Name: 생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 Danio rerio에서 UV 노출을 통한 단일 세포 포토컨버전 기법으로 세포 이동을 실시간 관찰하는 방법을. 이 최소 침습적 기술은 발달 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리가 버나드 Kulemaka 및 그들의 도움이 의견과 시 지도, 샘 Connell 및 이미징 질문 및 데보라 뱅, 카 렌 주 및 케이 스튜어트 zebrafish 치료 비 위한 3i의 브렌 트 레드에 대 한 스미스 연구소의 회원을 감사 합니다. 이 작품 노 대학 및 줄기 세포의 센터에서 Zebrafish 연구 노 대학에서 재생 의학에 대 한 노트르담의, Elizabeth와 마이클 갤러거 가족, 알프레드 P. 슬로 안 재단, 센터에 의해 지원 되었다 담입니다. 모든 동물 연구 박사 코디 스미스의 Notre Dame 대학 IACUC에 따라 수행 되었다.

모든 동물 연구는 노 틀 담 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 제 브라 견본 준비
<ol><li>표준 절차13당 짝짓기 챔버로 한 성인 남자와 한 성인 여성 Tg (컨버터블 단백질)를 배치 합니다. 이 원고에서는 Tg(sox10:eos)를 물고기9 액세스 하지만 photoconvertible 단백질으로 다른 유전자 변형 라인을 동등 하 게 사용 될 수 있다. 물고기 놓지 않는 경우 더 이상의 챔버를 설정 합니다. 챔버에 남아 하룻밤을 물고기 허용.</li>
	<li>다음날 아침, 100 mm 페 트리 접시에 달걀을 수집 합니다. 심사 하기 전에 24 시간 후 수정 (hpf) 성숙 계란을 허용 합니다.</li>
	<li>위의 동물 heterozygotes는 transgene에 대 한 경우, 화면 24 hpf 요리 Tg(sox10:eos) + 488 nm 광원 및 GFP 배아에 대 한 필터링 해 현미경에 세트. Tg(sox10:eos) + 배아를 분리 하 고 48 성숙 허용 hpf.</li>
	<li>바늘 또는 핀셋으로 수동으로 Dechorionate 배아</li>
	<li>준비 하 고 0.8% 낮은 녹는 포인트 agarose 용액 5 mL를 전자 렌지.<ol>
<li>Agarose 터치 멋지다, 일단 배치 3-4 마 취 안내 (sox10:eos) +48 hpf 물고기 10 m m 유리 coverslip의 센터에서 페 트리 접시 바닥.</li>
		<li>충분히 agarose coverslip, 약 1 mL의 표면을 커버를 추가 합니다. 프로브 바늘을 사용 하 여 그들의 측면에 생선을 준비. 동물의 장착 되도록 공고히 agarose를 허용 합니다. 그것은 지속적으로 다시 정렬 하는 제 브라는 agar 굳은14까지 필요할 수 있습니다. 응고 약 2 분 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후는 agarose는 2 분 동안 경화는, 천천히 0.02 %aminobenzoic 산 에스테 르 (Tricaine) 한 접시의 하단 표면 빠져들 때까지 접시를 포함 하는 태아 매체를 추가 합니다. 이것은 약 3 mL 이어야 한다.</li>
</ol>2. 현미경 장착 및 사전 변환 영상
<ol><li>Confocal 소프트웨어 열고 캡처 및 초점 창 [그림 1]을 선택 합니다. 캡처 창에서 캡처 설정 드롭 다운 탭 [그림 1]에서 실험실 전용 변환 이미지 설정을 선택 합니다. 여기, 실험실 전용 설정 이라고 "물고기 이미징입니다."</li>
	<li>Confocal 범위에 견본을 놓고 코스와 미세 조정 손잡이 사용 하 여 초점을 가져다 합니다.</li>
	<li>초점 창을 열고 관심 (즉 지 루트 ganglia) 원하는 영역을 찾습니다.</li>
	<li>C488 레이저 필터 설정 메뉴에서 선택 합니다. 300 ms에 노출 설정, 5, 파워 레이저 고 75 [그림 2] 강화.</li>
	<li>캡처 형식 섹션에서 3D 상자를 확인 하십시오. 3D 캡처 섹션에서 현재 위치를 사용 하 여 선택 하 고 현재 주위 범위를 확인 합니다. 같은 섹션에서 35, 36, 비행기 및 1 단계 크기의 숫자 범위를 설정 합니다. 범위는 증가 하거나 이미징 영역의 깊이 맞게 감소 될 수 있습니다. 척수에 대 한 35-40 스택 사이의 범위 값은 일반적으로 충분 한 [그림 5]입니다.</li>
	<li>[그림 5]의 현재 위치를 선택 합니다.</li>
	<li>클릭 이미지를 얻으려고 캡처 창의 맨 아래에서 시작 합니다.</li>
</ol>3. 단일 셀 Photoconversion
<ol><li>Confocal 소프트웨어 열고 캡처 및 초점 창 [그림 1]을 선택 합니다. 캡처 창에서 캡처 설정 드롭 다운 탭 [그림 1]에서 실험실 전용 변환 이미지 설정을 선택 합니다. 여기, 실험실 전용 설정 이라고 "물고기 ablate 전체 칩."</li>
	<li>C488 및 c541 레이저 필터 설정 메뉴에서 선택 합니다. 동일한 현미경 소프트웨어를 사용 하지 않는 경우 다른 레이저와 선택은 488 nm와 541 nm 레이저를 선택 하는 메뉴를 찾아. 300 ms에 노출 설정, 5, 파워 레이저 고 75 [그림 2] 강화. 이러한 레이저 설정은 photobleaching 또는 독성을 유발 하지 않고 충분 한 형광 신호를 생산에 따라 선택 됩니다. 독성 또는 photobleaching 시각 이다, 만약 레이저 전원 또는 노출을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>초점 창을 열고 초점 창에서 photomanipulation 탭을 클릭 합니다. 따라 레이저 매개 변수를 조정 합니다. 레이저 스택 전원 2로 변경 하 고 이동을 클릭 합니다. 1 래스터 블록 크기를 변경 하 고 설정을 클릭 합니다. 4를 두 번 클릭 크기를 변경 합니다. 레이저 라인 v405 변경 [그림 3].</li>
	<li>캡처 창에서 고급 캡처 설정을 엽니다. Photomanipulation 탭을 선택 하 고 2 번 반복을 변경 합니다. [그림 4] 확인을 클릭 합니다.</li>
	<li>초점 창에서 XY 탭을 선택 합니다. [그림 3, 그림 4] photomanipulation 탭에서 2 단계에서 레이저 매개 변수 확인 두 번. Photoconvert 주변 세포의 photoconversion 없이 관심의 셀 레이저 설정을 설정.<ol>
<li>Photoconversion 인접 한 셀의 경우 레이저 힘을 줄일 수 있습니다. 셀의 photoconversion 발생 하지 않으면, 레이저 능력을 늘릴 수 있습니다. 최적으로, 레이저 파워 photoconvert 관심과 하지 주변 지역에만 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>캡처 형식아래의 timelapse 상자를 확인 하십시오. 을 클릭 [그림 6A]를 시작 합니다.</li>
	<li>일단 라이브 timelapse 창이 열리면 상단 도구 모음의 [그림 7] 원 도구를 선택</li>
	<li>셀의 centermost 지역에서 원을 그립니다. 그려진된 동그라미를 클릭 마우스 오른쪽, FRAP 지역, 선택 하 고 3 초 동안 기다립니다. 선택 된 지역 주차 될 것 [그림 8]. 캡처 중지를 클릭 합니다.</li>
	<li>개 이상의 동물을 이미징 하는 경우 다시 포커스 메뉴와 선택 위치 2에서 XY 탭으로 이동 합니다. 그런 다음 단계 4.1 4.6 반복 합니다.</li>
	<li>세포의 인구를 변환 하려면 프로토콜 및 레이저 매개 변수 관심 영역을 졸라, 선 도구를 사용 하 여 원 그리기 대신 4.1-4.4 제외 하 고 단계를 따릅니다. 관심 지역에 선을 인출 하 고 위에 나열 된 동일한 매개 변수를 사용 하 여 영역을 졸라.</li>
</ol>4. 게시물-photoconversion 영상
<ol><li>일단 모든 포인트 photoconverted. 실험실 관련 표준 이미지 스택 precoversion 이미징 단계 3에서에서 설명한 설정을 선택 합니다. 이 캡처 캡처 창 [그림 5]에서 드롭 다운 탭 설정에서 발견 된다.</li>
	<li>C488 레이저를 선택 하 고 설정 300ms에 노출, 레이저 출력 5, 75 [그림 2] 강화.</li>
	<li>C541 레이저 c488 레이저 같은 메뉴 아래를 선택 합니다. 500 ms에 노출 설정, 레이저 10, 출력 하 고 75 [그림 9] 강화.</li>
	<li>캡처 형식 섹션에서 3D 상자를 확인 하십시오. 3D 캡처 섹션에서 현재 위치를 사용 하 여 선택 하 고 현재 주위 범위를 확인 합니다. 같은 섹션에서 35, 36, 비행기 및 1 단계 크기의 숫자 범위를 설정 합니다. 범위 수 있습니다 늘리거나 원하는 이미징 깊이 [그림 5]에 맞게.</li>
	<li>XY 포커스 탭에 여러 지점이 경우 캡처 창에서 멀티 목록 옵션을 선택 합니다. 그렇지 않은 경우에 현재 위치를 선택 합니다.</li>
	<li>클릭 이미지를 얻으려고 캡처 창의 맨 아래에서 시작 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

복잡 한 조직에서 다른 세포 유형 특정 도메인으로 구성합니다. 최근 기술 이러한 큰 조직 구조1,2,3내에서 개별 셀 라벨에 이용 되어 있다. 여기 마찬가지로 단일 세포 상호 작용 및 복잡 한 조직 내의 세포 인구 상호 작용을 시각화를 활용할 수 있는 두 가지 방법을 설명 합니다. Photoconversion 기술의 장점은 분명히 셀 라벨 과학자는 공간 제어입니다. 능력을 더 작은 노출은 현미경으로 큰 이미지 창에서 영역 지역으로 단일 세포 또는 단일 셀의 다른 세포와는 다르게 표시 될 수 있습니다 작은 이미지입니다. 지금 여러 photoconvertible 단백질이 더 광범위 하 게 기술7을 만드는 사회에 도입 되었습니다. Photoconvert 단백질을 세포 내에서 능력, 과학자는이 기술 또는 셀 마이그레이션, 세포 ...

여러 가지 셀 구축 하 고 복잡 한 동물 및 식물 조직 유지 작용. 이 세포는 종종 삽입 하 고 조직의 고정을 필요로 하는 높은 해상도 현미경 없이 단일 세포 수준에서 이웃에서 구별 하기 어려운. 그러나, 이해 하 고 어떻게 이러한 조직 형태는 유지, 고 병 될, 그것 되었습니다 어떻게 단일 조직 내의 세포 조사 필수 상호 작용 하는 시간이 지남에. 이상적으로, 이러한 실험 정착의 요구 사항 없이 비 침략 적 방식으로 조직 내의 단일 셀의 라벨 필요 합니다. 과학자는 지금이 작업1,2,,34를 달성 하기 위해 수많은 기술을 개발 했다.
발견과 해파리의 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구현1조직 환경 개별 셀의 라벨에 대 한 허용 한 흥미로운 접근 했다. 셀-특정 발기인을 사용 하 여, 유전자는1을 표시 하는 셀의 하위 집합을 선택 가능 하다.입니다. 또는, GFP의 바이러스 성 유도 식 GFP3,4의 사용자가 선택한 식에 대 한 이용하실 수 있습니다. 꽤 유용 하지만 GFP의 유전자 중재 표현; 조직에 있는 셀의 하위 집합 내에서 사용자가 선택한 식을 허용 하지 않습니다. 바이러스 성 표현의 GFP, 유리, 수 그리고 침략. 조직 내에서 더 부족 하 게 고유한 형광 단백질을 표현 하는 Brainbow 같은 영리한 기술과 GFP 파생 상품의 출현, 그것은 단일 셀 복잡 한 조직2, 에 그들의 사이에서 상호 작용을 시각화 수 되고있다 그러나 5., 이러한 접근 무작위 방식에서 셀 라벨. 원하는 실험 단일 셀의 시각화 또는 실험에 의해 정의 된 셀의 인구는 경우, 그들은 따라서 제한 됩니다. 이러한 실험 구분, 단일 셀 방식에서에 조작 될 수 있다 유전자 표현 형광 단백질을 것 그것은 다른 형광 비 형광 세포에서.
이 목표를 달성 하 고 단일 셀 복잡 한 살아있는 조직 내에서 세포 생물학을 시각화, 과학계에서는 고유한 형광 단백질6,,78의 단일 셀 photoconversion을 사용 합니다. 빨간 형광 상태로 자외선에 노출 되 면 녹색에서 전환 하는 photoconvertible 단백질 (즉, eos, 단풍나무, 등)의 표현을 제어 유전자를 사용 하 여 (488 nm) 빛, 우리는 붙일 레이블에서 한 단일 셀을 구분할 수 있습니다 이웃6,,78. 이 방법은 관심의 회절 제한 지역에 레이저 스택에서 빛을 직접 수 있는 우리의 confocal 현미경에 부착 된 기구를 이용 한다. 이 기술 우리 중 단일 셀 또는 사용자 정의 방식으로9,,1011에 더 큰 인구 레이블을 수 있습니다. 기술은 바이러스 GFP의 단일 세포 주사에 비해 최소한 침략 적 이다. 개념의 증거로 서 우리는 우리가 신경 절 말 초 신 경계 및 척수9,10의 복 부 쪽에 위치한 셀 같은 photoconvert 큰 인구 내의 photoconvert 단일 셀 수 보여 11,12. 우리 다음 그들의 운동 및 분화 발전 과정에 대 한 통찰력을 얻기 위해 이러한 photoconverted 세포 인구 24 h 나중을 시각화할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) 제브라피쉬 동물</td><td></td><td></td><td>fish는 노트르담 대학교의 어류 시설에서 얻어져 교배되었습니다.</td></tr><tr><td>100 X 15 mm 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>배아 매체</td><td></td><td></td><td>배아 배지는 매주 만들어지며 5L RO 물, 30uL 메틸렌 블루 및 200mL 소금 스톡을 포함하는 노트르담 대학교의 어류 시설에서 제공합니다.</td></tr><tr><td>0.8 % 낮은 융점 Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm 유리 커버 슬립 바닥 페트리 접시</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>바늘 해부 프로브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.002% 3-아미노벤조산 에스테르(트리카인)</td><td>Fluka 분석</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>GFP 필터가 있는 형광 해부 현미경</td><td>Zeiss Axiozoom</td> GFP 및 RFP 필터 세트를 여기시키는 레이저가 있는 Zeiss Axiozoom <td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>3i 회전 디스크 컨포칼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광 변환 용 UV 광원 (레이저)</td><td>405nm 레이저</td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 북 소프트웨어</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

생활 그대로 zebrafish에 단일 셀 photoconversion

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

동물 및 식물 조직 세포의 명료한 인구로 구성 됩니다. 이러한 셀 구축 하 고 조직 유지 시간에 따라 상호 작용 하 고 질병 중단 하는 경우 발생할 수 있습니다. 과학자 들은 셀의 하위 집합에 형광 단백질을 표현 하 여 특성과 그대로 조직 내 이러한 세포의 자연 역학 조사를 영리한 기술을 개발 했습니다. 그러나, 실험 시간에 단일 셀 또는 셀 인구 방식에 때로는 조직 내의 셀의 선택 된 시각화 더 필요합니다. 하이 고 셀의 인구 내의 단일 셀을 시각화, 과학자는 형광 단백질의 단일 셀 photoconversion를 활용 하 고. 이 기법을 보여, 우리 여기 어떻게 보여 UV 빛을 지시는 그대로의 Eos 표현 셀 zebrafish 생활. 우리는 다음 그들이 어떻게 조직에 변경 확인 하 photoconverted Eos+ 셀 24 h 나중 이미지. 우리는 두 가지 기술을 설명: 셀 photoconversion 및 photoconversions의 세포의 인구. 이 기술은 세포 세포 상호 작용, 세포 운명 및 차별화, 그리고 셀 마이그레이션, 그건 수많은 생물학 질문에 적용 하는 기술 시각화를 사용할 수 있습니다.

Photoconversion 형광 단백질의 조직6내에서 개별 셀을 사용할 수 있습니다. 이 보여, Tg(sox10:eos) 물고기9 sox10의 규제 시퀀스에서 photoconvertible 단백질 Eos 표현 하 사용 되었다. 48 Tg(sox10:eos) 동물 hpf 했다 처음 탑재, 그리고 다음 발생 했을 수 있는 일반적인 photoconversion 감지 하 군데. Eos Eos photoconverted 형광 신호 작은 비전향된 형광 신호는 다음 시각화 (그림 10). 동물은 일반적인 photoconversion는 최소 보장 하기 위해 어둠 속에서 유지 했다. 그럼, 관심 영역 confocal 현미경 설정을 사용 하 여 자외선에 노출 되었다. 확인 하려면 단일 셀 UV 노출의 ...

여기, 우리가 어떻게 셀 photoconversion 형광 단백질, Eos, 살아있는 동물을 표현 하는 특정 영역에 자외선 노출을 통해 이루어집니다 보여 프로토콜 제시.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

이 광변환 기술의 전반적인 목표는 단일 동물의 단일 세포를 다른 형광 세포 집단과 구별하는 것입니다. 이 방법은 해당 분야의 주요 발달 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 시간 경과에 따른 단일 세포 이동을 시각화할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소 침습적이며 단일 세포 또는 더 큰 집단을 라벨링하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.또한 사용자는 특정 관심 영역을 선택하고 원하는 대상을 사진 변환할 수 있습니다. 광변환 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬를 수컷과 암컷으로 짝짓기하고 텍스트 프로토콜에 따라 난자를 채취한 후, 488나노미터 광원과 GFP 필터 세트가 있는 해부 현미경을 사용하여 24개의 hpf 배아를 스크리닝합니다. 바늘이나 핀셋을 사용하여 배아를 수동으로 분리하십시오.전자 레인지에서 0.8 % 낮은 융점 아가로 스 용액 5 밀리리터로 준비합니다. 아가로스가 만졌을 정도로 식으면 3-4개의 마취된 형질전환 sox10 eos positive 48 hpf 물고기를 10mm 유리 덮개 슬립 바닥 페트리 접시 중앙에 놓습니다. 약 1mm 또는 커버 슬립 표면을 덮을 만큼 충분한 아가로스를 추가합니다.그런 다음 프로브 바늘을 사용하여 물고기를 옆으로 정렬하고 필요에 따라 조정하면 아가로스가 응고되는 데 약 2분이 걸립니다. 아가로스가 2분 동안 응고된 후 0.02%아미노벤조산 에스테르 트리카인이 함유된 배아 배지를 한천과 접시의 바닥 표면이 잠길 때까지 접시에 천천히 추가합니다. 컨포칼 현미경 검사를 수행하려면 컨포칼 소프트웨어를 열고 캡처 및 초점 창을 선택합니다.사전 변환 이미징을 수행하려면 capture window 및 capture setting 드롭다운 탭에서 이미징 매개변수를 선택합니다. 다음은 물고기 이미징이라고 하는 실험실별 스택 설정입니다. 표본을 컨포칼 현미경에 놓고 굵고 미세한 조정 손잡이를 사용하여 초점을 맞춥니다.그런 다음 초점 창을 열고 등쪽 뿌리 신경절과 같은 원하는 관심 영역을 찾습니다. 필터 세트 메뉴에서 c488 레이저를 선택하고 노출을 300밀리초, 레이저 출력을 5, 강화를 75로 설정합니다. 그런 다음 캡처 유형 섹션에서 3D 상자를 선택합니다.3D 캡처 섹션에서 현재 위치 사용을 선택하고 현재 주위의 범위를 확인합니다. 동일한 섹션에서 범위를 35로, 평면 수를 36으로, 단계 크기를 1로 설정합니다. 현재 위치를 선택한 다음 캡처 창 하단의 시작을 클릭하여 이미지를 획득합니다.광 변환 프로세스 전에 레이저 매개변수를 두 번 및 세 번 확인하십시오. 변환 창이 열려 있을 때 변환 설정을 다시 조정해야 하는 경우가 있습니다. 캡처 창의 캡처 창 설정 드롭다운 탭에서 랩별 변환 이미징 설정을 선택합니다.여기서 실험실 특정 설정을 fish ablate full chip이라고 합니다. 필터 메뉴 세트에서 c488 및 c541 레이저를 선택합니다. 노출을 300밀리초로, 레이저 출력을 5로, 강도를 75로 설정하면 광표백이나 독성을 일으키지 않고 충분한 형광 신호를 생성할 수 있습니다.초점 창에서 photomanipulation 탭을 클릭하고 laserstack power를 2로 변경한 다음 go를 클릭합니다. 래스터 블록 크기를 1로 변경하고 세트를 클릭합니다. 그런 다음 더블 클릭 크기를 4로 변경하고 레이저 라인을 v405로 변경합니다.그런 다음 캡처 창에서 고급 캡처 설정을 엽니다. photomanipulation 탭을 선택하고 두 번 클릭 반복을 두 번으로 변경한 다음 확인을 클릭합니다. 포커스 창에서 xy 탭을 선택합니다.photomanipulation 탭에서 레이저 매개변수를 다시 확인하십시오. 그런 다음 주변 세포의 광변환 없이 관심 세포를 광변환하도록 레이저 설정을 지정합니다. Capture type(캡처 유형)에서 Timelapse(타임랩스) 상자를 선택한 다음 start(시작)를 클릭합니다.라이브 타임랩스 창이 열리면 상단 도구 모음에서 원 도구를 선택합니다. 셀의 가장 가운데 영역에 원을 그린 다음 그려진 원을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 FRAP 영역을 선택한 다음 3초 동안 기다립니다. 선택한 영역이 어두워지면 캡처를 중지해야 합니다.두 개 이상의 동물을 이미징하는 경우 초점 메뉴의 xy 탭으로 돌아가서 위치 2를 선택합니다. 그런 다음 사진 변환을 반복합니다. 세포 집단을 변환하려면 타임랩스 창을 열어 프로토콜과 레이저 투과계를 따르십시오.이제 관심 영역을 FRAP하기 위해 원을 그리는 대신 선 도구를 사용하여 관심 영역에 선을 그립니다. 그런 다음 방금 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 영역을 FRAP합니다. 모든 포인트가 포토컨버팅되면 캡처 창의 캡처 설정 드롭다운 탭에서 이 비디오의 앞부분에서 설명한 랩별 표준 스택 설정을 선택합니다.c488 레이저를 선택하고 노출을 300밀리초, 레이저 출력을 5, 강화를 75로 설정합니다. c541 레이저를 선택하고 노출을 500밀리초로, 레이저 출력을 10으로, 강화를 75로 설정합니다. 캡처 유형 섹션에서 3D 상자를 선택합니다.3D 캡처 섹션에서 현재 위치 사용을 선택하고 현재 주위의 범위를 확인합니다. 같은 섹션에서 범위를 35로, 평면 수를 36으로, 단계 크기를 1로 설정합니다. 범위 번호는 원하는 이미징 깊이를 수용하기 위해 증가하거나 감소할 수 있습니다.xy 포커스 탭에 곱하기 포인트가 있는 경우 캡처 창에서 멀티포인트 목록 옵션을 선택합니다. 그렇지 않은 경우 현재 위치를 선택합니다. 마지막으로 캡처 창 하단에서 시작을 클릭하여 이미지를 획득합니다.이 패널은 형질전환 제브라피시의 신경절 내에 있는 단일 prephoto conversion cell을 보여주며, sox10 조절 서열의 제어 하에 광변환 가능한 eos 단백질을 발현합니다. 광변환 후, eos는 관심 영역 내에 뚜렷하게 존재했지만 인접 세포는 표시되지 않았습니다. 이 광변환 기술의 유용성을 입증하기 위해, 척수의 복부 쪽에 있는 세포 집단을 선을 사용하여 자외선에 노출시켰습니다.그 후, 라인 영역에서 광변환된 eos 단백질을 보여주는 이미지를 촬영했습니다. 광전환되지 않은 eos 단백질은 다른 모든 영역에서 볼 수 있었습니다. 광변환 후 몇 시간 후, 등쪽과 배쪽 위치 모두에서 척수 부위 전체에 흩어져 있는 광변환된 eos 양성 세포를 보여주는 동일한 이미지가 촬영되었습니다.이 발견은 배쪽 척추 세포가 등쪽 위치로 재배치되었다는 가설과 일치합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 30분에서 45분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 관심 영역이 광 변환을 경험했는지 확인하기 위해 변환 후 이미지를 촬영하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 시간 경과에 따른 세포 이동 및 역학을 관찰하기 위해 타임랩스 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형광 세포 집단 내에서 단일 세포를 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 필요한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.예를 들어, 절대로 빛을 직접 응시하지 마십시오.

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

본 연구에서는 살아있는 제브라피시 배아 내에서 광전환형 형광 단백질(PCFPs)의 광활성화 스위칭 방법과, 발달 과정 중 특정 시점에서 광전환된 단백질을 추적하는 방법을 제시합니다. 이 방법론을 통해 살아있는 척추동물 유기체 내에서 다양한 발달 과정의 근간이 되는 세포 생물학적 사건들을 모니터링할 수 있습니다.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

이 비디오는 광전환 가능한 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피시 유충을 사용하여 백혈구 동원을 추적하는 방법을 보여줍니다. 적색 형광 염료 표지 박테리아를 이낭에 사전 주입하고 광변환을 유도하면 백혈구의 이동, 식균작용 및 몸 전체의 분산을 관찰할 수 있어 면역 반응 역학에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

박테리아에 감염된 형질전환 제브라피시의 광변환 기반 백혈구 추적

종양 이전 세포의 진행과 선천성 면역 세포 상호 작용의 가장 초기 사건을 연구하는 것은 암을 이해하고 치료하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 상피 세포 형질전환을 조건부로 유도하는 방법과 제브라피시 유충에서 피부 세포를 발현하는 HRASG12V와 선천성 면역 세포 상호 작용의 후속 라이브 이미징에 대해 설명합니다.

애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

우리는 GFP 형질전환 배경에서 생체 내 세포 추적을 위한 강력하고 간단하며 비용이 저렴한 도구로 광변환 가능한 PSmOrange 시스템을 구축했습니다. 이 프로토콜은 제브라피시 모델 시스템에서의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

이 프로토콜에가 생활의 endocardial 세포에서 형광 단백질의 photoconversion에 대 한 방법을 설명 합니다 zebrafish 태아 것 운하 및 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀의 추적을 가능 하 게 .

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

선물이 zebrafish 태아 transfection 라이브 셀 이미징 뿐만 아니라 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀을 준비 하는 프로토콜의 기본 셀 문화를 준비 하기 위한 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

학습하세요 Danio rerio에서 UV 노출을 통한 단일 세포 포토컨버전 기법으로 세포 이동을 실시간 관찰하는 방법을. 이 최소 침습적 기술은 발달 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

더 많은 동영상 탐색