마우스 지방 조직 수집 및 RNA 분석에 대 한 처리

이 절차의 전반적인 목표는 서로 다른 마우스의 백색 지방 조직 저장소의 적절한 샘플 수집을 보장하고 조직에서 양질의 RNA를 다량 분리하는 것입니다. 이 방법은 신진대사, 생화학 및 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있으며, 예를 들어 처리되거나 유전자 변형된 마우스의 지방 조직에서 유전자 발현과 관련이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적으로 RNA 함량이 낮은 지방 조직에서 양질의 RNA를 다량 분리할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 연구 조교인 에밀리 페핀(Emilie Pepin)입니다. 쥐를 안락사시킨 후 텍스트 프로토콜에 따라 알바 선(linea alba) 위의 피부를 자른 다음 흉곽 중앙에서 오른팔 방향으로 약 2cm, 오른쪽 뒷다리 위의 생식기 가까이에서 두 개의 절개를 만듭니다. 열린 피부의 한쪽 모서리를 펴고 22게이지 바늘을 사용하여 패드에 고정합니다.

그런 다음 다른 모서리를 고정합니다. 수술용 가위를 사용하여 피부에 최대한 평평하게 놓고 복부 피하 지방(SCF)을 둔기로 절제한 다음 미리 자른 알루미늄 호일 조각으로 옮깁니다. 동물의 왼쪽에 대해 해부를 반복합니다.

그런 다음 알루미늄 호일에 왼쪽과 오른쪽으로 수집된 지방 패드를 모두 당기고 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결합니다. 내장 지방 조직에 접근하려면 알바 선(linea alba)을 따라 복부 근육을 자릅니다. 그런 다음 생식기에서 양쪽 마우스 뒤쪽으로 복부 근육을 절개합니다.

생식 기관 주변의 지방은 성선주위 지방(perigonadal fat) 또는 PGF입니다. 부고환, 고환 및 유관에서 왼쪽 및 오른쪽 지방 패드를 분리하고 미리 라벨링된 알루미늄 호일로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 액체 질소로 동결합니다.

왼쪽부터 시작하여 장을 복강에서 오른쪽으로 이동하여 신장을 노출시킵니다. 여기에서 신장과 부신을 둘러싸고 있는 지방 조직은 신장 주위 지방 또는 PRF입니다. PRF를 수집하기 전에 부신을 분리하고 제거하십시오.

이것은 지방 조직보다 약간 더 분홍색이기 때문에 지루할 수 있습니다. 이제 PRF를 뒤쪽 근육 벽에서 분리하고 PRF와 신장을 신체의 나머지 부분과 분리하는 요관, 신장 동맥 및 정맥을 절단하십시오. 그런 다음 신장 캡슐을 절단하고 제거하여 PRF를 신장에서 분리합니다.

오른쪽 PRF를 분리한 후 왼쪽의 조직과 함께 샘플을 알루미늄 호일로 옮기고 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결합니다. 1.5ml RNase가 없는 원뿔형 튜브, 모르타르와 절굿공이, 주걱을 텍스트 프로토콜에 따라 액체 질소에 냉각합니다. 지방 조직 샘플을 모르타르에 넣은 다음 갈색 종이를 몇 겹 사용하여 액체 질소에서 유봉을 들어 올려 모르타르에 끼웁니다.

종이와 함께 유봉을 잡고 망치를 사용하여 유봉 상단을 한두 번 치십시오. 다음으로, 미세한 분말이 얻어질 때까지 회전 동작을 사용하여 샘플을 분쇄합니다. 그런 다음 유봉을 제거하고 액체 질소에서 주걱을 꺼내 샘플을 미리 냉각된 1.5ml 원추형 튜브로 옮기는 데 사용합니다.

샘플이 녹는 것을 방지하기 위해 때때로 주걱을 액체 질소에 다시 담그십시오. 또한 샘플이 해동되는 것을 방지하기 위해 원추형 튜브를 드라이아이스에 보관하십시오. 적절한 RNA 수율을 위해 원뿔형 튜브를 분쇄 샘플로 약 2/3 용량으로 채웁니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 나머지 샘플을 준비합니다. 화학 물질 후드 아래에서 실험실 가운, 장갑 및 보안경을 착용한 상태에서 액체 질소에서 분쇄 샘플을 제거합니다. 튜브를 천천히 열고 500마이크로리터의 페놀 용액을 추가합니다.

튜브의 뚜껑을 닫고 최대 속도로 약 5초 동안 와류를 일으킨 다음 천천히 조심스럽게 튜브를 열어 질소의 압력을 해제합니다. 튜브에서 나오는 공기 소리가 들립니다. 추가로 500마이크로리터의 페놀 용액을 튜브에 피펫으로 넣습니다.

그런 다음 소용돌이치고 이전과 같이 천천히 엽니다. 샘플이 완전히 용해될 때까지 볼텍스합니다. 그런 다음 추가 샘플을 처리하기 전에 튜브를 열어 압력을 해제합니다.

모든 샘플이 처리되면 최대 속도로 잠시 와류로 회전시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 12, 000 시간 G 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에서 튜브를 원심 분리하십시오. 그런 다음 튜브를 다시 실온으로 가져옵니다.

오염을 방지하려면 각 샘플에 대해 팁이 필터링된 P1000 피펫을 사용하여 튜브 측면 근처의 지질 상을 뚫어 중간 분홍색 층에서 가능한 한 많은 RNA를 분리합니다. 팁 외부에 존재하는 지질이 전달되는 것을 방지하기 위해 튜브의 측면을 건드리지 않고 RNA를 새로운 원뿔형 튜브에 분배합니다. 각 샘플에 200마이크로리터의 순수 클로로포름을 추가하고 15초 동안 반전으로 튜브를 혼합합니다.

그런 다음 실온에서 10분 동안 샘플을 배양한 후 12, 000회 G 및 섭씨 4도에서 15분 동안 튜브를 원심분리하고 튜브를 실온으로 다시 가져옵니다. 각 샘플에 대해 P1000 피펫과 여과된 팁을 사용하여 가능한 한 많은 수성 투명 RNA 함유 상상(top phase)을 해당 원뿔형 튜브의 두 번째 세트로 이동합니다. 다음으로, 각 샘플에 500마이크로리터의 100% 이소프로판올을 추가하고 15초 동안 반전으로 튜브를 혼합합니다.

그런 다음 실온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 튜브를 실온으로 되돌리기 전에 12, 000회 G 및 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브를 원심분리하십시오. 이소프로판올을 각 튜브 밖으로 부어 버리십시오.

이제 각 샘플에 1ml의 75% 에탄올을 추가하고 최대 속도로 튜브를 잠시 와류시킵니다. 그런 다음 7, 500배 G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 샘플을 회전시켜 실온에 가져온 후 각 튜브를 뒤집고 갈색 종이에 두드려 잔류 에탄올을 제거하여 75% 에탄올을 버립니다.

뚜껑을 열어 두고 RNA 펠릿을 약 15-20분 동안 자연 건조시킵니다. RNA 펠릿의 크기를 평가한 후 각 샘플에 10-25마이크로리터의 RNase-free 물을 추가합니다. 샘플을 섭씨 60도의 가열 블록에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 튜브를 잠시 와류로 만듭니다. 동일한 열 블록에서 샘플을 추가로 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 모든 샘플을 빠르게 회전시키고 즉시 얼음 위에 놓습니다.

text protocol에 따라 지방 조직에서 유전자 발현을 위한 RT-PCR을 수행합니다. 예상대로, 고지방 다이어트를 한 쥐는 정상 다이어트를 한 쥐에 비해 체중과 체중 증가가 증가했다. 이러한 관찰은 정상 식단을 섭취한 쥐에 비해 비만 마우스에서 PGF, PRF 및 SCF의 체중이 2배 이상 증가한 것을 동반했습니다.

이 표는 각 백색 지방 조직에 대해 페놀 용액에 의한 RNA 분리가 RNA에 대해 순수한 것으로 간주되는 약 2.0의 OD280 이상의 OD260으로 샘플을 생성했음을 보여줍니다. 이 막대 그래프에서 볼 수 있듯이 realtime PCR 데이터는 비만 마우스의 PGF, PRF 및 SCF에서 렙틴 mRNA 발현이 정상 식단을 섭취하는 마우스에 비해 유의하게 높다는 것을 보여주었습니다. 렙틴 mRNA 발현에서 관찰된 차이는 CT 값이 변경되지 않았기 때문에 두 그룹의 마우스 간의 결과를 정규화하는 데 사용된 참조 유전자인 s16의 변이에 기인하지 않았습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 RNA 추출 절차 중에 RNase가 없는 환경에서 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자 발현 변형과 같은 추가 질문에 답하기 위해 realtime PCR 증폭과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 신진대사 분야의 연구자들이 설치류의 비만 및 당뇨병과 관련된 지방 조직 조절을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다양한 지방 패드를 분리하고 RNA를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 페놀 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험실 가운과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.