생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

이 광변환 기술의 전반적인 목표는 단일 동물의 단일 세포를 다른 형광 세포 집단과 구별하는 것입니다. 이 방법은 해당 분야의 주요 발달 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 시간 경과에 따른 단일 세포 이동을 시각화할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소 침습적이며 단일 세포 또는 더 큰 집단을 라벨링하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

또한 사용자는 특정 관심 영역을 선택하고 원하는 대상을 사진 변환할 수 있습니다. 광변환 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬를 수컷과 암컷으로 짝짓기하고 텍스트 프로토콜에 따라 난자를 채취한 후, 488나노미터 광원과 GFP 필터 세트가 있는 해부 현미경을 사용하여 24개의 hpf 배아를 스크리닝합니다. 바늘이나 핀셋을 사용하여 배아를 수동으로 분리하십시오.

전자 레인지에서 0.8 % 낮은 융점 아가로 스 용액 5 밀리리터로 준비합니다. 아가로스가 만졌을 정도로 식으면 3-4개의 마취된 형질전환 sox10 eos positive 48 hpf 물고기를 10mm 유리 덮개 슬립 바닥 페트리 접시 중앙에 놓습니다. 약 1mm 또는 커버 슬립 표면을 덮을 만큼 충분한 아가로스를 추가합니다.

그런 다음 프로브 바늘을 사용하여 물고기를 옆으로 정렬하고 필요에 따라 조정하면 아가로스가 응고되는 데 약 2분이 걸립니다. 아가로스가 2분 동안 응고된 후 0.02%아미노벤조산 에스테르 트리카인이 함유된 배아 배지를 한천과 접시의 바닥 표면이 잠길 때까지 접시에 천천히 추가합니다. 컨포칼 현미경 검사를 수행하려면 컨포칼 소프트웨어를 열고 캡처 및 초점 창을 선택합니다.

사전 변환 이미징을 수행하려면 capture window 및 capture setting 드롭다운 탭에서 이미징 매개변수를 선택합니다. 다음은 물고기 이미징이라고 하는 실험실별 스택 설정입니다. 표본을 컨포칼 현미경에 놓고 굵고 미세한 조정 손잡이를 사용하여 초점을 맞춥니다.

그런 다음 초점 창을 열고 등쪽 뿌리 신경절과 같은 원하는 관심 영역을 찾습니다. 필터 세트 메뉴에서 c488 레이저를 선택하고 노출을 300밀리초, 레이저 출력을 5, 강화를 75로 설정합니다. 그런 다음 캡처 유형 섹션에서 3D 상자를 선택합니다.

3D 캡처 섹션에서 현재 위치 사용을 선택하고 현재 주위의 범위를 확인합니다. 동일한 섹션에서 범위를 35로, 평면 수를 36으로, 단계 크기를 1로 설정합니다. 현재 위치를 선택한 다음 캡처 창 하단의 시작을 클릭하여 이미지를 획득합니다.

광 변환 프로세스 전에 레이저 매개변수를 두 번 및 세 번 확인하십시오. 변환 창이 열려 있을 때 변환 설정을 다시 조정해야 하는 경우가 있습니다. 캡처 창의 캡처 창 설정 드롭다운 탭에서 랩별 변환 이미징 설정을 선택합니다.

여기서 실험실 특정 설정을 fish ablate full chip이라고 합니다. 필터 메뉴 세트에서 c488 및 c541 레이저를 선택합니다. 노출을 300밀리초로, 레이저 출력을 5로, 강도를 75로 설정하면 광표백이나 독성을 일으키지 않고 충분한 형광 신호를 생성할 수 있습니다.

초점 창에서 photomanipulation 탭을 클릭하고 laserstack power를 2로 변경한 다음 go를 클릭합니다. 래스터 블록 크기를 1로 변경하고 세트를 클릭합니다. 그런 다음 더블 클릭 크기를 4로 변경하고 레이저 라인을 v405로 변경합니다.

그런 다음 캡처 창에서 고급 캡처 설정을 엽니다. photomanipulation 탭을 선택하고 두 번 클릭 반복을 두 번으로 변경한 다음 확인을 클릭합니다. 포커스 창에서 xy 탭을 선택합니다.

photomanipulation 탭에서 레이저 매개변수를 다시 확인하십시오. 그런 다음 주변 세포의 광변환 없이 관심 세포를 광변환하도록 레이저 설정을 지정합니다. Capture type(캡처 유형)에서 Timelapse(타임랩스) 상자를 선택한 다음 start(시작)를 클릭합니다.

라이브 타임랩스 창이 열리면 상단 도구 모음에서 원 도구를 선택합니다. 셀의 가장 가운데 영역에 원을 그린 다음 그려진 원을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 FRAP 영역을 선택한 다음 3초 동안 기다립니다. 선택한 영역이 어두워지면 캡처를 중지해야 합니다.

두 개 이상의 동물을 이미징하는 경우 초점 메뉴의 xy 탭으로 돌아가서 위치 2를 선택합니다. 그런 다음 사진 변환을 반복합니다. 세포 집단을 변환하려면 타임랩스 창을 열어 프로토콜과 레이저 투과계를 따르십시오.

이제 관심 영역을 FRAP하기 위해 원을 그리는 대신 선 도구를 사용하여 관심 영역에 선을 그립니다. 그런 다음 방금 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 영역을 FRAP합니다. 모든 포인트가 포토컨버팅되면 캡처 창의 캡처 설정 드롭다운 탭에서 이 비디오의 앞부분에서 설명한 랩별 표준 스택 설정을 선택합니다.

c488 레이저를 선택하고 노출을 300밀리초, 레이저 출력을 5, 강화를 75로 설정합니다. c541 레이저를 선택하고 노출을 500밀리초로, 레이저 출력을 10으로, 강화를 75로 설정합니다. 캡처 유형 섹션에서 3D 상자를 선택합니다.

3D 캡처 섹션에서 현재 위치 사용을 선택하고 현재 주위의 범위를 확인합니다. 같은 섹션에서 범위를 35로, 평면 수를 36으로, 단계 크기를 1로 설정합니다. 범위 번호는 원하는 이미징 깊이를 수용하기 위해 증가하거나 감소할 수 있습니다.

xy 포커스 탭에 곱하기 포인트가 있는 경우 캡처 창에서 멀티포인트 목록 옵션을 선택합니다. 그렇지 않은 경우 현재 위치를 선택합니다. 마지막으로 캡처 창 하단에서 시작을 클릭하여 이미지를 획득합니다.

이 패널은 형질전환 제브라피시의 신경절 내에 있는 단일 prephoto conversion cell을 보여주며, sox10 조절 서열의 제어 하에 광변환 가능한 eos 단백질을 발현합니다. 광변환 후, eos는 관심 영역 내에 뚜렷하게 존재했지만 인접 세포는 표시되지 않았습니다. 이 광변환 기술의 유용성을 입증하기 위해, 척수의 복부 쪽에 있는 세포 집단을 선을 사용하여 자외선에 노출시켰습니다.

그 후, 라인 영역에서 광변환된 eos 단백질을 보여주는 이미지를 촬영했습니다. 광전환되지 않은 eos 단백질은 다른 모든 영역에서 볼 수 있었습니다. 광변환 후 몇 시간 후, 등쪽과 배쪽 위치 모두에서 척수 부위 전체에 흩어져 있는 광변환된 eos 양성 세포를 보여주는 동일한 이미지가 촬영되었습니다.

이 발견은 배쪽 척추 세포가 등쪽 위치로 재배치되었다는 가설과 일치합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 30분에서 45분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 관심 영역이 광 변환을 경험했는지 확인하기 위해 변환 후 이미지를 촬영하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 시간 경과에 따른 세포 이동 및 역학을 관찰하기 위해 타임랩스 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형광 세포 집단 내에서 단일 세포를 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 필요한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

예를 들어, 절대로 빛을 직접 응시하지 마십시오.