Name: 네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 배우세요 네이티브 크로마틴 면역침전법을 이용하여 생쥐 뇌 종양 신경구체에서 히스톤 변형을 분석하는 방법을. 이 기법은 교차결합 없이 자연 상태의 세포를 유지하여 항체 특이성을 높이고 교모세포종의 후성유전학적 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 보조금 R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 M.G.C.;에 의해 지원 되었다 NIH/NINDS 부여 R01-NS076991, R01-NS082311, 및 R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 신경외과 학과; 레 아의 행복 한 마음, 그리고 차드 비록 재단 M.G.C. 및 P.R.L. RNA 의학 그랜트 F046166 M.G.C. F.M.M.에 의해 한 F31 NIH/NINDS-F31NS103500 지원 됩니다. R.I.Z.-V입니다. NIH에서 지원 / NIGMS 부여 5T34GM007821-37.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 뇌종양 NS 및 조건 배양의 세대.
<ol><li>Dulbecco의 수정이 글 매체/F12B27 보충 (1x), n 2 보충 (1x) 및 항균 성 시 약으로 신경 줄기 세포 매체 (NSC)를 준비 합니다. 인간 재조합 형 내 피 성장 인자 (EGF) 및 20 ng/mL 각의 최종 농도에 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF)와 함께 사용의 날에 NSC 매체를 보충.</li>
	<li>자발적인 뇌 종양9를 생성 하기 위해 신생아의 측면 뇌 실에 인코딩 oncogenes 또는 종양 억제기를 타겟팅 shRNA 플라스 미드 주입은 잠자는 미녀 transposon 시스템을 사용 하 여 마우스에 뇌종양을 유발. 생물 발광 영상으로 확인 된 큰 종양으로 마우스를 선택 합니다. 참고: 사용 자 아름다움 Transposon 시스템 및 플라스 미드 구조에 대 한 더 자세한 정보는 Calinescu 그 외 여러분 에서 찾을 수 있습니다. 9.<ol>
<li>이미지는 마우스, 30 mg/mL 소 솔루션 intraperitoneally 26 게이지 바늘을 사용 하 여 100 µ L를 주사.</li>
		<li>소의 주입 후 5 분 anesthetize 동물 마 취 챔버를 사용 하 여 산소/isoflurane 흐름 2 %isoflurane 설정.</li>
		<li>동물 마 취는 때 (일반적으로 2-3 분), 산소 isoflurane 2 %isoflurane 설정와 동물 생물 발광 챔버에 배치. 동물 5 분 보다 더 오랫동안 취하는 것입니다, 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 안과 연 고를 사용 합니다.</li>
		<li>마우스는 vivo에서 광학 이미징 시스템 다음 매개 변수를 사용 하 여 이미지: 자동 노출, 큰 binning 및 조리개 f = 1. 큰 종양을 고려 하는 매개 변수는 생물 발광은 > 106 광자/s/cm2/sr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>안락사 폐쇄 실에서 isoflurane 흡입 마 취의 과다와 마우스 발가락 핀치는 동물 마 취에 의해 확인 하 고 마우스를 목을 벨.</li>
	<li>두뇌를 추출 하 고 앞에서 설명한 Calinescu 외 에 그것을 해 부 9.</li>
	<li>10 cm 배양 접시에에서 두뇌를 놓습니다. 종양 유발 형광 단백질을 표현 하 고, 해 부 현미경 형광 0.3 X 확대 및 적절 한 형광 채널을 설정 하는 사용 그렇지 않으면 종양 질량 조직 색상 및 질감의 차이 식별. 메스와 집게를 사용 하 여 정상적인 뇌에서 종양 조직 분리.</li>
	<li>페 트리 접시에 작은 조각으로 종양을 말하다. NSC 매체의 300 µ L 1.5 mL 튜브에 해 부 종양을 놓습니다.</li>
	<li>사용 하 여 부드럽게 균질 종양을 원뿔 microcentrifuge 튜브의 벽에 맞는 일회용 플라스틱 펠 릿 유 봉. 세포 분리 매체의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분에 대 한 샘플을 품 어 참고:는 방 앗 공이 사용 하 여 일부 셀을 죽 일 수 있습니다. 독자 세포 생존 능력을 극대화 하 고 싶다면는 유 봉 사용을 생략할 수 있습니다.</li>
	<li>70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 1.7 단계에서 세포 현 탁 액을 통과 하 고 NSC 매체의 25 mL와 여과기를 세척.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 현 탁 액을 원심을 가만히 따르다는 상쾌한 다시 NSC 매체의 6 mL에 펠 릿을 일시 중단.</li>
	<li>1.9 T-25 문화 플라스 크에 단계에서 종양 세포 현 탁 액을 접시 하 고 95% 공기와 5% CO2의 분위기와 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화. 보통 3 일 후, 일부 죽은 세포, 준수 세포와 일부 셀을 형성 하는 매체에 떠 있는 NS의 혼합물이 있을 것입니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송는 micropipette를 사용 하 여 바닥에 침 몰 된 셀만을 수집 하 고 다시 T-75 조직 배양 플라스 크에 접시.</li>
	<li>상대적으로 높은 밀도 (1-3 배는 T-25 106 셀)에서 세포를 유지 합니다. 들은 confluent 셀을 통과. 참고: Confluency 구체 크기에 의해 결정 됩니다. 블랙 센터 큰 분야의 중심에 죽은 세포는 고 셀 즉시 passaged 해야 합니다 나타냅니다.</li>
	<li>추가 성장 인자 (EGF와 기본-FGF; 20 ng/mL 각) 3 일 마다. 세포는 중간 회전 빛 오렌지와 합칠 때 매체를 변경 합니다.</li>
	<li>매체를 변경 하려면 오래 된 매체를 수집 하 고 5 분 동안 실 온에서 300 x g에서 원심 다시 NSC 중간 단계 1.1에서에서 지정 된 농도에서 EGF와 FGF 보충에 셀 펠 릿을 중단. 참고: 만약 분야에서 중반-높은 confluency, 하지만 passaged 될 준비가 안 (영역 크기는 작은 직경 < 100 µ m), 다음 두 플라스 크로 펠 릿을 분할할 수 있습니다.</li>
	<li>셀 통로를 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 세포를 원심, 가만히 따르다는 상쾌한 고 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀 분리 매체에 셀을 품 어<ol>
<li>희석 분리 매체 균형된 소금 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
		<li>상쾌한 가만히 따르다 하 고 NSC 매체의 18 mL에 셀 펠 릿 resuspend 3 T-25 플라스 크에 정지를 동등 하 게 분할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀의 aliquots, 동결 단계 1.15에서 세포를 분리 하 고 10% 디 메 틸 sulfoxide와 90% 태아 둔감 한 혈 청 1 mL aliquots 셀을 고정 합니다. 천천히 10 분 동안 얼음에 셀을 삽입 후 30 분 동안-20 ° C 세포 세포를 진정 및 1 일-80 ° C. 다음 날, 액체 질소 저장 컨테이너에 셀을 전송 합니다.</li>
</ol>2. 기본 칩
<ol><li>Chromatin 준비<ol>
<li>NS confluent 될 때까지 파생된 NS의 후, 95% 공기와 5% CO2 의 분위기와 NSC 매체 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서의 15 ml에서 T-75에서 NS를 문화. 한 confluent T-75 플레이트 3-5 X 106 셀을 얻을 것입니다.</li>
		<li>셀이 될 때 confluent, NS 5 분에 대 한 300 x g에서 원심, 가만히 따르다는 상쾌한 고 셀 분리 매체의 1 mL를 추가 합니다. 중간의 5 분 추가 5 mL에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어과 hemocytometer10를 사용 하 여 셀. 참고: 1 x 106 셀 immunoprecipitation (IP) 반응 당 필요 합니다. 참고는 미리 면역 혈 청 또는 IgG를 제어 해야 합니다 또한 포함된11일.</li>
		<li>300 x g 5 분 동안에 1 개의 1.5 mL microcentrifuge 관에서 NS 원심, 가만히 따르다는 상쾌한 다시 균형된 소금 솔루션의 1 mL와 함께 NS 펠 릿을 일시 중단 하 고 낮은 단백질 바인딩 1.5 mL microcentrifuge 관에 정지를 전송.</li>
		<li>5 분, 300 x g에서 원심 분리기 NS는 상쾌한 가만히 따르다와 다시 1 x 106 세포 효소 보충 당 소화 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 8.0, 1mm CaCl2, 0.2% 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르) 95 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 억제제 높은 농도 (1: 100)에 칵테일. 즉시 피펫으로 셀을 아래로 응집을 방지 하 고 모든 거품을 만들지 마십시오.</li>
		<li>"1x" 재고 라고 될 1 mg/mL 솔루션 (1.15 단위 / µ L,-20 ° C에 저장) 50% 글리세롤에 MNase를 resuspend. 게는 "0.1 x" 주식 50% 글리세롤과 두 번째 1:9 희석 하 여 (예., 900 µ L "1 x"의 MNase 및 50% 글리세롤의 100 µ L)-20 ° c.에 그것을 저장 하 고</li>
		<li>믹스 5 µ L의 "0.1 x" MNase 및 소화 버퍼의 145 µ L. 얼음에 효소는 항상 유지. 1 x 106 셀 당 소화 버퍼에 희석된 MNase의 5 µ L를 추가 합니다. 12 분의 정확한 부 화 시간을 보장 하기 위해 한 번에 정확히 12 분 프로세스에 대 한 37 ° C 블록에 관을 혼합 튜브 샘플 하나를 터치 합니다.</li>
		<li>10 µ L 10의 추가 1 x 106 셀 당 MNase 중지 버퍼 (110 mM Tris HCl, pH 8.0, 55 mM EDTA) x. 샘플은 앞으로이 지점에서 얼음에 유지 되어야 한다.</li>
		<li>110 µ L "2 x RIPA 버퍼" 추가 (280 m NaCl, 1.8% 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르, 0.2% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 0.2% 나 deoxycholate, 5mm 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, m N', N'-tetraacetic 산 (EGTA); 4 ° C에서 저장 된)으로 보충 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1 x 106 셀 당 높은 농도 (1: 100)에서 믹스에 튜브를 터치 합니다.</li>
		<li>튜브 microfuge 4 ° C에서 15 분 동안 원심 1700 x g. (낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브는 필요 이상) 새로운 일반 1.5 mL microcentrifuge 관에는 상쾌한을 전송 하 고 얼음에 저장. 펠 릿을 삭제 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitation (IP)<ol>
<li>단백질 A, 단백질 G 자석 구슬 1:1 비율로 섞는다. 모든 IP에 대 한 구슬의 25 µ L를 준비 합니다.</li>
		<li>RIPA 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 구슬을 세척 (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르, 0.1 %SDS, 0.1% 나 deoxycholate; 4 ° C에서 저장 된) 낮은 농도 (1:1000)에서 protease 억제제 보충.</li>
		<li>자석 세탁 솔루션에서 분리 하 여 세척 솔루션 (약 1 분)을 가만히 따르다 구슬 사용. 두 번 세척 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>다시 프로 테아 제 억제제 (1:1000)와 보충 RIPA 버퍼를 사용 하 여 원래 볼륨에 비즈를 일시 중단 합니다.</li>
		<li>필요한 경우 희석 chromatin protease 억제제 (1:1000)와 각 IP는 100-200의 볼륨 보충 RIPA 버퍼를 사용 하 여 µ L. 예약 입력 chromatin의 IP 당 사용 하는 볼륨의 10%. 참고: 예를 들어 IP 당 200 µ L 사용 하는 경우 희석된 chromatin의 20 µ L 해야 예약 입력에 대 한. 4 개의 IPs의 총, 총 chromatin 볼륨 820 µ L를 희석 한다.</li>
		<li>입력을 준비 합니다. 입력에 가수분해 K (0.5 mg/mL)와 보완의 테 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 100 µ L을 추가 하 고 입력 1 h 55 ° C에서 품 어. 참고: 단계 2.2.6-2.2.7 단계 2.3.4 2.4.1 함께 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 PCR 정화 키트를 사용 하 여 입력을 정화 하 고 키트에서 제공 하는 차입 버퍼의 50 µ L에 elute.</li>
		<li>Microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 입력의 농도 측정 하 고 노트북에 결과 기록 합니다. 키트에서 차입 버퍼와 빈. 참고: 마우스 neurospheres, 우리 사용 DNA의 약 6 µ g 각 IP에 대 한.</li>
		<li>1% 젤에 입력 실행 하거나 표준 설정을 사용 하 여 DNA Bioanalyzer에 1 µ L을 로드 합니다. 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 입력으로 사용 하기 위해 나머지를 저장 합니다.</li>
		<li>모든 IP에 대 한 10 µ L 세척 단백질 A & G 자석 비즈를 추가 하 고 1 시간 4 ° c.에 대 한 IP를 품 어 참고: 예를 들어 30 µ L의 단백질 A & G 자석 구슬 3 ips에 추가 합니다.</li>
		<li>자석에 샘플을 놓고 분리 하 비즈를 허용 합니다. 새로운 1.5 mL 튜브에 이전 결정된 금액을 전송 하 여 chromatin를 나눕니다.</li>
		<li>항 체를 추가 하 고 증발을 피하기 위해 플라스틱 파라핀 필름으로 모자를 포장. 회전 20 rpm으로 4 ° C에서 하룻밤 샘플을 품 어. 참고: 농도 결정 되어야 합니다 경험적으로 제조업체 권장 사항에 따라.</li>
		<li>다음 날, 회전 10 실내 온도에, 2000 x g, 미니 원심 분리기를 사용 하 여 튜브 s. 그런 다음 각 ip 구슬의 10 µ L을 추가 하 고 회전 20 rpm으로 4 ° C에서 3 h에 대 한 IP를 품 어.</li>
	</ol></li>
	<li>IP 세척과 단백질 소화<ol>
<li>RIPA 버퍼 각 IP에 낮은 농도 (1:1000)에서 protease 억제제와 보충의 150 µ L을 추가 하 고 마그네틱 스탠드에 샘플에 5 분 장소에 대 한 20 rpm에 회전 4 ° C에서 IP를 품 어 별도로 자석 구슬 허용. 피펫으로 사용 하 여 제거는 상쾌한 하. 이 tep 5 세척을 반복 합니다.</li>
		<li>150 µ L LiCl 버퍼의 추가 (250mm LiCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.5 %NP-40, 0.5% 나 deoxycholate; 4 ° C에서 저장소) protease 억제제 각 IP에 낮은 농도 (1:1000)에서 보충 하 고 5 분 장소는 샘플에 대 한 20 rpm에 회전 4 ° C에서 IP를 품 어 자기에서 서 서 하 고 별도로 자석 구슬 허용. 피펫으로 사용 하 여 상쾌한 제거.</li>
		<li>찬 테 (프로 테아 제 저 해제)의 150 µ L을 추가 하 고 5 분 장소에 대 한 20 rpm에 회전 4 ° C에서 샘플 마그네틱 스탠드에 샘플을 품 어 별도로 자석 구슬 허용. 피펫으로 사용 하 여 제거는 상쾌한 하.</li>
		<li>최종 세척 단계 후 다시 테 버퍼 가수분해 K (0.5 mg/mL)와 보완의 100 µ L에서 샘플을 일시 중단 하 고 1 시간 55 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA의 정화 및 칩 양적 실시간 PCR (정량)<ol>
<li>Immunoprecipitated DNA는 PCR 정화 키트를 사용 하 여 정화. 각 샘플 키트에서 DNA 바인딩 버퍼의 추가, 튜브 자석에 놓고 자석 구슬 집계, 정리 열에는 상쾌한 전송 될 때까지 기다립니다. 제조업체의 지침을 따라와 키트에 제공 된 차입 버퍼의 50 µ L에 elute.</li>
		<li>IP 성공 인지 확인 하는 정량 수행 합니다. 이상적으로, 뇌관은 긍정적이 고 부정적인 제어 영역에 대 한 설계 되어야 한다. 참고: 예를 들어 IP H3K4me3와 H3K27me3를 수행에 대 한 다음 샘플 실행 해야 합니다 수 정량에: H3K4me3, H3K27me3, 및 IgG 칩 DNA, DNA, 그리고 아무 템플릿 컨트롤 (NTC) H3K4me3와 농축 될 지역에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 입력 (긍정적인 제어) 및 H3K4me3와 농축 수 지역 (제어 네거티브); 마찬가지로, H3K27me3에 대 한.</li>
		<li>정량12를 수행 하려면 표준 프로토콜을 따릅니다. 간단히, 정량 SYBR 녹색 마스터 믹스, 10 µ M 작업 집중 각 정방향 및 역방향 뇌관의 0.5 µ L 및 칩 또는 입력된 DNA의 2 µ L를 사용 하 여 수행 합니다. 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 번호판을 읽기. 뇌관 시퀀스는 표 2에 나와 있습니다. 황 외에서 Gapdh 뇌관 시퀀스. 사용된13있었다입니다.</li>
		<li>칩 데이터 분석, 입력 기준 즉, % 입력 방법 (%IP)14. 다음 수식을 사용 하 여 입력 하는 %를 계산. 입력 조정 평균 ct (입력) =-2(DF) 로그인 DF가 시작 입력의 희석 비율 및 DF = IP의 총 볼륨 / 입력 볼륨 %IP = 100 × 2 ^ (입력-Ct (IP) 조정) 여기서 Ct는 임계값 비율입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bjerke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3.3.+mutations+drive+pediatric+glioblastoma+through+upregulation+of+MYCN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN.</a> Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 프로토콜 NS 유전자 조작된 뇌 종양에서 파생 된에 네이티브 칩을 수행 하기 위해 사용자를 하면 수 있습니다. 칩, cross-linking 달리이 프로토콜은 DNA6밀접 하 게 연관 단백질의 연구에 대 한 제한입니다. 필요에 따라 사용 하는 셀의 수를 수정할 수 있습니다 하 고 프로토콜 확장할 수 있습니다. 그러나 IP 당 1 X 106 셀을 사용 하는 우리,, 네이티브 칩도 수행할 수 있습니다 작은 4 x 104 의 세포5. 이 프로토콜에서 정량; 통해 칩 DNA 분석 그러나,이 프로토콜 또한 게놈 넓은 수준에 단백질 DNA 상호 작용 연구를 다음 세대 시퀀싱 결합 될 수 있습니다. 이 칩 프로토콜 분석의 종양 세포 게놈의 특정 지역 내에서 히스톤 수정 증 착에 glioma oncogenes의 효과 성공적으로 사용 했습니다.
기본 칩을 ...

Epigenetic 이벤트 gliomas에 자주와 가능성이 종양의 병 인에 중요 한 역할. 실제로, 소아과 고급 glioma 인코딩 히스톤 변형 H3.3 및 H3.1 유전자에 있는 돌연변이 발생 자주1. 변이는 히스톤 수정에 영향을 하 고 주요 epigenetic 결과2,3. 성인 스펙트럼에 사춘기에 isocitrate 효소 유전자 1/2 (IDH1/2), α-KG 종속 히스톤과 DNA 드-methylasaes, 억제 하는 돌연변이에 재발 돌연변이 그리고 다른 chromatin 레 귤 레이 터 ATRX 등 DAXX 유전 변경 발생 4. 따라서, 그것은 중요 한 중요성 chromatin 구조 및 규제 히스톤 수정, 차례로, 종양 세포의 transcriptome의 극적인 영향을 미칠 후 레 귤 레이 터에 영향을 주는 돌연변이 변경 하는 방법을 공부 하.
Chromatin immunoprecipitation (칩) 후 성적인 수정 게놈5,,67에 영향을 평가 하는 데 사용 하는 강력한 도구입니다. 기본 칩에서 chromatin micrococcal nuclease (MNase), 제기, 관심사의 단백질에 대 한 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated로 소화 하 고 DNA immunoprecipitated chromatin 복잡 한6에서 정화는 다음. 세포는 DNA6와 긴밀 하 게 상호 작용 하는 단백질의 연구에 대 한 적용만이 기술에 하지 절차 동안 고정 됩니다. Cross-linking의 부재 에이즈 항 체 특이성 항 체는 일반적으로 고정 되지 않은 펩 티 드 또는 단백질7에 대 한 발생 이후. 또한, 아무 상호 단계 때문에, 담합 일반적인 고 하지 규제7,8과도 단백질 DNA 상호 작용의 기회 줄어듭니다. 칩은 특정 게놈 지역에서 히스톤 수정의 농축을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 프로토콜 glioma의 마우스 모델 설계 유전자에서 생성 된 neurospheres (NS)에서 네이티브 칩을 수행에 대 한 선발.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2946-90004</td><td>bioanalyzer</td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R, 냉장</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 마우스</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Aldrich</td><td>22350-6</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>D-Luciferin, 칼륨 염</td><td>Goldbio</td><td>LuckK-1g</td><td></td></tr><tr><td>DiaMag1.5 마그네틱 랙</td><td>Diagenode</td><td>B04000003</td><td>for magnetic bead washes</td></tr><tr><td>DiaMag Rotator EU</td><td>Diagenode</td><td>B05000001</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NSC component</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>protein A magnetic beads</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>단백질 G 자석 구슬</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>준비 20 &mu; g/mL 재고는 0.1% BSA 및 분취량입니다.</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(&베타;-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산) (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td>qPCR 시약</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10437028</td> for <td>frozen cells</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18b</td><td>준비 20 &mu; g/mL 재고는 0.1% BSA 및 분취량입니다.</td></tr><tr><td>종양 해부를 위한</td> <td>집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td></tr><tr><td>글리세롤, MB 등급</td><td>EMD- Millipore</td><td>356352</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>Ab8580</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Millipore</td><td>07-449</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td>균형 잡힌 소금 용액</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VETone</td><td>501017</td><td>흡입 마취제</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>Perkin-Elmer</td><td>124262</td><td>in vivo 광학 이미징 시스템</td></tr><tr><td>Hyqtase</td><td>HyClon</td><td>SV3003001</td>세포 <td>분리 매체</td></tr><tr><td>염화리튬</td><td>Sigma</td><td>L8895</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>저결합 마이크로튜브</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3207</td><td>저단백질 결합 미세원심분리기 튜브</td></tr> 미<tr><td>세원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>21-402-903</td><td>일반 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>소세포 뉴클레아제</td><td>Thermo Fisher Scientific, Affymetrix</td><td>70196Y</td><td>각 배치는 다를 수 있습니다; 실험과 분취를 위한 충분한 양을 구입하십시오.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>NSC 구성</td></tr><tr><td>요소 Normal Rabbit IgG</td><td>Millipore</td><td>12-372</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>NOL-36-063</td><td>항균제, 0.1 mg/mL에서 사용.</td></tr><tr><td>NP-40 (Igepal CA-630)</td> <td>Sigma</td><td>18896-50ML</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>Kimble Kontes 펠렛 유봉</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749515-0000</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>부분 표본 및 -20 °C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>프로티나아제 K</td><td>시그마-알드리치</td><td>P2308</td>은 <td>물에서 10mg/mL의 스톡을 만들고 분취하여 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>종양 해부용</td><td>메스</td><td>미세 과학 도구</td><td>10007-16</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR</td><td>0241-5KG</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>데옥시콜레이트 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>D670-25G</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>시그마</td><td>L-4390</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Bp152-1</td><td>완충 시약</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP 151-500</td><td>폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르</td></tr><tr><td>표준 미니 원심분리기</td><td>Fisherbrand</td><td>12-006-901</td><td>표준 미니 원심분리기</td></tr><tr><td>SZX16 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>형광 해부 현미경</td></tr><tr><td>고속 96웰 블록 응용 바이오시스템을 갖춘 ViiA 7 Real-Time PCR 시스템</td><td></td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr></tbody></table>

네이티브 chromatin immunoprecipitation murine 뇌 종양 neurospheres를 사용 하 여

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

후 성적인 수정 개발 및 glioma의 진행에 관련 될 수 있습니다. 메 틸 화 및 발기인의 acetylation oncogenes 종양 억제기의 규제 지역 변경 유전자 발현에 변화를이 끌 하 고 뇌 종양의 병 인에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 네이티브 chromatin immunoprecipitation (칩) 수정 또는 단단히 DNA에 바인딩된 다른 단백질의 검출을 허용 하는 인기 있는 기술입니다. 기본 칩에서 복사해올된 칩 달리 셀 연결할 covalently 단백질 DNA 포름알데히드와 함께 처리 되지 않습니다. 이것은 유리한 때로는 가교만 뚜렷이 DNA와 상호 작용 하 고 유전자 규칙에서 기능적 중요성을 하지 않은 단백질을 해결할 수 있습니다. 또한, 항 체는 일반적으로 고정 되지 않은 펩 티 드에 대 한 발생 합니다. 따라서, 네이티브 칩에서 항 체 특이성 증가 된다. 그러나, 그것은 네이티브 칩 히스톤 또는 DNA에 단단히 바인딩할 다른 단백질 연구에 적용 됩니다만 다는 것을 명심 하는 것이 중요. 이 프로토콜 murine 뇌 종양 neurospheres에 네이티브 chromatin immunoprecipitation을 설명합니다.

종양 뇌종양 뇌 종양 세포 Katushka 긍정적인 위치에서 생성 된 NS의 도식 대표는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 2 는 전체 칩 기술의 도식 적인 표현입니다. 그림 3 보여 줍 뇌종양 NS에서에서 chromatin의 대표적인 결과 12 분, 모노, 디-및 트라이-nucleosomes의 대부분 저조한 MNase와 소화. 칩, 다음 한 정량 칩에서 수행 될 수 있습니다 및 DNA를 입력 샘플. 그림 4 는 glyceraldehyde-3-인산 효소 (Gapdh)에 대 한 정량에서 대표적인 칩 정량 데이터를 보여 줍니다. Gapdh는 H3K4me3, 활성 전사와 관련 된 수정와 풍부한 내부 관리 유전자 이다. 결과 Gapdh H3k4me3 농축은 억압 된 ch...

후 성적인 기계 장치는 자주 glioma에서 변경 됩니다. Chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 chromatin 구조와 유전자 전사 조절에 따른 결과 glioma의 유전 변경의 결과 연구에 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜 murine 뇌 종양 neurospheres에 네이티브 chromatin immunoprecipitation을 설명합니다.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

이 절차의 전반적인 목표는 특정 게놈 위치에서 히스톤 마크의 농축을 식별하는 것입니다. 이 방법은 히스톤 변형을 변경하는 후성유전학적 조절인자의 돌연변이가 종양 세포 전사체에 미치는 영향과 같은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 가교되지 않기 때문에 보다 자연스러운 상태에 있어 항체 특이성을 도울 수 있다는 것입니다.10cm 페트리 접시에 담긴 쥐의 뇌에서 실험적으로 유도된 종양을 해부하는 것으로 시작합니다. 종양이 형광 단백질을 발현하는 경우, 적절한 형광 채널로 설정된 형광 해부 현미경을 통해 0.3배 배율로 종양을 시각화합니다. 메스와 집게를 사용하여 정상 뇌에서 종양 조직을 분리하고 페트리 접시에서 종양을 작은 조각으로 다집니다.절개된 종양을 300마이크로리터의 NSC 배지가 있는 1.5ml 튜브로 옮기고 일회용 주사기를 사용하여 종양을 부드럽게 균질화합니다. 그런 다음 1ml의 세포 분리 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 70미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50ml 원심분리 튜브에 통과시킵니다.그런 다음 스트레이너를 NSC 배지 25ml로 세척하고 실온에서 5분 동안 300배 G로 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅한 후 펠릿을 6ml의 NSC 배지에 다시 현탁시키고 종양 세포 현탁액을 T25 배양 플라스크로 옮깁니다. 신경구가 형성될 때까지 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 공기 95%와 이산화탄소 5%의 대기로 세포를 배양합니다.신경구를 수확하면 5분 동안 300배 G로 아미노 침전당 6개의 신경권 세포에 10배의 원심분리를 합니다. 원심분리 후, 상층액을 디캔팅하고 신경구 펠릿을 1ml의 균형 잡힌 소금 용액에 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 단백질 결합이 낮은 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 이전과 같이 원심분리기를 합니다.다음으로, 상등액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 95 마이크로리터의 소화 완충액에 다시 현탁시키고, 6개의 세포를 1배당 1 대 100의 프로테아제 억제제 칵테일을 보충한다. 즉시 세포를 위아래로 피펫으로 피펫으로 사용하여 뭉침을 방지하고 기포가 생기지 않도록 합니다. 그런 다음 145 마이크로리터의 소화 완충액에 5마이크로리터의 0.1X 마이크로코씨 뉴클레아제를 혼합하고 6개의 세포에 1 곱하기 10당 5마이크로리터의 희석된 마이크로코씨 뉴클레아제를

native-chromatin-immunoprecipitation-using-murine-brain-tumor

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

뇌 조직의 세포 이질은 대부분의 assays 단일 셀 해상도 부족하기 때문에 염색질의 epigenetic 자국의 연구에 대한 중요한 제한 포즈. 뉴런은 일반적으로 glia 및 기타 비의 연결을 세포와 혼합된 있습니다. 우리는 인간의 두뇌에서 핵의 연결을 추출하고 수집하는 프로토콜을 제공합니다.

인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

이 비디오 프로토콜은 neurosphere 분석 문화 방법을 사용하여 수술 resected 인간 glioblastoma의 mutliforme (GBM) 종양 조직에서 세포처럼 고립과 줄기의 확장을 보여줍니다.

분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

이 비디오는 기계적 해리와 효소 분해를 사용하여 쥐의 뇌에서 종양에 침투하는 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 다음에는 추가 분석을 위해 면역 세포를 수집하기 위해 밀도 구배 원심분리가 수행됩니다.

쥐의 뇌에서 종양 침투 면역 세포 분리

출처: Mendez, F. M. et al., 쥐 뇌 종양 신경구를 사용한 네이티브 염색질 면역침전.J. vis. 특급 (2018). 이 비디오는 천연 염색질 면역침전을 사용하여 마우스 뇌종양에서 유래한 신경구 세포에서 단백질-DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 염색질 준비, 면역침전, 세척 및 단백질 분해를 위한 단계를 자세히 설명하여 다운스트림 분석을 위해 DNA를 방출합니다.

신경구 세포의 네이티브 염색질 면역침전(Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells)

출처: Núñez, F. J., et al. 파라핀 함유 3D 신경교종 신경구 배양에 대한 면역조직화학에 의한 신경교종의 바이오마커 평가. J. Vis. 특급. (2019).이 비디오는 파라핀이 포함된 뇌종양 신경구에서 종양 바이오마커를 라벨링하기 위한 면역조직화학 기술을 보여줍니다. 신경구 절편은 파라핀 제거 및 재수화 과정을 거친 후 바이오마커 부위를 노출시키는 치료를 받습니다. 그런 다음 1차 및 2차 항체를 적용하여 이러한 바이오마커를 라벨링합니다. 2차 항체는 아비딘 접합 과산화효소(avidin-conjugated peroxidase enzyme)에 결합되어 있으며, 이 효소는 발색 기질을 산화시켜 바이오마커 위치를 나타냅니다. 마지막으로, 현미경 분석을 위해 핵 counterstaining 및 slide preparation이 완료됩니다.

뇌종양 신경구 절편에서 바이오마커의 면역조직화학적 염색

혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

여기에서는 신생아 마우스의 심실에 주입된 트랜스포존 DNA를 사용하여 새로운 교모세포종(GBM)을 유도, 모니터링 및 분석하는 효율적이고 다재다능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 플라스미드를 흡수하는 뇌실하부의 세포는 인간 교모세포종의 조직병리학적 특성을 가진 종양을 변형, 증식 및 생성합니다.

신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 중재 통합 아교 ​​모세포종의 소설 모델을 생성합니다

Neurospheres 3D 문화로 성장 glioma 생물학을 공부 하는 강력한 도구를 구성 합니다. 여기 선물이 immunohistochemistry 파라핀 포함 통해 glioma neurospheres의 3 차원 구조를 유지 하면서 수행 하는 프로토콜. 이 메서드는 stemness 등 신경 분화 glioma neurosphere 속성의 특성을 수 있습니다.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

정형소 소아 뇌종양 모델의 개발에는 암세포를 정밀하게 이식하기 위해 입체 장치를 사용하는 세심한 정밀도가 필요합니다. 여기에 제시된 방법론은 뇌종양 세포를 준비하고, 두개내 주사를 수행하고, 뇌종양 생착을 평가하기 위한 수술 후 모니터링 시스템을 구현하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Stereotaxic Device를 이용한 뇌종양에 대한 Orthotopic Patient-derived Xenograft Models 구축

배우세요 네이티브 크로마틴 면역침전법을 이용하여 생쥐 뇌 종양 신경구체에서 히스톤 변형을 분석하는 방법을. 이 기법은 교차결합 없이 자연 상태의 세포를 유지하여 항체 특이성을 높이고 교모세포종의 후성유전학적 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여

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