립니다.
<ol><li>
문화 후드 시 약의 준비입니다.
	<ol>
<li>트 롬 빈의 약 수를 해 동 하 고 (3.3 단계) 포함 단계까지 실내 온도에 유지. 단일 사용 합니다.</li>
		<li>37 ° C에서 샘의 약 수를 빠르게 해 동 하 고 단일 사용에 대 한 얼음에 계속.</li>
		<li>10 mg/ml fibrinogen의 약 10 밀리 그램 수로 샘을 추가 하 고 부드럽게 터치 포함 단계 (단계 3.3) 및 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 사용 합니다. 참고: 않습니다 하지 품 어 2 h 이상 fibrinogen 솔루션 유해를 시작으로.</li>
		<li>100 x 재고 페니실린 스의 약 수 동 1 샘의 2.5 mL 준비 페니실린-스 (샘/항생제) x. 실내 온도에서 보관. 참고: 저장소 나머지 100 x 재고 페니실린 스 4 ° C에서 1 달까지.</li>
		<li>나머지 샘에서 500 µ L의 약 수를 준비 합니다. 얼음에 계속.</li>
		<li>장기적인 이미징에 대 한 유리 하단 접시 (그림 1A)의 바닥의 플라스틱 부분에 압력가 진공 그리스를 적용 하 고 UV 층 류에서 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
중앙 신 경계와 복 부 신경 코드 절 개가 고
	<ol>
<li>청소는 집게와 2 x 3-잘 유리 해 부 요리 70 %EtOH. 4 우물에 DSS의 400 µ L와 한 우물에서 샘의 400 µ L를 붓는 다. 얼음에 계속.</li>
		<li>애벌레를 포함 하는 비행 중간에 밖으로 푸 고 집게와 방황 아닌 3 탈피 애벌레 (L3)를 선택. 2 DSS 가득 우물에 그들을 연속적으로 린스. 3 DSS 가득 잘 애벌레 anesthetizes 얼음에 그들을 유지. 참고: L3 지속 25 ° c.에 약 2 일 순수 관련 기간에 뇌를 관찰 하 우리는 방황 아닌 L3 유 충을 사용 하기로 결정 했다. L-LNvs, DN3s, 등 시계 뉴런의 다른 하위 방황 L3 단계에서 형성 시작 하지만 그들은 반드시 자전거 아직 (데이터 표시 되지 않음). 따라서, 이미지 수 시계 뉴런 (데이터 표시 되지 않음),이 단계에서 사이클링 그것 이지만 신중 하 게 데이터 분석에 대 한 개발에서 이미 기능 애벌레 시계 신경 세포를 구별 하는 것이 중요 합니다. 비 방황 L3 25 ° c.에 누워 계란 후 약 4.5 4 일 표시 이 프로토콜을 사용 하 여 circadian 리듬을 공부, 하려면 동기화 (끌고가 다)에서 12 h/12 h LD 개발 애벌레 L3 애벌레를 수집 하기 전에 3 일 동안 25 ° C에서 주기.</li>
		<li>4 DSS 가득 잘, 애벌레,27내부 메서드 사용 하 여 세 정을 위해 사용 되지 않은 어떤 좋은 집게와 애벌레 두뇌를 해 부.<ol>
<li>간단히, 유 충 2에, 부드럽게 입 고리 집게의 쌍 꼬집어 잘라내어 집게, 따라서 뇌를 노출의 다른 쌍을 사용 하 여 몸 벽 내부를 롤. 모든 기도는 시체의 나머지 부분에 연결 된 신경을 절단 하 여 뇌를 무료.</li>
			<li>20 µ L 피 펫 (DSS 미리 씻어 서)와 DSS의 약 3 µ L에서 뇌를 발음 하 고 샘 가득 잘에서 분배. 최대 7 두뇌에 대 한 절차를 반복 합니다. 주: 해 부 취 애벌레 및 냉장 두뇌 차가운 표면에 수행 되어야 한다. 예를 들어 얼음 냉장 물 순환 펌프에 연결 된 냉각 블록에 해 부 접시를 놓습니다. 해 부 절차 소요 ~ 30의 뇌 당. 그것은 두뇌와 그대로 복 부 신경 코드에 연결 된 눈/더듬이 imaginal 디스크를 유지 하는 것이 중요입니다. 이러한 부분을 찢 어 두뇌를 손상 하 고 문화의 질을 줄일 것입니다. 또한, 공기에 머리를 노출 하지 마십시오. 첫 번째 뇌 해 부 애벌레의 부분을 포함 하는 DSS 위아래로 피 펫을 발음 하기 전에 그것으로 두뇌에서 방지 팁의 벽에 고정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 차원 매트릭스에 장착 (~ 20 분) 뇌 explants의 포함.
	<ol>
<li>잠수함 fibrinogen 작업 솔루션 (fibrinogen 최종 농도 ~3.3 mg/mL, 뇌 당 10.5 µ L)에서 해 부 두뇌 다음과 같습니다.</li>
		<li>(동일한 팁 섹션 3.2.3에서에서 사용)와 샘/항생제의 3.5 µ L 발음. 동일한 피 펫 팁으로 잘 해 부 해 부 두뇌에 있는 샘/항생제 매체를 분배 하지 않고 발음.</li>
		<li>분배는 두뇌와 멸 균 페 트리 접시의 뚜껑에 매체. 두뇌를 포함 하는 드롭에 샘/항생제의 또 다른 3.5 µ L와 따뜻한 fibrinogen/샘 10 mg/mL 해결책의 3.5 µ L를 추가 합니다. 20 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 뇌 주변의 솔루션을 부드럽게 혼합. 참고:이 단계에서 겸 자 보다는 피 펫을 사용 하 여 강조 하는 두뇌 피 한다.</li>
		<li>2 µ L에서에서 fibrinogen 작업 솔루션의 고 작은 원으로 유리 하단 접시의 coverslip에 적용. 트 롬 빈의 0.8 µ L을 추가 하 고 피 펫 팁 매우 신속 하 게 혼합. fibrinogen 섬유 소에 변환 되 고 유해 하기 시작.</li>
		<li>두뇌 fibrinogen 작업 솔루션 (단계 3.3.1) 집게의 쌍 사이에서 앉아 고 섬유 소의 흰색 매트릭스 표시 되는 행렬에 위치. (시계 신경 세포 이미징)에 대 한 뇌 앞쪽 측면 아래로 동양. 밀어 최대한 가까이 커버 유리에. 섬유 소 응고 섬유 소의 레이어의 구성 됩니다. 한 레이어를 선택 하 고 매트릭스를 분리 하지 않고 작고 부드러운 움직임을 뇌 위에 접어.<ol>
<li>뇌를 안정 시키기 위해 응고의 다른 부분에서 2 ~ 3 회 반복 합니다. 참고: 때 집게와 두뇌를 처리, 건조 또는 물리적 스트레스 부과 주의 해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>트 롬 빈의 행동을 막으려고 포함된 뇌 위에 샘/항생제의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>나머지 머리를 탑재 하는 절차를 반복 합니다. 그것은 최대 5 유리 하단 접시에 6 두뇌를 포함 수 있습니다.</li>
		<li>장기 라이브 이미징에 대 한 내부 잘 (유리 부분)에서 샘/항생제의 600 µ L를 추가 합니다. 매체 위에 미리 잘라 PTFE 멤브레인을 하단 (3.1.5) (그림 1A)의 플라스틱 부분에 적용 하는 진공 그리스에 그것을 막대기.</li>
		<li>약리학 적인 분석에 대 한 샘/항생제 (그림 1B)의 2 개 mL로 접시를 채우십시오. 매체의 osmolality은 신경 세포의 생존에 중요 한 참고: 그것을 매체의 증발을 피하기 위해 매우 중요 하다. 따라서, 장기 이미징 실험에 대 한 그것은 문화 접시 PTFE 막으로 밀봉 하는 데 필요한입니다. 반면 단기 실험, 멤브레인 씰링 필요 하지 않습니다 접시 중간의 2 개 mL 가득 고 습도 챔버에 모니터링.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 시간 경과 이미지 수집
<ol><li>페 트리 접시 홀더 무대 최고 습도 챔버 내부에 유리 바닥 접시를 놓습니다.</li>
	<li>인식 탭에서 z-스택 패널에가 고 현미경 소프트웨어 (2 µ m × 40에서 그림 2 와 그림 3, 영화 1에 표시 된 실험)에서 z-섹션 단계를 설정. coverslip와는 coverslip 가까이 뇌 explant의 표면에 끝에서 멀리 비행기에서 z 스택의 시작 부분을 설정 합니다. 비록 뇌 움직임 무시할 수 있습니다, 그리고 시작 및 z 스택의 끝 부분에서 여분의 z-섹션 추가.</li>
	<li>마크 & 패널 설정 다 위치 이미지 수집을 찾을로 이동 합니다. 40 X 목표 1 두뇌 반구 보기의 필드 내에서 캡처할 수 있습니다.</li>
	<li>수집 모드 패널 및 선택 xyzt (z-스택 시간 경과)로 이동 합니다. 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 주파수 매개 변수 설정. 참고: 원하는 주파수와 시간 경과 이미지를 취득 합니다. Note 시간 경과 간격 2 시간 보다 짧은 장기 라이브 영상 (24-72 h) 적은 자전거 신경에 있는 결과 경향이 아마도 때문에 뉴런의 생존 능력을 감소 시킨다. 데이터 볼륨 확장 시키는 데이터 분석 및 저장 더 도전 이미지 수집 증가의 비율으로.</li>
</ol>5. 약리 치료 단기 라이브 영상으로 뇌 Explants의
참고: 다음 절차는 본질적으로 동일 장기 이미징에 대 한 하지만 PTFE 멤브레인을 필요 하지 않습니다. 화학 물질 문화에 추가 될 때 빛을 파랑 머리 노출 피하려고 현미경 붉은 빛으로 어두운 방에 두어야 한다.
<ol><li>시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 약물 응용 프로그램 전에 초기 계획 데이터를 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다.</li>
	<li>베이스 후 검사가 완료 되 면, 현미경 시스템의 스캔 헤드를 리프트. 무대 최고 습도 컨트롤러의 뚜껑을 제거 하 고 매우 신중 하 게 그것을 이동 하지 않고 유리 하단 접시의 뚜껑을 제거 합니다.</li>
	<li>필요한 경우 적절 한 양의 문화 매체를 제거 합니다. 매체에서 실험적인 솔루션을 추가 하 고, 신중 하 게, 아주 부드럽게 조화를 살 균 파스퇴르 피 펫 두뇌 explants 건드리지 않고. 참고: PDF의 목욕 용, (10 %DMSO)에서 2 µ M PDF 재고 솔루션을 사용 합니다.</li>
	<li>유리 바닥 접시와 습 한 챔버 스캔 머리 뚜껑을 교체 합니다. 사용 하 여, 현미경 챔버 주위 검은 불투명 천으로 재조 정할.</li>
	<li>라이브 스캔 모드에서 그들의 원래 위치에서 두뇌 인지 확인 하십시오. 필요한 경우 조정 합니다.</li>
	<li>시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다. 참고: 여기 우리가 테스트 시간 경과 이미지 최대 10 h에 대 한 모든 시간을 획득.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리 교양된 애벌레 머리의 장기 형광 시간 경과 현미경에 대 한 방법을 설명합니다. 이 유형의 실험의 성공에 따라 달라 집니다 문화, 건강 등의 여러 요소 두뇌 explant, 형광 강도 및 기자, 시간적 및 공간적 해상도의 신호 대 잡음 비율의 동원 정지를 위한 방법 및 explant에 대 한 접근 이러한 요소는 상호 배타적 될 수 있습니다. 예, 문화, 건강에 영향을 미치는 시간 경과 주파수를 증가 하 고 뇌 explant의 동원 정지 가스 교환을 방해 수도. 따라서, 연구에서 현상에 대 한 (말 장난 의도) 중 찾는 성공적인 프로토콜 열쇠입니다. 여기 설명 하는 방법은 일 시간 규모에서 형광 circadian 기자의 식 모니터링 최적화 됩니다. 그것은 또한 중요 한 프로세스는 불변 하 고 주의 실행 초파리 신경 생물학에 다른 과목 공부에 적용 됩니다.
이 프로토콜에서 뇌 explants는 3D 매트릭스를 생성 하는 섬유 소 응고에 움직일 수 있습니다. ...

Circadian 시계 도움이 지구의 24 시간 회전에 의해 생성 된 주기적인 환경 변화에 적응 하는 생물. 연동된 transcriptional 변환 피드백 루프는 일반적으로 종1에 걸쳐 circadian clock의 분자 기계를 기반이 됩니다. Circadian 심장 박 동기 회로 구성 포함 하는 클록의 명암 (LD) 등 통합 하는 매일의 과다의 리듬을 온도 사이클 환경 단서에 의해 전달 하는 일의 시간 정보를 통합 하는 신경 생리와 행동 프로세스2,3. 신경 입력 / 출력을 갖는 분자 리듬의 조정 circadian 회로 하지만 부분적 으로만 이해 하는 남아의 작업에 대 한 비판적으로 중요 하다.
초파리, 분자 시계의 코어에 클록/사이클 (CLK/CYC) heterodimer 활성화 기간 (당)의 전사와 영원한 (팀). 당 및 팀 복합물을 형성 하 고 그들은 CLK/CYC 그리고 결과적으로 그들의 자신의 전사의 transcriptional 활동을 억제 핵를 입력 합니다. Post-transcriptional 및 포스트 번역 상 규정 CLK/CYC-중재 전사와 당에 의해 억압 사이 지연이 발생할 / 팀, 24 h 분자 진동1,,34 년경의 세대를 보장 . 이러한 분자 시계 폼을 포함 하는 약 150 신경 성인 circadian 동작을 제어 하는 회로5를이동 합니다. 훨씬 더 간단한 아직 완전 하 게 작동 circadian 회로-5 복 부 측면 뉴런 (LNvs; 4 PDF 확실성 LNvs 및 하나의 PDF 음수가 LNv, 아래 참조), 2 등 쪽 신경 1 (DN1s)과 2 등 쪽 신경 2s (DN2s)-시계 뉴런의 3 그룹의 구성 된는 애벌레에 존재 하는 뇌6,7.
간단한 애벌레 circadian 회로 간 신경 통신 및 분자 시계 사이의 상호 작용을 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 우리의 새로 개발된 된 형광 기자 당-TDT를 단백질의 subcellular 위치 당의 수준, 모방을 사용 하 여 우리 하고자 했다 애벌레 circadian 회로 에 다른 시계 신경 하위 그룹에 분자 시계의 역학 특성 8. 또한, 4 LNvs 신경 레벨9,,1011circadian 리듬을 조절에 의해 생산 하는 neuropeptide 안료 분산 요소 (PDF)의 핵심적인 역할을 알고, 우리가 하 고 싶 었 직접 검사 분자 시계에 PDF의 효과입니다. 이 위해, 우리는 애벌레 뇌에서 리듬 시간 경과 confocal 현미경 검사 법에 의해 여러 일 동안 explant circadian 유전자 발현을 모니터링 하는 방법을 개발 했다. 프로토콜 당 TDT의 수준에 PDF 또는 다른 화합물의 효과 테스트 하는 약리 분석 실험에 대 한 적응도 했다. 따라서, 적응 뇌 explant 문화 약물 응용 프로그램에 액세스할 수 만들기, 시간적 해상도 증가 하 고 짧은 기간에 대 한 이미징 구성 되어 있습니다.
다른 발달 단계에의 초파리 두뇌의 비보 전 문화 이전 설립된12,13,,1415,16,17 되었습니다. ,18. 반면 이러한 프로토콜 이미징 다양 한 생물학 현상에 대 한 사용 되었습니다, 그들 중 일부는 단일 셀 해상도 이미지와 호환 되지 않는 또는 몇 시간에 대 한 문화를 지원 하지 않습니다. 초파리 에서 circadian 뉴런의 장기 라이브 영상을 수행 하는 대체 방법을 분자 리듬19,,2021 의 생물 발광 영상 등의 형광 이미징 칼슘 표시기 빛 시트 현미경22,23. 생물 발광 영상 더 높은 시간 해상도 얻을 수 있지만 가벼운 시트 현미경 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 적응 하실 수 있습니다 그들은 공간 해상도에 제한 되 고 특수 현미경 시스템 필요.
여기 설명 하는 방법은 여러 일 동안 단일 셀 해상도에서 전체 뇌 문화에 형광 신호를 시각화 하기 위해 지어진 다. 이 손쉬운 방법과 다양 한 교양 이미지 성인 비행 두뇌와 초파리 신경 생물학에 있는 많은 다른 문제를 연구 하는 약리 실험에 대 한 적응 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>실험실에 있는 것과 정확히 같은지 확신할 수 없습니다. 가능한 한 "곤충 세포 배양에 적합"을 선택했습니다</td></tr>. <tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) 포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>시그마-알드리치</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-트리스</td><td>시그마-알드리치</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&마이너스;)-사과산</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-트레할로스 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>숙신산</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>푸마르산</td><td>시그마-알드리치</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&알파;-케토글루타르산</td><td>시그마-알드리치</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>비열 불활성화, 태아 송아지 혈청(FCS) 마이코플라스마 및 바이러스 스크리닝</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>소 혈장에서 추출한 피브리노겐</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>주의: 흡입, 피부 접촉 및 삼키면 유해합니다. </td></tr><tr><td>소 플라즈마의</td> 층류 트롬빈 조작 <td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>주의: 건강 위험, 장갑</td></tr><tr><td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35mm 접시, No. 1.5 커버슬립, 20mm 유리 직경, 코팅되지 않은</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>멸균 500 mL Steritop-GP 33 mm 나사형 병 상단 필터, 0.22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 필름</td><td>Dupont</td><td>200A 테플론 FEP 필름</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV 주사기 필터 유닛, 0.45&nbsp; &마이크로; m, PVDF, 33&nbsp; mm, 감마 멸균</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 주사기 필터 유닛, 0.22&nbsp; &마이크로; m, PVDF, 33&nbsp; mm, 감마 멸균</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>3웰 유리 해부 접시</td><td>Any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine typs, size 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>탠덤 스캐너 도립 TCS SP5 컨포칼 현미경, 공진 스캐너 및 HyD 광전자 증배관 검출기 포함</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>온도 제어 챔버</td><td>라이프 이미징 서비스</td><td>The CUBE & BOX 온도 제어 시스템, 맞춤형 설계</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 상단 습도 컨트롤러</td><td>라이프 이미징 서비스</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>침수 마이크로 디스펜서: 디스펜서, 확장 마이크로 펌프 MP6 시리즈 및 자동 침수 목표 컨트롤러 소프트웨어</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUM-stack 생성 및 3D 보정 드리프트 플러그인</td><td>ImageJ 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x 반복 디콘볼루션</td><td>AutoQuant 및 Imaris 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 circadian clock의 이미징

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Circadian 맥 박 조정기 회로 리듬 행동과 생리 적인 출력 일 또는 밤 주기 등 환경 신호 조정 총괄. 각 맥 박 조정기 뉴런 내에서 분자 시계 유전자 발현, 기초 회로의 작동에 필수적인 리듬 신경 기능에에서 circadian 리듬을 생성 합니다. 맥 박 조정기의 다른 서브 클래스에서 개별 분자 발진기와 신경 신호와 상호 작용의 속성의 조사 circadian 맥 박 조정기 회로의 더 나은 이해를 생성 합니다. 여기, 우리 제시 시간 경과 형광 현미경 접근 시계 교양된 초파리 애벌레 두뇌의 신경에 있는 분자 시계를 모니터링 하기 위해 개발. 이 메서드는 단일 셀 해상도 유전자 인코딩된 형광 circadian 기자의 리듬의 여러 날 녹음을 수 있습니다. 이 설치 밀접 하 게 다양 한 화합물의 분자 시계 실시간 응답을 분석 하는 약리 조작 결합 될 수 있다. Circadian 리듬, 넘어 강력한 초파리 유전자 기술 함께에서이 다목적 방법 라이브 뇌 조직에서 다양 한 신경 분자 과정을 공부 하는 가능성을 제공 합니다.

여기, 우리가 애벌레 뇌 문화 비보 전 기자 식에 PDF 목욕 응용 프로그램의 라이브 이미징 결과에 circadian 형광 기자의 장기 기록의 대표적인 결과 보여줍니다.
비 방황 L3 유 충 분자 시계 기자 당 TDT와 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (그림 1C) LD. 두뇌에서 개입 했다 시계 신경 드라이버에 의해 구동 해 부 되었고 마지막 동안 장기 문화에 대 한 설정 그냥 사전 LD 주기의 단계 빛 어두운 단계 (그림 1A 와 2B). 시간 경과 영상 DD에서 수행 하 고 뇌 explants 64 h에 대 한 모든 2 h 몇 군데 있었다. 관심의 뉴런을 포함 하는 합계 ...

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

이 절차의 전반적인 목표는 수일 저속 형광 현미경 검사를 위해 초파리 유충 뇌를 배양하는 것입니다. 이 방법은 특정 신경 세포 집단에서 발생하는 유전자 발현 변화와 같은 초파리 신경 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 몇 시간에서 며칠 동안 살아있는 뇌에서 단일 세포 해상도로 형광 프로브를 이미징할 수 있다는 것입니다.이 절차를 위해 시약을 준비할 때는 배양 후드 아래에서 작업하십시오. SAM 배지와 트롬빈의 분취액은 모두 해동되어야 합니다. 트롬빈은 따로 보관하십시오.SAM 분액 2.5ml를 얼음 위에 올려 놓고 따로 보관합니다. 그런 다음 분주된 SAM에 페니실린 스트렙토마이신을 넣고 실온에 보관합니다. 장기적인 이미징 실험을 위해 이미징 챔버를 준비하고 유리 바닥 접시의 웰 주변의 플라스틱 영역에 오토클레이브 진공 그리스를 바르십시오.그런 다음 후드 아래에서 자외선으로 기름칠한 접시를 살균합니다. 이제 SAM의 분취액을 피브리노겐에 혼합하고 혼합물을 섭씨 37도로 옮기면 2시간 동안 중합되지 않습니다. 해부를 위해 70% 에탄올이 함유된 2개의 3웰 유리 해부 접시에서 집게를 청소합니다.그런 다음 4개의 웰에 400마이크로리터의 DSS를 로드하고 1개의 웰에 400마이크로리터의 SAM을 로드합니다. 해부 접시는 식힌 접시에 보관하십시오. 번식하는 파리가 담긴 유리병에서 돌아다니지 않는 세 번째 인스타 유충이 들어 있는 배지를 퍼내고 집게로 최대 7개까지 차가운 DSS 우물로 옮깁니다.그런 다음 유충을 DSS가 적재된 4개의 우물 중 3개에 통과시켜 청소합니다.해부될 때까지 마지막 우물에 그대로 두십시오. DSS의 네 번째 우물을 사용하여 한 쌍의 깨끗하고 미세한 집게로 유충의 뇌를 해부합니다.잘 정립된 인사이드 아웃 방법을 사용합니다. 숙련도가 있으면 각 유충을 약 30초 안에 처리할 수 있습니다. 각 해부 후 DSS로 미리 헹궈진 20마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 약 3마이크로리터의 DSS에 담긴 뇌를 SAM이 채워진 우물로 옮깁니다.임베딩 절차를 위해 최대 7개의 뇌를 준비합니다. 뇌를 작동 용액으로 옮긴 후 뇌와 배지를 멸균 페트리 접시의 뚜껑에 분배합니다. 그런 다음 항생제가 든 SAM 3.5마이크로리터를 더 넣고, 피브리노겐이 든 따뜻한 SAM 3.5마이크로리터를 추가합니다.시술 내내 피브리노겐이 포함된 SAM 배지를 37도로 유지하는 것이 중요합니다. 다음으로, 동일한 피펫 팁으로 부드럽게 피펫팅하여 뇌 주위에 용액을 혼합하고 용액 2마이크로리터를 흡인하여 유리 바닥 접시의 커버슬립에 증착합니다. 그런 다음 0.8 마이크로 리터의 트롬빈을 방울에 넣고 매우 빠르게 혼합하여 중합을 초기화하면 흰색으로 나타납니다.그런 다음 집게를 사용하여 뇌를 부드럽게 선택하고 중합 피브린 매트릭스에 놓습니다. 뇌가 물방울로 옮겨진 후 트롬빈은 많은 절차를 복잡하게 만들기 때문에 권장하지 않는다고 생각합니다. 필요에 따라 뇌의 방향을 잡고, 뇌를 커버슬립에 최대한 가깝게 아주 부드럽게 밀어 넣는다.그런 다음 중합된 피브린 층을 선택하고 매트릭스를 분리하지 않는 작고 부드러운 움직임을 사용하여 뇌 위에 접습니다. 뇌를 안정시키기 위해 혈전의 다른 부분에서 뇌 위로 중합된 피브린 층을 계속 접습니다. 그런 다음 항생제가 든 SAM 20마이크로리터를 내장된 뇌에 주입하여 트롬빈 활동을 중단시킵니다.이 절차를 사용하여 유리 바닥 접시에 5-6개의 뇌를 삽입하는 작업을 진행합니다. 장기 이미징을 위해 내장된 뇌를 항생제가 든 600마이크로리터의 SAM에 담그십시오. 그런 다음 매체 위에 PTFE 멤브레인 조각을 놓고 멤브레인의 가장자리를 접시의 기름칠한 부분에 붙입니다.간단한 분석을 위해 접시에 항생제로 2ml의 SAM을 채우고 뇌를 담그고 PTFE 멤브레인을 사용하지 않습니다. 설명된 절차를 사용하여 시계 뉴런 드라이버에 의해 구동되는 분자 시계 리포터를 발현하는 뇌를 명암 속에 혼입한 후 이식 배양으로 준비했습니다. 장기 배양은 어두워지기 직전인 밝은 단계에서 설정되었습니다.관심 뉴런을 포함하는 SUM-stack은 배경 빼기 후 측정된 뉴런에 해당하는 영역의 평균 형광 강도에서 생성되었습니다. 리포터 표현의 리듬성을 결정하기 위해 최대 엔트로피 스펙트럼 분석과 수동 검사가 모두 사용되었습니다. 다음으로, 동일한 유전자형의 유충을 주관적 새벽 1시간 후 또는 주관적 황혼 1시간 후에 해부했습니다.기준선을 얻기 위해 한 시간 이내에 뇌를 두 번 이미지화했습니다. 그런 다음 PDF 또는 차량을 배양 배지에 추가하고 뇌를 6시간 동안 매시간 이미지화했습니다. 어두워진 직후 채취한 뇌에서 LNvs의 PER-TDT 발현 프로파일은 PDF 추가 시 형광 강도가 하루 따라 증가하는 시간을 보여주었습니다.이것은 DN1에서도 발생했으며 DN2에서도 덜 발생했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 피브린의 3D 매트릭스를 사용하여 초파리 유충에서 생체 외 뇌 배양을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 해부에서 삽입까지 전체 절차가 약 30분 정도 걸립니다.해부를 시작하기 전에 이미징 설정을 준비하여 삽입 직후 뇌를 이미지화할 수 있습니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 형광 타임 랩스 이미징을 위해 성인 초파리 뇌를 배양할 수도 있습니다.

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

출처: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. 초파리  애벌레 뇌의 일주기 시계의 단일 세포 해상도 형광 라이브 이미징 문화. J. Vis. 특급 (2018).   이 동영상은  초파리 뇌를 섬유소 매트릭스에 삽입한 다음 일주기 시계 뉴런의 저속 형광 이미징을 통해 명/암 주기와 동기화된 리듬 활동을 분석하는 절차를 보여줍니다.

일주기 시계 뉴런의 타임랩스 이미징을 위한 매트릭스에 초파리 뇌 내장(Embedding Drosophila Brain in a Matrix for Time-Lapse Imaging of the Circadian Clock Neurons)

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

여기에서는 Drosophila 애벌레 뇌의 실시간 준비에서 매우 운동성 수지상 필로포디아를 이미지화하기 위해 사용한 방법과 수상돌기의 정량적 평가를 위해 시간 경과 3D 이미징 데이터 세트를 정량화하기 위해 개발한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 개발에 역학.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

여기에서 우리는 생리학적 조건에서 세포 및 세포 내 역학을 관찰하기 위해 Drosophila melanogaster 세 번째 instar 유충에서 살아있는 외식편 뇌를 준비, 해부, 장착 및 이미지화하는 워크플로에 대해 논의합니다.

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

배우세요 초파리 애벌레 뇌의 ex vivo 배양 및 단일 세 해상도 형광 타임랩스 이미징 방법을 통해 신경유전학에서 특정 뉴런 집단의 유전자 발현 변화를 장기간 관찰하는 기술을.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

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