Name: 마우스 지방 조직 수집 및 RNA 분석에 대 한 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 마우스 백색 지방 조직 수집 및 고품질 RNA 추출 방법을. 이 기술은 대사 및 분자생물학 연구에서 유전자 발현 분석에 필수적이며, 특히 유전자 변형 마우스 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 당뇨병 캐나다에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC. Public Health. 9, 88(2009).</li>
<li>Wronska, A., Kmiec, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characteristics+of+various+white+adipose+tissue+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots.</a> Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).</li>
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<li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnol. 14, 94(2014).</li>
<li>Tan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+prorenin%2Frenin+receptor+on+the+development+of+obesity+and+associated+cardiometabolic+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver.+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors.</a> Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), 1-5 (2010).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+a+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+increases+in+circulating+prorenin+are+not+associated+with+renal+or+cardiac+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies.</a> Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).</li>
<li>Dusaulcy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-specific+disruption+of+autotaxin+enhances+nutritional+fattening+and+reduces+plasma+lysophosphatidic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid.</a> J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines%3A+a+link+between+obesity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease.</a> J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+RT-quantitative+PCR%3A+firsthand+observations+of+implementation+of+minimum+information+for+the+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments+%28MIQE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE).</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).</li>
<li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

다음 먹이 HF-다이어트, 비만 쥐 몸 및 백색 지방 조직 가중치 N 규정식 먹인 쥐에 비해 증가을 발견 했다. 페 놀 솔루션을 사용 하 여 추출 하는 RNA 좋은 순도와 샘플을 굴복. Leptin은 주로 지방 조직에 의해 생산 하는 adipokine 및 지방 대량16와 긍정적으로 상관 관계 알려져 있다. 예상 했던 대로, leptin mRNA 식 그들의 뚱뚱한 질량을 가진 concomitance에서 비만 생쥐에서 증가 했다.
이 메서드는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 다른 지방 조직 창 고 다른 기능2,5는 알려진 대로 중요 한 다른 한 백색 지방 조직 창 고의 오염입니다. 오염 다운스트림 응용 프로그램에서 잘못 된 결과 가져올 수 있다. 또한, 지방 쥐 사이 일정 하 고 일관 된 속도로 백색 지방이 많은 직물 수집 공기와 접...

비만 타입-2 당뇨병1등 합병증으로 이어질 수 있는 전 세계적으로 유행 하는. 다이어트 유발 된 비만 유전자 변형 동물 모델에 비만 관련 된 합병증의 연구 자주 사용 됩니다. 전통적으로, 백색 지방 조직 초과 에너지를 위한 저장 격실으로 알려져 있다 이며 주로 지질 구성 된 갈색 지방 조직 열2,3로 에너지를 변환 하는 동안. 지방 조직 동적 확장 하 고 음식 섭취 량과 신체 활동 등 많은 요인에 따라 축소 됩니다. 따라서, 이러한 변화에 기여 요인 결정, 적절 한 지방 조직 수집 및 처리는 필요4.
가운데 흰색 adipose 조직, 그것 일반적으로 피하와 내장 지방 저장소 해부학 지역화 등 다른 속성 있고,2,5기능 허용 됩니다. 따라서, 충돌 하는 결과 또는 큰 변화를 방지 하려면 주의 지방 패드를 수집 하는 때이 다른 지방 저장소 간의 교차 오염을 방지로 이동 해야 합니다.
또한, RNA 또는 단백질 흰 쥐의 지방 조직에서 분리 하는 경우 세 가지 주요 과제 있다. 첫째, 비만 쥐에서 지방 패드를 수집 하지 않습니다 쉬운 일 다른 백색 지방 창 고를 분리 하는 테두리는 항상 명확 하 고, 신장과 심장6등 다른 장기와 달리. 둘째, 지방 조직, RNA 또는 단백질 격리 중의 높은 지질 내용 때문에 지질 층 위에 수레 하 고 샘플에 대 한 직접 액세스를 방지. 셋째, 갈색 지방이 많은 직물, 또는 다른 조직, 반대로 백색 지방 조직 내용이 상당히 낮은 RNA와 단백질 및이 젊은 마우스를 사용할 때 주요 관심사의, 쥐 먹이 정상 (N) 다이어트 이며 쥐 것으로 예상 된다 낮은 뚱뚱한 질량 (즉 코 모델, 치료 약물, 운동 훈련, 등.) 7 , 8.
따라서, 지방 조직에서 RNA를 분리 하는 적절 한 방법을 선택이 중요 합니다. 페 놀/클로 프롬 추출 대체 방법을 상용 키트 있습니다. 그들은 일반적으로 RNA 정화 열9에 따라 초기 페 놀 추출 단계를 기반으로 합니다. 그러나, 그 키트는 일반적으로 더 비싼 및 샘플 낮은 수율의 RNA 품질 변수 수도 주지만 적은 시간이 소요 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 페 놀 솔루션/클로 프롬 추출에 가장 큰 장점 중 하나는 RNA, DNA, 그리고 단일 샘플10에서 단백질 분리의 가능성입니다. 쥐 지방 패드는 일반적으로 작은 있기 때문에 (특히 상체 마우스 모델)에서 RNA와 단백질의 소량을 주고, 이러한 프로토콜 작은 샘플에서 얻을 수 있는 데이터를 극대화 합니다.
이 문서의 목적은 3 쥐 백색 지방 조직 창 고 수량 및 RNA 격리의 품질에서 적절 한 샘플 컬렉션을 확인 하는 방법을 자세히 설명 하기 위해. 이 프로토콜에 따라 얻은 RNA 실시간 PCR 분석 실험을 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 교양된 기본 adipocytes에서 RNA 격리에 대 한 것이 아닙니다.

<table><tbody><tr><td>1mL seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE 용액(10mM Tris-HCl 및 1mM EDTA&bull; Na2입니다. pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G 바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G 바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>블록 히터 (건조 목욕)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I(1 U/&마이크로; 엘)&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox) 형광 염료&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜치&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고지방 쥐 다이어트</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>렙틴 순방향 PCR 프라이머(5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>렙틴 역방향 PCR 프라이머(5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima 역전사효소(효소 및 5x 완충액)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>나노 순수 (초순수라고 함)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니트릴 검사 장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 설치류 다이어트</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫맨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 피펫맨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 피펫맨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 피펫맨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페놀 용액(TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>사전 식별된 알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>석영 분광광도계 큐벳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>랙 PCR 튜브 스트립</td><td></td><td></td><td></td>용</tr><tr><td>랙 RT-PCR 튜브 스트립</td><td></td><td></td><td></td>용 랙</tr><tr><td>랜덤 헥사머&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR Rotor Gene 시스템&nbsp;</td><td>Corbett 연구</td><td>RG-3000 Rotor-Gene 열 순환기</td><td></td></tr><tr><td>냉장 벤치탑 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase 억제제&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 1.5 mL screw cap tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free PCR 튜브 스트립 (0.2 mL) 및 캡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 물&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR 기계</td><td>, Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR 튜브 스트립(0.1mL) 및 캡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 정방향 PCR 프라이머(5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3'), 10uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 역방향 PCR 프라이머(5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 모르타르와 유봉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술 패드</td><td>집에서 만든 폼 보드는 일회용 흡수성 언더패드</td><td></td><td></td>에 싸여</tr><tr><td>있습니다. 수술용 가위&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>열 순환기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 순환기&nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>계량 주걱</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 지방 조직 수집 및 rna 분석에 대 한 처리

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

다른 조직에 비해, 백색 지방 조직 있으므로 주로 지질 상당히 적은 RNA와 단백질 콘텐츠를 실시간 PCR 및 서쪽 오 점, 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 있다. 추가 단계는이 지질을 방지 하는 데 필요한 지방 조직 샘플에서 RNA 절연은 또한 도전 이다. 여기, 우리 3 해부학 다른 흰색 adipose 조직 생쥐, 이러한 샘플을 처리 하 고 RNA 격리 수행에서 수집 하는 절차를 제시. 우리는 더 실시간 PCR를 사용 하 여 cDNA 그리고 유전자 식 실험의 합성을 설명 합니다. 이로써 설명된 프로토콜에서 동물의 머리와 지방 패드 교차 오염을 조직 수집 하는 동안 다른 지방 패드 사이 혈액 오염의 감소 수 있습니다. 그것은 또한 적절 한 수량 및 RNA 추출의 품질을 보장 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 지방 조직 샘플은 실시간 PCR 등 일상적인 실험에 필요한 모든 마우스 모델에 널리 적용 될 수 있지만 기본 adipocytes 세포 배양에서 격리에 적합 하지 않습니다.

검 시 절차에 따라 3 개의 흰색 adipose 조직 수집 되었고 쥐 (N와 HF 다이어트 먹이 쥐)의 두 그룹에서가 중. 예상 했던 대로, 쥐 HF 다이어트 최종 몸 무게와 체중 증가 littermates N 다이어트 (표 1)에 비해 증가 했다. 이러한 관측 함께 했다 이상 2-fold 증가 비만 생쥐에서 PGF, PRF, SCF의 무게에 그에 비해 N 다이어트에.
격리 된 RNA와 어떤 실험을 수행 하기 전에 단계 4.9에에서 설명 된 대로 그것의 순수성 평가 되었습니다. 각 백색 지방 조직에 대 한 페 놀 솔루션 RNA 격리 RNA (표 2)에 대 한 순수한 것으로 간주 되는 비율 OD260/OD280은 약 2.0 샘플 적절 한 품질을 생산. 실시간 PCR 데이터 보여주었다 leptin mRNA ...

이 문서의 목적은 마우스에서 다른 흰색 adipose 조직 수집, 지방 샘플 처리 RNA를 추출 하는 단계별 절차를 제시 하는 것입니다.

마우스 지방 조직 수집 및 RNA 분석에 대 한 처리

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

이 절차의 전반적인 목표는 서로 다른 마우스의 백색 지방 조직 저장소의 적절한 샘플 수집을 보장하고 조직에서 양질의 RNA를 다량 분리하는 것입니다. 이 방법은 신진대사, 생화학 및 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있으며, 예를 들어 처리되거나 유전자 변형된 마우스의 지방 조직에서 유전자 발현과 관련이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적으로 RNA 함량이 낮은 지방 조직에서 양질의 RNA를 다량 분리할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 연구 조교인 에밀리 페핀(Emilie Pepin)입니다. 쥐를 안락사시킨 후 텍스트 프로토콜에 따라 알바 선(linea alba) 위의 피부를 자른 다음 흉곽 중앙에서 오른팔 방향으로 약 2cm, 오른쪽 뒷다리 위의 생식기 가까이에서 두 개의 절개를 만듭니다. 열린 피부의 한쪽 모서리를 펴고 22게이지 바늘을 사용하여 패드에 고정합니다.그런 다음 다른 모서리를 고정합니다. 수술용 가위를 사용하여 피부에 최대한 평평하게 놓고 복부 피하 지방(SCF)을 둔기로 절제한 다음 미리 자른 알루미늄 호일 조각으로 옮깁니다. 동물의 왼쪽에 대해 해부를 반복합니다.그런 다음 알루미늄 호일에 왼쪽과 오른쪽으로 수집된 지방 패드를 모두 당기고 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결합니다. 내장 지방 조직에 접근하려면 알바 선(linea alba)을 따라 복부 근육을 자릅니다. 그런 다음 생식기에서 양쪽 마우스 뒤쪽으로 복부 근육을 절개합니다.생식 기관 주변의 지방은 성선주위 지방(perigonadal fat) 또는 PGF입니다. 부고환, 고환 및 유관에서 왼쪽 및 오른쪽 지방 패드를 분리하고 미리 라벨링된 알루미늄 호일로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 액체 질소로 동결합니다.왼쪽부터 시작하여 장을 복강에서 오른쪽으로 이동하여 신장을 노출시킵니다. 여기에서 신장과 부신을 둘러싸고 있는 지방 조직은 신장 주위 지방 또는 PRF입니다. PRF를 수집하기 전에 부신을 분리하고 제거하십시오.이것은 지방 조직보다 약간 더 분홍색이기 때문에 지루할 수 있습니다. 이제 PRF를 뒤쪽 근육 벽에서 분리하고 PRF와 신장을 신체의 나머지 부분과 분리하는 요관, 신장 동맥 및 정맥을 절단하십시오. 그런 다음 신장 캡슐을 절단하고 제거하여 PRF를 신장에서 분리합니다.오른쪽 PRF를 분리한 후 왼쪽의 조직과 함께 샘플을 알루미늄 호일로 옮기고 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결합니다. 1.5ml RNase가 없는 원뿔형 튜브, 모르타르와 절굿공이, 주걱을 텍스트 프로토콜에 따라 액체 질소에 냉각합니다. 지방 조직 샘플을 모르타르에 넣은 다음 갈색 종이를 몇 겹 사용하여 액체 질소에서 유봉을 들어 올려 모르타르에 끼웁니다.종이와 함께 유봉을 잡고 망치를 사용하여 유봉 상단을 한두 번 치십시오. 다음으로, 미세한 분말이 얻어질 때까지 회전 동작을 사용하여 샘플을 분쇄합니다. 그런 다음 유봉을 제거하고 액체 질소에서 주걱을 꺼내 샘플을 미리 냉각된 1.5ml 원추형 튜브로 옮기는 데 사용합니다.샘플이 녹는 것을 방지하기 위해 때때로 주걱을 액체 질소에 다시 담그십시오. 또한 샘플이 해동되는 것을 방지하기 위해 원추형 튜브를 드라이아이스에 보관하십시오. 적절한 RNA 수율을 위해 원뿔형 튜브를 분쇄 샘플로 약 2/3 용량으로 채웁니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 나머지 샘플을 준비합니다. 화학 물질 후드 아래에서 실험실 가운, 장갑 및 보안경을 착용한 상태에서 액체 질소에서 분쇄 샘플을 제거합니다. 튜브를 천천히 열고 500마이크로리터의 페놀 용액을 추가합니다.튜브의 뚜껑을 닫고 최대 속도로 약 5초 동안 와류를 일으킨 다음 천천히 조심스럽게 튜브를 열어 질소의 압력을 해제합니다. 튜브에서 나오는 공기 소리가 들립니다. 추가로 500마이크로리터의 페놀 용액을 튜브에 피펫으로 넣습니다.그런 다음 소용돌이치고 이전과 같이 천천히 엽니다. 샘플이 완전히 용해될 때까지 볼텍스합니다. 그런 다음 추가 샘플을 처리하기 전에 튜브를 열어 압력을 해제합니다.모든 샘플이 처리되면 최대 속도로 잠시 와류로 회전시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 12, 000 시간 G 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에서 튜브를 원심 분리하십시오. 그런 다음 튜브를 다시 실온으로 가져옵니다.오염을 방지하려면 각 샘플에 대해 팁이 필터링된 P1000 피펫을 사용하여 튜브 측면 근처의 지질 상을 뚫어 중간 분홍색 층에서 가능한 한 많은 RNA를 분리합니다. 팁 외부에 존재하는 지질이 전달되는 것을 방지하기 위해 튜브의 측면을 건드리지 않고 RNA를 새로운 원뿔형 튜브에 분배합니다. 각 샘플에 200마이크로리터의 순수 클로로포름을 추가하고 15초 동안 반전으로 튜브를 혼합합니다.그런 다음 실온에서 10분 동안 샘플을 배양한 후 12, 000회 G 및 섭씨 4도에서 15분 동안 튜브를 원심분리하고 튜브를 실온으로 다시 가져옵니다. 각 샘플에 대해 P1000 피펫과 여과된 팁을 사용하여 가능한 한 많은 수성 투명 RNA 함유 상상(top phase)을 해당 원뿔형 튜브의 두 번째 세트로 이동합니다. 다음으로, 각 샘플에 500마이크로리터의 100% 이소프로판올을 추가하고 15초 동안 반전으로 튜브를 혼합합니다.그런 다음 실온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 튜브를 실온으로 되돌리기 전에 12, 000회 G 및 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브를 원심분리하십시오. 이소프로판올을 각 튜브 밖으로 부어 버리십시오.이제 각 샘플에 1ml의 75% 에탄올을 추가하고 최대 속도로 튜브를 잠시 와류시킵니다. 그런 다음 7, 500배 G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 샘플을 회전시켜 실온에 가져온 후 각 튜브를 뒤집고 갈색 종이에 두드려 잔류 에탄올을 제거하여 75% 에탄올을 버립니다.뚜껑을 열어 두고 RNA 펠릿을 약 15-20분 동안 자연 건조시킵니다. RNA 펠릿의 크기를 평가한 후 각 샘플에 10-25마이크로리터의 RNase-free 물을 추가합니다. 샘플을 섭씨 60도의 가열 블록에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 튜브를 잠시 와류로 만듭니다. 동일한 열 블록에서 샘플을 추가로 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 모든 샘플을 빠르게 회전시키고 즉시 얼음 위에 놓습니다.text protocol에 따라 지방 조직에서 유전자 발현을 위한 RT-PCR을 수행합니다. 예상대로, 고지방 다이어트를 한 쥐는 정상 다이어트를 한 쥐에 비해 체중과 체중 증가가 증가했다. 이러한 관찰은 정상 식단을 섭취한 쥐에 비해 비만 마우스에서 PGF, PRF 및 SCF의 체중이 2배 이상 증가한 것을 동반했습니다.이 표는 각 백색 지방 조직에 대해 페놀 용액에 의한 RNA 분리가 RNA에 대해 순수한 것으로 간주되는 약 2.0의 OD280 이상의 OD260으로 샘플을 생성했음을 보여줍니다. 이 막대 그래프에서 볼 수 있듯이 realtime PCR 데이터는 비만 마우스의 PGF, PRF 및 SCF에서 렙틴 mRNA 발현이 정상 식단을 섭취하는 마우스에 비해 유의하게 높다는 것을 보여주었습니다. 렙틴 mRNA 발현에서 관찰된 차이는 CT 값이 변경되지 않았기 때문에 두 그룹의 마우스 간의 결과를 정규화하는 데 사용된 참조 유전자인 s16의 변이에 기인하지 않았습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 RNA 추출 절차 중에 RNase가 없는 환경에서 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자 발현 변형과 같은 추가 질문에 답하기 위해 realtime PCR 증폭과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 신진대사 분야의 연구자들이 설치류의 비만 및 당뇨병과 관련된 지방 조직 조절을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다양한 지방 패드를 분리하고 RNA를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 페놀 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험실 가운과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 리보뉴클레아제가 풍부한 쥐 췌장에서 높은 무결성을 가진 RNA를 분리하는 절차를 보고합니다.

마우스 췌장에서 RNA 격리 : 리보 뉴 클레아 풍부한 조직

연속 크라이 섹션은 단일 마우스 골격근에서 인접 영역을 이용한 유전자 발현 측정 학적 어플리케이션 및 RNA의 농축을 가능하게 수집된다. 직접 애플리케이션에서 비교 풀링 저온부 및 측정 30mg을 - 고품질 RNA를 (20)로부터 얻어진다.

유전자 발현 및 조직 학적 분석을위한 단일 마우스 골격근의 연속 지역의 냉동 절편

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레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

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다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음

본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

여기에서는 쥐 쇄골 상부 갈색 지방 조직의 조직학적 및 유전자 발현 분석을 해부하고 수행하기 위한 실용적인 절차를 제공합니다.

쥐 쇄골 상갈색 지방 조직의 해부, 조직학적 처리 및 유전자 발현 분석

이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 사용하여 파라포름알데히드 고정 및 최적 절단 온도 화합물이 포함된 마우스 간 조직의 조직학적 영역에서 RNA를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 표적 하류 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

RNA 분석을 위한 파라포름알데히드 고정 마우스 간 조직의 레이저 캡처 미세 해부

배우세요 마우스 백색 지방 조직 수집 및 고품질 RNA 추출 방법을. 이 기술은 대사 및 분자생물학 연구에서 유전자 발현 분석에 필수적이며, 특히 유전자 변형 마우스 연구에 활용됩니다.

마우스 지방 조직 수집 및 RNA 분석에 대 한 처리

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