네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여

이 절차의 전반적인 목표는 특정 게놈 위치에서 히스톤 마크의 농축을 식별하는 것입니다. 이 방법은 히스톤 변형을 변경하는 후성유전학적 조절인자의 돌연변이가 종양 세포 전사체에 미치는 영향과 같은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 가교되지 않기 때문에 보다 자연스러운 상태에 있어 항체 특이성을 도울 수 있다는 것입니다.

10cm 페트리 접시에 담긴 쥐의 뇌에서 실험적으로 유도된 종양을 해부하는 것으로 시작합니다. 종양이 형광 단백질을 발현하는 경우, 적절한 형광 채널로 설정된 형광 해부 현미경을 통해 0.3배 배율로 종양을 시각화합니다. 메스와 집게를 사용하여 정상 뇌에서 종양 조직을 분리하고 페트리 접시에서 종양을 작은 조각으로 다집니다.

절개된 종양을 300마이크로리터의 NSC 배지가 있는 1.5ml 튜브로 옮기고 일회용 주사기를 사용하여 종양을 부드럽게 균질화합니다. 그런 다음 1ml의 세포 분리 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 70미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50ml 원심분리 튜브에 통과시킵니다.

그런 다음 스트레이너를 NSC 배지 25ml로 세척하고 실온에서 5분 동안 300배 G로 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅한 후 펠릿을 6ml의 NSC 배지에 다시 현탁시키고 종양 세포 현탁액을 T25 배양 플라스크로 옮깁니다. 신경구가 형성될 때까지 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 공기 95%와 이산화탄소 5%의 대기로 세포를 배양합니다.

신경구를 수확하면 5분 동안 300배 G로 아미노 침전당 6개의 신경권 세포에 10배의 원심분리를 합니다. 원심분리 후, 상층액을 디캔팅하고 신경구 펠릿을 1ml의 균형 잡힌 소금 용액에 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 단백질 결합이 낮은 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 이전과 같이 원심분리기를 합니다.

다음으로, 상등액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 95 마이크로리터의 소화 완충액에 다시 현탁시키고, 6개의 세포를 1배당 1 대 100의 프로테아제 억제제 칵테일을 보충한다. 즉시 세포를 위아래로 피펫으로 피펫으로 사용하여 뭉침을 방지하고 기포가 생기지 않도록 합니다. 그런 다음 145 마이크로리터의 소화 완충액에 5마이크로리터의 0.1X 마이크로코씨 뉴클레아제를 혼합하고 6개의 세포에 1 곱하기 10당 5마이크로리터의 희석된 마이크로코씨 뉴클레아제를 첨가합니다.

튜브를 튕겨 섞고 튜브를 섭씨 37도의 열 블록에 정확히 12분 동안 놓습니다. 염색질을 단편화하기 위한 미세구균 뉴클레아제 소화는 가장 중요한 단계입니다. 적절한 염색질 단편화는 ChIP에 대한 고분해능을 달성하는 데 중요합니다.

단계가 성공적으로 완료되도록 하려면 여러 샘플을 한 번에 하나씩 배양하여 과소화가 발생하지 않도록 합니다. 12분 후, 6개의 세포에 10 곱하기 10당 10X micrococcal nuclease stop buffer 10 micrococcal nuclease stop buffer를 10 μl씩 첨가합니다. 이 시점부터 샘플은 얼음 위에 보관해야 합니다.

소세포 뉴클레아제로 분해된 샘플의 바이오분석기 분석은 대부분의 DNA가 모노, 디, 트리뉴클레오솜으로 단편화되었음을 보여줍니다. 다음으로, 6개의 세포에 10 곱하기 10당 1에서 100까지 프로테아제 억제제 칵테일을 보충한 2X 리파 완충액 110 마이크로리터를 첨가합니다. 섞기 위하여 관을 그 후에 1700 시간 G.Transfer에 있는 4 섭씨 온도에 15 분 동안 분리기를 일정한 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관에 염색질을 포함하는 상등액을 섞고, 얼음에 두십시오.

프로테아제 억제제가 보충된 리파 완충액을 1에서 1000까지 사용하여 염색질을 희석하여 각 IP가 100 - 200마이크로리터의 부피를 갖도록 합니다. 그런 다음 ChIP 부피의 10%에 해당하는 부분 표본을 입력 샘플로 제거합니다. proteinase K가 보충된 TE 완충액 100마이크로리터를 추가하여 주입을 준비하고 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다.

PCR 정제 키트로 입력물을 정제한 후 마이크로 볼륨 분광 광도계를 사용하여 입력의 농도를 측정합니다. 결과를 노트북에 기록합니다. 각 샘플에 대해 수행할 IP당 세척된 단백질 A 및 G 마그네틱 비드 10마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 20RPM으로 회전하면서 1시간 동안 배양합니다.

샘플을 마그네틱 홀더에 놓고 비드가 분리되도록 한 다음 필요한 부피를 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 원하는 항체를 추가한 다음 증발을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀 필름으로 캡을 감쌉니다. 이전과 같이 섭씨 4도에서 밤새 회전하면서 샘플을 배양합니다.

다음날 2000 회 G에서 10 초 동안 튜브를 회전 한 다음 각 IP에 10 마이크로 리터의 비드를 추가하고 20RPM으로 회전하면서 섭씨 4도에서 3 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록 합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거한 다음 프로테아제 억제제가 포함된 리파 완충액 150마이크로리터를 각 IP에 추가하고 섭씨 4도에서 20RPM으로 5분 동안 배양합니다.

배양 기간이 끝나면 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록 합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거한 다음 저농도의 프로테아제 억제제가 보충된 염화리튬 완충액 150마이크로리터를 각 IP에 추가하고 섭씨 4도에서 20RPM으로 5분 동안 회전하면서 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록 한 다음 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.

그런 다음 프로테아제 억제제가 없는 저온 TE 150마이크로리터를 비드에 첨가하고 섭씨 4도에서 20RPM으로 5분 동안 회전하면서 배양합니다. 최종 세척 단계 후, ml리터 proteinase K당 0.5mg의 최종 농도가 보충된 100마이크로리터의 TE 완충액에 샘플을 다시 현탁시키고 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로, PCR 정제 키트를 사용하여 아미노 침전된 DNA를 정제합니다.

그런 다음 IP가 성공적인지 확인하기 위해 양성 및 음성 대조군 영역을 대상으로 하는 프라이머로 qPCR을 수행합니다.qPCR은 글리세르알데히드-3-인산-탈수소효소에 대한 프라이머를 사용하여 IGG ChIP DNA, 히스톤-3-리센-4-트리메틸화 ChIP DNA 및 히스톤-3-리센-27-트리메틸화 ChIP DNA로 수행했습니다. 대표적인 결과는 하우스키핑 유전자인 Gapdh가 활성 전사와 관련된 H3K4me3 변형으로만 농축되고 억제된 염색질과 관련된 H3K27me3 변형은 그렇지 않다는 것을 보여줍니다.

이 절차에 따라 게놈 전체에서 히스톤 마크의 변화를 식별하기 위해 ChIP-C와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 특정 유전자 부위에서 히스톤 마크를 식별하기 위해 신경구에서 네이티브 ChIP를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.