Name: 생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 배우세요 장 상피 세포 침투성 측정 방법을 생체 외 및 생체 내에서 적용하여 장벽 기능을 평가하는 기술입니다. 이 방법은 염증성 장 질환 연구와 약물 독성 평가에 활용됩니다.

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이 연구를 완료에 그의 관대 한 도움에 감사 박사 제럴드 R. 터너, Brigham와 여자의 병원, 하버드의과 대학에서에서 하 고. 이 작품은 중국 (보조금 번호 81470804, 31401229, 및 81200620)의 국가 자연과학 기초는 자연 과학 재단의 장쑤 성 (보조금 번호 BK20180838, 및 BK20140319)에 의해 지원의 연구 혁신 프로그램 대학 졸업생의 장쑤 성 (보조금 번호 KYLX16-0116), 고급 연구 프로젝트의 Soochow 대학 (보조금 번호 SDY2015_06), 그리고 크 론 및 Colitis 재단 연구 펠로 십 수상 (310801 번호 부여).

이 연구는 동물 관리 및 사용 프로토콜의 캠브리지 스 게놈 자원 센터 (캠-수), Soochow 대학에 의해 승인 되었다.
1. 도금 및 Caco-2bbe에 다공성 폴 리 카보 네이트 막의 유지 보수
<ol><li>미디어 T75 플라스 크에 세포를 성장 (10% 포함 된 DMEM FBS). 플라스 크는 셀 밀도 따라 정기적으로 먹여야 한다. 참고: 최적의 도금, 셀 해야 빠르게 분할 및 세포 성장 단계에가 평면 "튀김-계란" 모양.</li>
	<li>일단 세포가 80% 합칠, 인큐베이터에서 플라스 크를 걸릴 하 고 미디어를 제거 합니다. 1-2 mL (없이 캘리포니아2 +) 살 균 PBS의 모든 잔여 미디어 린스. 피펫으로 1.5 mL 트립 신-EDTA 플라스 크와 부드럽게 바위 플라스 크; 그런 다음, 락 없이 20 분 동안 37 ° C 배양 기에서 플라스 크를 놓습니다.</li>
	<li>셀 trypsinizing는 하는 동안 장소 다공성 폴 리 카보 네이트 막 (0.4 µ m 기 공 크기, 표면적, 0.33 c m2; 재료의 표참조)를 포함 하는 24-잘 접시에 삽입 합니다. 기저 챔버 (막의 낮은 공간)에서 문화 미디어 1.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>피펫으로 플라스 크와 적극적으로 피펫으로 미디어의 5 mL 플라스 크의 측에 대하여 세포 5-10 회, 개별 셀 또는 2-3 셀을 묶습니다.</li>
	<li>
꼭대기 챔버 (막의 위 공간)로 셀 (1:8 희석 비율 달성) 0.166 mL 접시. 최대 3 주 동안 37 ° C에서 품 어.
	<ol>
<li>피드 셀 세 번 매주 신중 하 게 잘 사용 하 여 각 압력 펌프의 기초 구획에서 미디어를 발음으로. 부드럽게 각 삽입의 꼭대기 챔버로 미디어의 1 mL를 똑.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 측정 TER 상피 미터 (볼트/옴)의 사용
참고: 약 3 주 후에 폴 리카 보 네이트 막 문화, Caco 2BBe 셀 테 측정을 위해 준비 되어 있다.
<ol><li>Cytokine 연구, 측정 전에 1 일 IFNγ의 10 ng/mL를 포함 하는 미디어와 기저 미디어를 교체 합니다. 실험 당일, HBSS 2.5 또는 7.5 ng/mL TNF의를 포함 하는 미디어를 바꿉니다. 참고: IFNγ 치료 증가 표현의 TNF 수용 체 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>미터를 해결 하기 위해 보정 전극 입력 포트에 삽입 하 고 "옴" 모드를 선택 합니다. 미터 1000 Ω의 읽기 표시 될 때까지 드라이버 R 조정 나사를 조정 합니다.</li>
	<li>15-30 분, 70% 에탄올에 그들을 배치 하 여 전극을 소독 하 고 있도록 공기 건조 15 미 린스 실험 세포 배양에 전극.</li>
	<li>켜고 전원, "옴" 모드를 선택 합니다. 신중 하 게 기저 실과 꼭대기 챔버로 짧은 끝에 전극 다리의 긴 끝을 놓습니다. 긴 전극 표면 조직 문화 삽입 낮지만 미디어의 아래 짧은 전극 유지 하면서, 접시의 바닥을 터치를 확인 합니다. 수직 전극 유지.</li>
	<li>0, 1, 2, 3, 4 h cytokine 치료 후에 샘플 삽입 및 빈 삽입 (즉, 문화 삽입 셀 없이 그러나 HBSS)의 저항을 측정 합니다. 저항을 기록 합니다.</li>
	<li>다른 판 형식에 걸쳐 일관성을 달성 하기 위해 저항과 유효 막 면적의 계산: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> 24 잘 삽입에 대 한 효과적인 막 0.33 c m2입니다.</li>
</ol>3. murine 모델 Dextran 황산 나트륨 (DSS)-대 장 염을 유발
<ol><li>3.5% (wt/vol)의 최종 농도에 압력가 마로 소독 물에 DSS를 추가 합니다.</li>
	<li>3.5% 관리 7 일 총 8 주 오래 된 남성 C57BL/6 마우스 DSS. DSS 없이 일반 식 수 통제 쥐에 게.<ol>
<li>스위치 7 일 후 일반 식 수에 DSS-포함 된 물.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 무게 및 매일 각 마우스의 임상 점수를 평가. 각 마우스의 초기 몸 무게를의 몸 무게를 정상화. 점수는 질병의 심각도 따라 4 개의 매개 변수에 정의 된: 직장 탈출 (0-2), 대변 일관성 (0-2), 출혈 (0-2), 및 활동 (0-2)5. 최종 임상 점수에 대 한 이러한 매개 변수에서 점수 합계.</li>
	<li>결 장 조직의 histopathological 상태 분석, 1.2% (vol/vol) Avertin (0.6 mL/10 g 체중) 7 일 게시물-DSS 치료와 복 (i.p.) 주입 하 여 마우스를 안락사. 100 %avertin의 주식, 혼합 준비 2,2,2 tribromoethanol의 10 g tert-산은 알코올의 10 ml로 한다.  4 ° c.에 어둠 속에서 저장 사용 하려면, 물에서 2%로 100% 주식 희석.</li>
	<li>결 장 및 맹, 분리 하 고 콜론5의 길이 측정.</li>
	<li>하룻밤 10% 포 르 말린의 10 mL를 포함 하 15 mL 송 골 매 관에 원심 결 장 및 수정에서 0.5 cm 세그먼트를 잘라. 세척 등급된 에탄올과 고정된 조직 (75, 95, 100%) 및 크 실 렌. 파라핀 조직을 포함 하 고 6mm 되며 &amp; 오신8얼룩에 대 한 섹션을 잘라.</li>
</ol>4. 측정 DSS 유도 Colitis 쥐에서 상피 장벽 침투성
<ol><li>장벽 침투성 DSS 관리의 시작 후에 7 일을 측정 합니다.</li>
	<li>분석 결과 하루에 3 h에 대 한 마우스를 빨리.</li>
	<li>압력솥을 gavage 불 임, 150 µ L 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran 살 균 물에와 다음 gavage 쥐 되도록 바늘 하 고 혈 청 수집 후 측정 하는 표준 곡선을 사용 하지 않는 FITC dextran을 유지. 침투성 계산에 대 한 마우스의 무게. 참고: FITC dextran 솔루션은 물에서 여야 한다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 클립, 꼬리의 1 cm 조각 하 고 혈 청 컬렉션 튜브로 꼬리에서 혈액의 100 µ L를 수집 합니다. 실 온에서 10 분 동안 10000 x g에서 수집 된 혈액을 회전 합니다.</li>
	<li>희석 혈 청 1: 물에서 4. 표준 곡선, 사용 하지 않는 FITC-dextran 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000에서 물으로 희석을 1시 10분, 000, 1:30, 000, 1: 100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000과 1:3, 000, 000. 혈 청 및 표준 곡선 샘플 100 µ L/잘 96 잘 접시에 추가 합니다.</li>
	<li>485 여기/528 방출으로 플레이트 리더에서 형광을 읽기. 표준 곡선에 따라 침투성 값을 계산 하 고 희석에 대 한 해결에 4를 곱하십시오.</li>
	<li>(이 마우스 아픈 하 고 체중을 잃 었 FITC dextran 배달에 차이 정상화를 통해) 값을 정규화 하 무게에 의해 FITC dextran의 농도 나눕니다.</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
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<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
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<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
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<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. Caco-2BBe (브러쉬 국경-표현) 셀 테 측정, 브러쉬-테두리 단백질의 표현 위한 Caco-2 셀 라인에서 선택한 항상 사용 됩니다. Caco-2BBe 세포는 모 흡수 형 때 (문화 후 합류의 약 3 주) 후 완전히 분화17. 측정, 동안 오염 방지 하 고 전극 소독이 필요 하다. 절차는 비 살 균, 측정은 최대 8 h 대부분의 경우에만 수행할 수 있습니다. 측정, 동안 우리 두 포인트 삽입 내외의 저항 값을 결정합니다. 다양 한 사이트에서 저항 측정 셀 상태; 차이 때문에 때로는 크게 다를 수 있습니다. 이 방법의 주요 제한 사항입니다. 그러나,이 변화는 통계적 방법 및 다른 방법에 의해 크게 줄일 수 있습니다. TER 메서드는 폐 상피 세포와 혈관 내 피 세포의 장벽 무결성을 확인 하는 등, 다른 셀에 적용할 수 있습니다. 또한, 테 측정 약물 독성 연구에 사용할 수 있습니다.
확산을 ...

장 상피 세포는 영양분의 흡수에 대 한 책임 뿐만 아니라 그러나 또한 병원 성 미생물 및 미생물 독 소에 대 한 중요 한 방 벽을 형성. 이 장의 장벽 기능은 꽉 접합 침투성 및 상피 세포 무결성1,2,3, 통제 되 고 상피 장벽 기능 부전은 염증 성 창 자 연관 질병 (IBD)입니다. Perijunctional actomyosin 반지 (PAMR)는 단단한 접속점에 밀접 하 게 인접 셀 이내에 거짓말. Myosin 빛 사슬 (MLC)에 의해 규제 됩니다, PAMR의 수축은 꽉 접합 침투성4,5,6,7,8, 규제에 대 한 중요 한 9,10. 종양 괴 사 인자 (TNF) upregulating 장 상피 MLC 니 (MLCK) 식과 유도 occludin 국제화11,,1213에 의해 장 방 벽 손실에 중앙 이다.
이온+ Na와 Cl- 기 공 또는 누출 통로14paracellular 공간을 교차 수 있습니다. "새" 상피에서 TER에 변화는 주로 변경된 꽉 접합 침투성을 반영합니다. TER 측정 꽉 접합 침투성,+ Na와 Cl-, 하 셀 monolayers의 임피던스에 따라 계량 하는 일반적으로 사용 되 electrophysiological 접근 이다. 장 상피 세포, 혈관 내 피 세포, 폐 상피 세포 등 다양 한 세포 유형 테 측정을 위해 보고 되었다. 이 방법의 이점은 TER 측정 비 침략 적 이며 실시간 라이브 셀 모니터링에 사용할 수 있습니다. 또한, 테 측정 기술은 약물 독성 연구15에 대 한 유용합니다.
Caco-2BBe 세포는 인간 상피 대 장 선 암 세포 구조와 차별화 된 작은 창 자 상피 세포와 유사한 기능: 예를 들어 이러한 세포는 microvilli 및 작은 창 자 브러시와 관련 된 효소 테두리입니다. 따라서, 교양된 Caco-2BBe monolayers 장벽 기능을 테스트 하기 위한 생체 외에서 모델 활용 됩니다.
쥐, 한 장 paracellular 침투성 공부 방법은 혈액으로 루멘에서 교차 FITC dextran 수를 측정 하 여. 따라서, 창 자 침투성 gavaging FITC dextran 직접 마우스와 혈액 내에서 형광을 측정에 의해 평가 될 수 있다. 다음 프로토콜 설명 장 상피 침투성을 평가 하기 위해 두 가지 간단한 방법 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보.

<table><tbody><tr><td>22G 개비지 바늘</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>형광용 블랙 96웰 플레이트</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6 마우스</td><td>난징 대학교</td> Caco-2BBe 세포 난징 생물 <td></td><td></td>의학 연구소</tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 황산염 나트륨</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>고포도당 및 피루브산 나트륨이 함유된 DMED</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>상피(볼트/옴) 측정기</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sinopharm Chemical시약</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube (15mL)</td><td>코닝</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>형광계</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM Hepes, 1.3 mM CaCl2, 25 mM 포도당&nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>모듈식 조직 임베딩 센터</td><td>라이카</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>혈청 수집 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>코닝</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>시그마</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 멤브레인 (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>압력 펌프</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>로터리 마이크로토미</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sinopharm ChemicalReagent</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 그리고 vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

장 방 벽은 병원 성 미생물 및 미생물 독 소에 대 한 방어. 그것의 기능은 꽉 접합 침투성 및 상피 세포 무결성에 의해 규제 됩니다 그리고 위장과 전신 질환의 진행에 기여 하는 장의 장벽 기능 장애. 두 가지 간단한 방법 장 상피의 투과율을 측정 하 여기 설명 되어 있습니다. 생체 외에서Caco 2BBe 세포는 조직 문화 우물에는 단층으로 도금 및 transepithelial 전기 저항 (TER)는 상피 (볼트/옴) 미터에 의해 측정 될 수 있다. 이 메서드는 사용자 친화적인 작동과 반복성 때문에 설득력이 있다. Vivo에서, 마우스는 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)와 gavaged-dextran, 그리고 FITC dextran 농도 상피 침투성을 결정 하는 마우스에서 수집 된 혈 청 샘플으로 측정 된다. 구강 정확한 복용량을 제공 하 고 따라서 vivo에서창 자 침투성 측정을 선호 하는 방법 이다. 함께 찍은, 이러한 두 가지 방법을 장 상피 체 외 그리고 vivo에서의 침투성을 측정할 수 있다 하 고 따라서 질병 및 장벽 기능 사이의 연결을 공부 하는 데 사용 될.

문화, Caco 2BBe 세포를 단층으로 성장 하 고 천천히 테두리 브러시를가지고 성숙한 흡수 성 enterocytes로 분화. 이 프로토콜에서 Caco 2BBe 셀 폴 리 카보 네이트 막에 높은 밀도와 도금 했다 하 고 셀에 도달 100 %confluency 시드 후에 1 일. 그러나 세포는 차별화 된이 단계에서: 완전히 셀 구분, 미디어 3 주 동안 2-3 일 마다 변경 됩니다. 세포 핵으로 물 했다 고 F 걸 미 분화 및 분화 세포의 차이점을 보여 얼룩. 스트레스 섬유 undifferentiated 셀에 명확 하 게 볼 수 있습니다. 미 분화 세포와 비교, 차별화 된 셀 있고 작은 볼륨, 더 큰 핵, 적은 스트레스 섬유 (그림 1).
TNF는 MLCK 종속 단단한 접속점 규칙을 통해 장 배리어 손실에 중앙...

두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

이 실험의 전반적인 목표는 시험관 내 및 생체 내장 상피 세포 투과성을 측정하여 상피 장벽 기능 장애로 인한 질병을 연구하는 것입니다. 이 방법은 염증성 장 질환과 관련된 장 장벽 기능 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장 상피 세포 투과성을 시험관 내 및 생체 내 모두 평가할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 위장 질환의 치료 또는 진단으로 확장, 장 상피 장벽 기능 장애는 그 질병에 기여하기 때문에. 이 방법은 장 장벽 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 약물 독성 연구 및 다른 세포 유형의 장벽 무결성과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 일부 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 메서드의 시각적 데모는 매우 중요합니다.이제 텍스트 설명으로 이 메서드의 정확한 작업을 이해할 수 있습니다. 시작하려면, 배지와 T75 플라스크에서 Caco-2bbe 세포를 성장. 세포 밀도에 따라 플라스크를 정기적으로 공급합니다.세포가 80%의 컨실루물일 때, 매체를 제거하고 칼슘 없이 멸균 PBS의 1-2 밀리리터를 사용하여 헹구는 다. 트립신-EDTA의 1.5 밀리리터를 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 주세요. 그런 다음, 흔들지 않고 20 분 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 놓습니다.세포가 트립시닝하는 동안 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인을 포함하는 인서트를 24 개의 웰 플레이트에 배치하십시오. 그런 다음 멤브레인의 낮은 공간인 기저 챔버에 배양 배지 1 밀리리터를 넣습니다. 플라스크에 배지 5밀리리터를 추가하고, 플라스크 내부에 대해 세포를 5~10회 적극적으로 피펫하여 배양을 느슨한 개별 세포 또는 2~3개의 세포 덩어리로 분리합니다.플레이트 0.166 밀리리터는 멤브레인의 상부 공간인 정액 챔버로 세포의 밀리리터를 입력한다. 그런 다음 최대 3 주 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 압력 펌프를 사용하여 각 우물의 기저 구획에서 배지를 조심스럽게 흡인시켜 세포를 일주일에 세 번 공급합니다.그런 다음 배지 1 밀리리터를 각 삽입의 정량 챔버에 부드럽게 떨어 뜨립니다. 사이토카인 연구의 경우, 환피성 전기 저항 또는 TER 측정 하루 전에, 인터페론 감마의 밀리리터 당 10 나노그램을 포함하는 배지로 기저 매체를 대체합니다. 실험 당일, TNF의 밀리리터당 2.5 또는 7.5 나노그램을 함유한 HBSS로 배지를 교체한다.미터를 수정하려면 보정 전극을 입력 포트에 삽입하고 Ohm 모드를 선택합니다. 그런 다음 드라이버드라이버를 사용하여 미터가 1, 000 ohms의 판독값을 표시할 때까지 R 조정 나사를 조정합니다. 전극을 70%에 15~30분 동안 살균하고 15초 동안 공기 건조를 허용합니다.그런 다음 실험 세포 배양 배지에서 전극을 헹구는 다. 다음으로 전원을 켜고 옴 모드를 선택합니다. 전극을 수직으로 유지하면서 전극 교량의 긴 끝을 기저 챔버에 조심스럽게 배치하여 접시에 닿을 수 있도록 합니다.그런 다음 짧은 끝을 정문 챔버에 배치하여 매체의 표면 아래에 머무르지만 조직 배양 삽입 위에 유지되도록 합니다. 시토카인 치료 후 0, 1, 2, 3 및 4시간 시료 및 빈 인서트의 내성을 측정합니다. 그런 다음 저항을 기록합니다.다양한 플레이트 형식에 걸쳐 일관성을 얻으려면 여기에 표시된 바와 같이 저항 및 유효 멤브레인 영역의 생성물을 계산합니다. 24개의 웰 인서츠의 경우 유효 멤브레인 영역은 0.33 평방 센티미터입니다. 대장염을 유도하기 위해, 부피당 3.5%의 중량의 최종 농도에 자동으로 된 물에 DSS를 추가합니다.그런 다음 DSS 용액을 사용하여 8주된 남성 C57 블랙 6마우스의 케이지내식수를 총 7일 동안 교체한다. 쥐를 제어하기 위해 DSS없이 일반 식수를 제공합니다. 7일 후, DSS 물을 일반 식수로 전환합니다.매일, 마우스를 계량하고 4개의 매개변수에 의해 질병 엄격에 따라 정의된 임상 점수를 평가합니다: 직장 탈출, 대변 일관성, 출혈 및 활동. 최종 임상 점수에 대한 이러한 매개 변수에서 점수를 합산합니다. 결장 조직의 조직 병리학 적 상태를 분석하기 위해 7 일 후 DSS 치료 후, 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 한 후, 결장과 cecum을 분리하고 결장의 길이를 측정한다.탈경 결장에서 0.5 센티미터 세그먼트를 잘라 내고 하룻밤 사이에 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 팔콘 튜브에서 조직을 수정합니다. 등급에 따라 고정 된 조직을 에탄올과 자일렌으로 씻으시다. 그런 다음 파라핀에 조직을 포함하고 헤마톡시린과 에신 염색을위한 6 밀리미터 섹션을 잘라.DSS 유도 마우스에서 상피 장벽 투과성을 측정하기 위해, DSS 투여 시작 후 7일 후, 마우스를 3시간 동안 빠르게 한다. 독클을 사용하여 살균을 보장하기 위해 gavage 바늘을 오토클레이브한 다음, 밀리리터 당 80 밀리그램의 150 마이크로리터를 멸균 물에 4킬로달톤 FITC 도비텐을 사용하여 생쥐를 휘저고 사용하지 않은 FITC dextran을 유지하여 세럼 수집 후 표준 곡선을 측정합니다. 다음으로, 투과성 계산을 위해 마우스의 가중치를 가린다.4시간 후, IP 주입에 의한 마우스를 마취한 후 반사 신경 및 수염 운동의 부족에 의해 적절한 마취를 확인한다. 그런 다음 마우스를 열 블록에 5 분 동안 놓습니다. 한 쌍의 가위를 사용하여 꼬리의 1센티미터 조각을 클립하고 꼬리에서 100 마이크로리터의 혈액을 세럼 수집 튜브로 수집합니다.수집된 혈액을 10, 000배, 실온에서 10분 간 회전시합니다. 물로 혈청을 1~4개 희석시 희석시다. 그런 다음, 표준 곡선을 만들기 위해, 사용하지 않은 FITC dextran의 희석을 준비하기 위해 물을 사용합니다.세럼의 웰당 100 마이크로리터를 추가하고 표준 곡선 샘플을 96 개의 웰 플레이트에 넣습니다. 플레이트 판독기를 사용하여 485의 흥분과 528의 방출에서 형광을 읽으십시오. 표준 곡선을 기반으로 투과성 값을 계산하고 4로 곱하여 희석을 수정합니다.FITC dextran의 농도를 가중치로 나누어 값을 정규화합니다. 이것은 마우스가 아프고 체중이 감소한 경우 FITC dextran 전달의 차이를 정상화하는 데 도움이됩니다. 여기에 표시된 Caco-2bbe 세포는 미분화 세포와 분화 된 세포의 차이를 보여주기 위해 핵과 F-액틴 얼룩으로 표지되었습니다.스트레스 섬유는 미분화 된 세포에서 명확하게 볼 수 있습니다. 분화 된 세포는 미분화 세포보다 더 작은 부피, 더 큰 핵 및 적은 스트레스 섬유를 갖는다. TNF는 MLCK 의존적인 단단한 접합 규정을 통해 장 장벽 손실의 중심입니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, TNF는 용량 의존적인 방식으로 Caco-2bbe 단층의 TER를 현저히 감소시키고, TNF가 상피 투과성을 증가시킨다는 것을 시사합니다. 초기 체중에 비해 DSS로 치료된 마우스는 상당한 양의 체중을 잃습니다. 대장염의 중증도는 직장 탈출, 대변 일관성, 출혈 및 활동에 의해 점수가 매겨집니다.헤마톡실린과 에오신으로 얼룩진 대장 조직의 단면은 DSS 처리된 마우스에 있는 결장 점막 손상을 보여줍니다. 또한, 결장 토굴의 길이뿐만 아니라 결장 자체, DSS 처리 마우스에서 감소된다. 마지막으로, 대조군 마우스에 비해 DSS 처리 마우스에서 FITC dextran 염색의 수준에 약 2 배 증가가 있다.이 절차를 시도하는 동안 운영 절차를 표준화하고 통계 방법을 활용하여 오류를 최소화하는 것이 중요합니다. 개발 후,이 기술은 모델 유기체와 세포주 모두에서 위장 질환을 탐구하는 장 장벽 기능 분야의 연구자에 대한 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 TER를 측정하고 FITC dextran을 측정하고 형태학적 및 조직화학적 변화를 관찰하여 장 상피 투과성을 결정하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다.

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 장 장벽 기능의 생체 외 모델로 절제된 장 조직 제제 또는 "장 주머니"의 사용을 설명합니다. 이 모델은 소화기 질환의 동물 모델에서 특정 장 부위에서 상피 장벽과 점액 겔 층 모두의 무결성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는

염증성 장 질환 (IBD)의 현재 치료는 질병의 증상을 완화 목표로하지만 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 대안 전략은 동물 대장염 모델에서 연구되고있다. 여기서 우리는 임상 IBD 표지판에 다이어트 보조제의 유익한 효과는 이러한 대장염 모델에서 분석 방법에 대해 설명합니다.

실험 성 대장염 동안 장내 상피 장벽 기능에 영양 보조 식품의 유익한 효과 분석

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창 자-혈액 장벽 및 간 대사 Microbiota 제품의 평가 위한 Vivo에서 방법

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장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

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태아 조직 유래 장내 투과성 테스트

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정점 장내구 모델에서 루시퍼 옐로우를 사용한 장 투과성 측정

전체 동물 MG53 - 중재 세포막 수리 및 세포 수준에서 동적 프로세스를 시각화하는 데 사용되는 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 방식은 플라즈마 막 resealing 및 재생 의학 세포 생물학을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

배우세요 장 상피 세포 침투성 측정 방법을 생체 외 및 생체 내에서 적용하여 장벽 기능을 평가하는 기술입니다. 이 방법은 염증성 장 질환 연구와 약물 독성 평가에 활용됩니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

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