Name: 시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 배우세요 정량적 위상 이미징을 활용한 인간 골육종 세포의 혈관형성 및 비혈관형성 표현형 분석 방법입니다. 이 기술은 세포 형태, 증식, 운동성을 동시에 측정하여 암 진행 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 유방암 연구 재단 및 고급 의료 연구 재단의 지원을 인정 하는 기꺼이.

여기 설명 하는 모든 방법은 보스턴 어린이 병원 기관 Biosafety 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 세포 준비
<ol><li>
녹고 KHOS-A 및-N 셀
	<ol>
<li>따뜻한 문화 매체, 즉, 최대 Dulbecco의 10% (vol/vol) 태아 종 아리 혈 청 (FBS)와 1% (vol/vol) 페니실린/스 보충이 글 중간 수정.</li>
		<li>액체 질소 탱크에서 세포의 극저온 튜브를가지고, 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 물에 튜브의 하단을 담가 그리고 부드럽게 녹고 프로세스를 가속 화 하기 위해 극저온 병을 흔들어. 오염을 방지 하기 위하여 물 접촉에서 극저온 튜브의 뚜껑을 유지. 최대한 빨리 셀은 해 동, 70% 에탄올 솔루션을 분사 하 고 유리병을 닦는 여 극저온 유리병을 소독.</li>
		<li>층 류 두건에서 즉시 극저온 유리병에서 세포 현 탁 액을 발음 하 고 부드럽게 따뜻하게 10 mL의 배양 (1.1.1에서 설명)에 일시 중단 합니다. 5-7 분 약 200 x g에서 셀 정지 원심</li>
		<li>예 열 10 mL 문화 매체와 셀 펠 릿 resuspend 그리고 T75 플라스 크로 전송. 부드럽게 균등 하 게 10 mL를 피펫으로 사용 하 여 셀 중단 여러 번 플라스틱.</li>
		<li>5% (vol/vol) CO2 와 습도 분위기 37 ° C 배양 기에 플라스 크를 놓습니다. 셀 12 h 이상에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
		<li>80-100% 합칠 때까지 약 3-7 일에 대 한 셀을 품 어. 2-3 일 마다 문화 매체를 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분할 KHOS-A 및-N 셀
	<ol>
<li>플라스 크에서 문화 미디어를 제거 합니다.</li>
		<li>5 mL 살 균 PBS로 세포 세척 (1x) 칼슘과 마그네슘, 비 부착 셀 또는 제거 없이.</li>
		<li>플라스 크에 1 mL 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션을 추가 하 고 간단히 트립 신-EDTA 균등 하 게 분산 되도록 플라스 크를 소용돌이.</li>
		<li>37 ° C 배양 기에서 2-3 분 또는 실 온에서 3-5 분에 대 한 플라스 크를 품 어. 에 셀은 반올림 하 고 분리 되도록 약 400 배 확대 현미경으로 세포를 확인 합니다.</li>
		<li>세포 분리는 일단 10 mL 문화 매체를 추가 하 고 부드럽게 헤어 10ml 피펫으로 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀 집계 여러 번 왔다 갔다 매체 플라스틱.</li>
		<li>셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 2 × 106 세포의 밀도 또는 1: 4의 비율에서 새로운 T75 플라스 크에 세포 현 탁 액을 시드하십시오.</li>
		<li>QPI 실험에 뿌리기 전에 80-100% 합류에 성장 하는 셀 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시드 KHOS-A 및-N QPI 셀
	<ol>
<li>씨 KHOS-A 및-N 셀의 50000-300000 셀/셀 카운터로 계산 후 5 mL 문화 매체와 밀도에서 6 잘 플레이트에 참고: 시드 밀도에 따라 달라 집니다 셀 확산 속도 이미징 기간 하려면 < 이미징 수집 하는 동안 100% 합류.</li>
		<li>첨부 파일을 허용 하도록 적어도 12 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>QPI를 수행 하기 전에 신선한 미디어와 매체를 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. QPI 수집
<ol><li>
커버 슬립 설정
	<ol>
<li>커버 슬립 이온 물로 여러 번 헹 궈 서 깨끗 하 고 건조 살 균 층 류 두건으로 커버 슬립을 넣어 15 분에 대 한 침수에 의해 75% 에탄올 용액으로 소독.</li>
		<li>신중 하 게 커버 슬립을 분명 거품을 피하기 위해 6-잘 접시에 놓습니다. 커버 슬립의 하단 문화 미디어 (최소 5 mL/음)에 몰입 됩니다 확인 하십시오.</li>
		<li>(37 ° C, 5% CO2, 그리고 습도 분위기) 적어도 15 분 동안 equilibrate 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 커버 슬립에 안개 형성 하는 경우에 멸 균 면봉을 사용 하 여 그것을 깨끗 하 게 닦아.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경으로 세포 이미징
	<ol>
<li>노출 시간, 패턴 대비 및 홀로그램 잡음의 자기 보정을 포함 하 여 시스템을 초기화 하기 위해 소프트웨어를 엽니다. 값은 허용 (녹색 또는 노란색 범위에 표시 된) 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>6 잘 플레이트 QPI 현미경의 스테이지에 배치 합니다.</li>
		<li>"라이브 캡처," 클릭 하 고 "소프트웨어 초점."에서 "수동"을 선택 개의 "현미경 설정"에서 작업 거리를 조정 하 여 셀의 위상 이미지를 초점 셀 단계 이미지에 대 한 개요를 얻을. "소프트웨어 초점."에서 "자동"으로 변경</li>
		<li>"새로운 실험"를 클릭 하 여 새 실험 만들기를. 숫자 패드에 마우스 또는 화살표 키를 사용 하 여 이미지 수집 위치의 선택으로 시작 합니다. 각 선택 후 "저장"을 클릭 합니다. 일반적으로 3-5 위치 각 샘플에 대 한 선택 됩니다.</li>
		<li>"Timelapse" 섹션에서 이미징 간격 및 기간을 설정 합니다. 참고: 명확 하 게 암 세포를 추적, 간격 이어야 한다 짧은 보다 5 분 48 시간 조합 QPI 분석 기간으로 설정 됩니다.</li>
		<li>자동으로 집중 하 고 설정 시간 지점에서 이미지를 "캡처"를 클릭 하 여 실험을 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>
셀 형태 분석
	<ol>
<li>"셀을 식별 합니다." 클릭 셀 영역 배경 잡음 으로부터 잘 구분 되는 "배경 임계값"에 대 한 숫자 설정을 조정 합니다. "개체 크기"에 대 한 설정을 조정할 각 셀 한 핵에 있는지 확인 합니다. 이 마지막 지역 및 볼륨 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 비교 될 필요가 있는 샘플에 대 한 일치 매개 변수를 유지 합니다. 필요한 경우 수동으로 "수동 변경,"를 사용 하 여 셀 세그먼트 수정 합니다.</li>
		<li>셀을 분석 하는 소프트웨어에서 "데이터 분석" 함수를 사용 합니다. "새로운 분석."를 클릭 하 여 새로운 데이터 분석 시작 선택 된 이미지는 "소스 프레임" 탭 및 세포 형태학 매개 변수 셀 영역 (µ m2), 광학 두께 (µ m), 및 모든 개별 셀에 대 한 볼륨 (µ m3)을 포함 하 여 끕니다. 분산형 플롯 또는 히스토그램 모드 및 내보내기 데이터를 테이블 또는 그림을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 확산 분석
	<ol>
<li>다른 시간 포인트 (예, 초기, 12 h, 24 h, 36 h 및 48 h) 적어도 5 이미지를 선택 합니다. 소프트웨어에 의해 제공 되는 레코드 셀 번호.</li>
		<li>배로 시간을 추정, 초기 숫자 정상화 후 핸드폰 번호를 플롯 하 고 지 수 성장 곡선에 맞게.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 모션 분석
	<ol>
<li>소프트웨어에 "셀 추적" 기능을 사용 합니다. "새로운 분석"을 클릭 하 여 새로운 데이터 분석을 시작 하. 선택한 기간 동안 (예를 들어, 24 h 부 화 후 4 h) "소스 프레임" 탭에는 이미지의 드래그 시리즈는 임의로 "셀 추가" 선택 모드에서 셀을 클릭 하 여 10-30 셀을 선택 합니다. 가장자리와 보기의 필드 밖으로 이동에 셀을 제외 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 이미지의 시리즈에서 추적을 확인 하십시오. 시스템 셀의 트랙을 잃거나 잘못 된 셀을 추적는 수동으로 조정 추적 셀 셀을 식별 하기 위해 "확인"을 클릭 하거나 "위치 수정"을 클릭 하 여 셀 위치를 수정 하려면 "선택" 모드.</li>
		<li>"플롯 운동" 셀 궤적의 장미 줄거리 또는 줄거리는 다른 모션 관련 매개 변수에 대 한 운동 속도 (µ m/h), 운동 (µ m), 마이그레이션 (µ m), 및 마이그레이션 똑 바 름 같은 "플롯 기능"에서 선택 하십시오. 테이블 또는 수치 데이터를 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

이 연구에서 우리는 생체 외에서비-침략 적, 레이블 없는 방법과 양적 특성 인간 다리 세포의 신생 및 비 신생 고기 QPI를 사용 하 여 설명 합니다. 여러 세포 매개 변수는이 메서드에서 통합, 높은 처리량, 확산 속도, 시간, 마이그레이션 똑 바 름, 운동 속도, 마이그레이션, 및 운동 성을 두 배로, 셀 볼륨, 셀 간격, 셀 영역을 포함 하 여 동시에 분석 되었습니다 했습니다.
셀 형태학 및 세포 행동을 평가 하는 기존의 분석 실험에 비해,이 방법은 뿐만 아니라 저장 시간과 노동, 하지만 또한 더 정확 하 고 자세한 정보를 제공 합니다. 예를 들어 (내부 셀 인큐베이터) QPI 시스템의 위치 주변 환경 (실내 온도 분위기)23에 촬영 하는 등 환경 변화에서 소요를 감소 시킨다. 또한, 광학 셀 두께 볼륨, 위상 변화에서 변환 수으로 얻을 수 QPI, 반면만 셀 영역 전통적인 세포 이미징 프로세스에 의해 측정 됩니다. ...

개발 및 단단한 종양의 진행 초기 검사점 중 신생 표현 형, 암 홀 마크의 인수입니다. 이 진행 포함 다양 한 생 화 학적 및 분자 프로세스1,2,3. 종양 진행이 키 단계 연구에서 기술 도전 도구를 지속적으로 하 고 양적 특성화 고 편견으로 라이브 암 세포의 신생 및 비 신생 고기 구별의 부족 이다. 보통 신생 및 비 신생 세포의 세포질 행동을 조사 하는 데 사용 되는 전통적인 분석 필요 비싼 시 약 및 기기, 예를 들어 셀 확산/마이그레이션 분석4,5, 실험 6,7,,89,10,11,12,13,14 또는 상당한 전문성과 집중을 요구 뿐만 아니라 보완 vivo에서 평가4,5,6,8,,1516, 시간과 노동 소비입니다.
최근, 양적 위상 이미징 (QPI) 다양 한 세포 형태 및 동작 매개 변수17,18,19, 의 시간 경과 및 라벨 무료 평가 가능 하 게 소설 기법으로 떠오르고 있다 20 , 21 , 22. 기존의 광학 현미경과 달리 QPI 단정 위상 변화에 의해 픽셀의 빛 광 개체를 통해 전달 되 고 변환 된 광학 두께와 볼륨, 자필을 재구성 한 후 직접 활성화 라이브 셀 및 다음 기능 분석: (1) 양적 이미징, (2) 비-침략 적 및 시간 경과 영상, (3) 라벨 무료 이미징, 및 (4) 동시 다중 매개 변수 영상. 이러한 기능을 평가 하 고 세포 수준에서 병 적인 프로세스를 이해 하는 강력한 도구 QPI를 확인 합니다.
최근 연구에서 활용 하는 양적 특성 및 신생 구별 QPI KHOS A 및 세포 형태학의 분석을 결합 하 여 체계적이 고 정량적으로 인간의 다리 셀의 비 신생 KHOS N 고기 확산, 그리고 운동 성23. 이미지 분석 소프트웨어, 패널을 사용 하 여 셀 형태학과 행동의 매개 변수가 양적 신생 및 비 신생 인간 다리 셀 사이의 비교 했다 그리고 5 특성 차이이 두 사이 발견 했다 고기입니다. 이 새로운 접근 방식을 다양 한 세포 생물학 관련 특성을 평가 하기 위한 통합 및 양적 플랫폼을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>T75 플라스크</td><td>Corning, NY, USA</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트&nbsp;</td><td>코닝, 뉴욕, 미국</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 이글 배지 (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)&nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals, GA, USA</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Z1 Coulter 카운터</td><td>Beckman Coulter, IN, USA</td><td>Z1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HoloMonitor M4</td><td>위상 홀로그램 이미징 Phi AB, Lund, Sweden</td><td>M4</td><td>현미경</td></tr><tr><td>홀로그래픽</td><td>이미징 Phi AB, Lund, Sweden</td><td>PHI 8020</td><td></td></tr><tr><td>HStudioM4</td><td>위상 홀로그램 이미징 Phi AB, Lund, Sweden</td><td>HStudioM4</td><td>소프트웨어</td></tr></tbody></table>

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

신생 표현 형의 인수 종양 휴면에서 탈출의 필수적인 구성 요소입니다. 여러 클래식 체 외에서 분석 실험 (예를들면, 확산, 마이그레이션, 등)와 모델 vivo에서 조사 하 고 신생 및 비 신생 셀 고기 특성화 개발 되었습니다 있지만이 메서드는 시간 노동 집약적인, 그리고 종종 필요한 상당한 전문 지식 뿐만 아니라 비싼 시 약 및 악기. 최근 연구에서 우리 신생 및 비 신생 인간 다리 KHOS 셀의 시간 경과 및 라벨 무료 characterizations을 소설 양적 위상 이미징 (QPI) 기법을 사용. 셀 형태, 운동 성, 확산, 등 세포 매개 변수 패널 양적 측정 되었다 고 QPI를 사용 하 여 분석. 이 소설과 양적 접근 지속적으로 및 비 접촉 관련 세포 프로세스, 행동, 그리고 암 세포의 특성 및 다른 세포 유형 간단 하 고 통합 된 방식으로 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 보고서에서는 셀 준비, QPI 수집 및 데이터 분석을 포함 하 여 우리의 실험 프로토콜을 설명 합니다.

그림 1 전형적인 세포 형태학 특성 묘사. 이미지는 holographs (그림 1A-B)와 2D 이미지 (그림 1C-D)로 표시 됩니다. 광 셀 두께 (계산 고 굴절률 광학 경로 길이에서) 라인 프로 파일 또는 전체 셀 측정을 통해 정량은. KHOS-A의 두께 면적의 점도 그림 1E-G,이 두 고기 다른 배포 패턴을 표시 하는 위치에서 KHOS N 셀 전체 셀 측정 표시 했다. 히스토그램 (그림 1 H-M) 또는 내보낸된 파일에서 평균 숫자 KHOS-A 셀 작은 셀 영역 및 KHOS N ...

휴면 및 활성 암 세포 고기 양적 위상 이미징 사용 하 여 특징 이었다. 셀 확산, 마이그레이션, 및 형태 분석 통합 되었고 한 간단한 방법을 분석.

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

이 실험의 전반적인 목표는 세포 형태, 증식 및 운동성 분석을 결합한 체계적인 방식으로 인간 골육종 세포의 혈관신생 및 비혈관신생 표현형을 정량적으로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 인간의 암 발병 및 진행과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, 종양 휴면기로부터의 탈출과 내인성 전환(endogenic switch)이 그렇다.이 기술의 주요 장점은 이 통합되고 확산이 높은 방법으로 다세포 매개변수를 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 여기에는 세포 면적, 세포 두께, 세포 부피, 증식 속도, 배가 시간, 운동성 속도, 이동 및 운동성이 포함됩니다. 시작하려면 수조에서 배양 배지를 섭씨 37도로 예열합니다.그런 다음 액체 질소 탱크에서 혈관신생 및 비혈관신생 인간 골육종 세포의 극저온 바이알을 제거합니다. 바이알 바닥을 섭씨 37도의 수조에 담그고 극저온 바이알을 부드럽게 흔들어 해동 과정을 가속화합니다. 세포가 해동되는 즉시 바이알에 70% 에탄올을 분사하고 바이알을 닦아 살균합니다.그런 다음 바이알에서 세포 현탁액을 즉시 흡인하고 10ml의 예열 배양 배지에 부드럽게 현탁시킵니다. 다음으로 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 후드로 돌아가서 상층액을 제거하고 10ml의 예열 된 배양 배지로 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.그런 다음 세포 현탁액을 T75 플라스크로 옮깁니다. 세포 현탁액을 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 세포를 고르게 분산시킵니다. 플라스크를 인큐베이터에 넣고 세포가 최소 12시간 동안 부착되도록 합니다.2-3일마다 배양 배지를 교체하십시오. 세포가 80-100% 합류점에 도달하면 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 5ml의 멸균 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 0.25% 트립슨 EDTA 용액 1ml를 플라스크에 넣고 플라스크를 짧게 휘젓습니다.플라스크를 2-3분 동안 배양한 다음 현미경으로 세포를 확인하여 세포가 둥글게 만들어지고 분리되었는지 확인합니다. 세포가 분리되면 피펫을 사용하여 10mL 배양 배지를 추가하고 배지를 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 남아 있는 세포 응집체를 분해합니다. 세포를 계수한 후 200만 개의 세포를 새로운 T75 플라스크에 파종합니다.플라스크를 인큐베이터에 넣고 세포를 80%에서 100% 사이의 포화도로 성장시킨 후 정량적 위상 이미징 실험을 위해 세포를 파종합니다. 트립손 소화에 의하여 세포를 가을걷이하고 6개의 우물 판에 있는 씨 angiogenic 및 non-angiogenic 인간적인 osteosarcoma 세포를 50, 000에서 300 의 우물 당 000의 세포의 조밀도에 있는 씨를 뿌립니다. 총 5ml의 배양 배지로 세포를 덮습니다.그런 다음 세포가 부착할 시간을 허용하기 위해 최소 12시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이미징하기 전에 배지를 새 배지로 교체하십시오. 커버 슬립을 흐르는 탈이온수로 여러 번 헹구어 청소하십시오.그런 다음 75% 에탄올 용액에 15분 동안 담그십시오. 멸균된 커버 슬립을 층류 후드에 넣어 건조시킵니다. 그런 다음 덮개 슬립을 6웰 플레이트에 조심스럽게 넣고 명백한 거품을 피합니다.플레이트를 인큐베이터에 넣어 최소 15분 동안 평형을 이룹니다. 접시 뚜껑에 김이 서리면 이미징하기 전에 멸균 면봉을 사용하여 깨끗이 닦으십시오. 정량적 위상 이미징 소프트웨어를 열고 시스템을 초기화합니다.값이 노출 시간, 패턴 대비 및 홀로그램 노이즈의 자체 보정에서 허용되는지 확인합니다. 다음으로, 6웰 플레이트를 정량적 위상 이미지 현미경의 스테이지에 놓습니다. 소프트웨어로 돌아가서 라이브 캡처를 클릭합니다.그런 다음 소프트웨어 초점 메뉴로 이동하여 수동을 선택합니다. 그런 다음 현미경 설정 메뉴로 이동하여 작업 거리를 조정하여 세포의 위상 이미지를 거칠게 초점을 맞추고 위상 이미지에서 세포의 윤곽을 얻습니다. 완료되면 소프트웨어 초점 메뉴로 돌아가서 초점 설정을 자동으로 변경합니다.이제 새 실험을 클릭합니다. 마우스 또는 숫자 패드의 화살표 키를 사용하여 이미지 획득 위치를 선택하기 시작합니다. 각 선택 항목 뒤에 기억을 클릭합니다.위치가 모두 선택되면 타임랩스 섹션으로 이동하여 이미징 간격을 5분 미만으로 설정하고 총 시간이 48시간이 되도록 합니다. 캡처를 클릭하여 실험을 시작합니다. 이렇게 하면 각 간격 시점의 선택한 위치에서 이미지의 초점을 자동으로 맞추고 획득할 수 있습니다.이미지 획득 후 먼저 identify cells를 클릭하여 세포의 형태를 분석합니다. 셀 영역이 배경 노이즈와 잘 분리되도록 배경 임계값에 대한 숫자 설정을 조정합니다. 그런 다음 개체 크기에 대한 설정 번호를 조정하여 각 세포에 핵이 하나만 있도록 합니다.이 요구 사항과 일치하지 않는 모든 셀 세그먼트는 수동 변경을 사용하여 수동으로 수정합니다. 그런 다음 소프트웨어의 데이터 분석 기능을 사용하여 세포를 분석합니다. 새 분석을 클릭하여 새 데이터 분석을 시작합니다.선택한 이미지를 소스 프레임(source frames) 탭으로 드래그하고 각 개별 셀의 셀 면적, 광학 두께 및 부피를 포함한 셀 형태 매개변수를 기록합니다. 완료되면 산점도 또는 히스토그램 모드를 선택하고 데이터를 테이블 또는 그림으로 내보냅니다. 12시간 간격으로 촬영된 이미지를 5개 이상 선택하고 소프트웨어에서 제공하는 셀 번호를 기록합니다.초기 세포 수로 정규화한 다음 세포 수를 플로팅하여 세포의 증식 속도를 추정합니다. 마지막으로, 지수 성장 곡선을 사용하여 데이터 점을 피팅하여 배가 시간을 추정합니다. 세포 움직임을 분석하려면 소프트웨어의 세포 추적 기능을 사용하십시오.새 분석을 클릭하여 새 데이터 분석을 시작합니다. 그런 다음 관심 있는 기간의 일련의 이미지를 소스 프레임 탭으로 드래그합니다. 그런 다음 셀 추가 선택 모드에서 10-30개의 셀을 클릭하여 무작위로 선택합니다.일련의 이미지에서 추적을 검토해야 합니다. 시스템이 셀을 추적하지 못하거나 잘못된 셀을 추적하는 경우 식별을 클릭하여 셀을 식별하거나 선택 모드로 이동하고 위치 수정을 클릭하여 셀의 위치를 수정하여 추적 셀을 수동으로 조정합니다. 완료되면 플롯 이동으로 이동하여 행 셀 궤적 플롯을 선택하거나 플롯 기능으로 이동하여 운동성 속도, 운동성, 마이그레이션 및 마이그레이션 직접성과 같은 다른 모션 관련 매개 변수를 플롯합니다.데이터를 테이블 또는 Figure로 내보냅니다. 이 프로토콜에서는 정량적 위상 이미지가 홀로그래프로 표시됩니다. 여기에 표시된 세포는 혈관신생 및 비혈관신생 인간 골육종 세포의 전형적인 세포 형태를 나타냅니다.셀 두께는 굴절률과 광학 경로 길이에 의해 계산되며 여기에 산점도로 표시됩니다. 두 가지 다른 세포 표현 유형은 서로 다른 분포 패턴을 보였으며 혈관신생 세포가 비혈관신생 세포보다 세포 면적이 더 작고 세포 두께가 더 크다는 것을 나타냅니다. 두 세포 유형의 세포 증식 속도는 이와 같은 2D 이미지에서 계산할 수 있으며, 이러한 이미지는 분할되어 이틀에 걸쳐 진행됩니다.이러한 특정 세포 유형에 대해서는 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. 세포에 대한 세포 움직임 특성을 확인하려면 개별 세포를 선택하고 시간이 지남에 따라 추적해야 합니다. 여기서 추적된 셀은 다른 색상으로 윤곽선이 표시됩니다.각 개별 셀은 여기에 설명된 총 경로 궤적을 사용하여 4시간 동안 추적되었으며, 여기서 0, 0 지점은 시작 위치이고 최종 위치는 색상이 지정된 점으로 표시됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 정량적 위상 이미징을 사용하여 세포, 형태학적 및 행동 매개변수 pan을 정량적으로 비교하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 경우, 혈관신생과 비혈관신생 세포 표현형 사이입니다.이 개발 이후, 이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 종양 휴면 상태에서 벗어나 이 과정에서 혈관 신생의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 연속적이고 라벨링되지 않은 플랫폼에서. 인간 세포주를 이용한 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 3D 정량적 위상 이미징을 통해 림프구 형태 및 생화학을 표지 없이 식별하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 림프구를 철저히 분석하여 라벨링 절차 없이 림프구의 내부 구조와 특성을 밝힐 수 있습니다.

림프구 아형(Lymphocyte subtype)을 특성화하기 위한 3차원 정량적 위상 이미징(Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging)

출처: Parker, J. J., et al. 항침습적 약물의 종양 세포 이동 및 환자 특이적 효과 연구를 위한 인간 교모세포종 기관형 절편 배양 모델. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 공초점 현미경을 통해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 교모세포종 조직 절편의 이미징을 보여줍니다. 고해상도 이미지는 종양 세포의 움직임과 방향을 추적하기 위해 일관된 간격으로 캡처됩니다.

타임랩스 스캐닝 공초점 현미경을 사용한 교모세포종 조직에서 종양 세포 이동 이미징

시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

여기에서는 항암 치료제에 반응하는 단일 세포를 종단으로 추적하는 장기 타임 랩스 현미경 검사 방법을 설명합니다.

유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

암세포, 특히 4T1 마우스 유방 암종 세포에 대한 대식세포 식세포 활성은 본 연구에서 영상화되었다. 살아있는 세포 동배 모델은 형광및 차동 간섭 대조 현미경의 조합을 사용하여 확립되고 관찰되었다. 이 평가는 이미징 소프트웨어를 사용하여 멀티포인트 타임랩스 비디오를 개발하는 데 사용되었습니다.

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

여기서는 세포 사멸 유도 후 접종된 잎을 지속적으로 이미징하여 프로그래밍된 세포 사멸 개시 속도를 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 현미경을 사용한 세포 사멸 개시 연구

여기에서는 계대 0 각질세포의 계통을 수동으로 추적하는 데 사용할 수 있고 세포 분열 운명 및 세포 주기 기간을 포함한 증식 지표를 수집할 수 있는 살아있는 세포 이미징 분석 방법을 제공합니다.

표피 각질 세포 증식 역학을 연구하기 위한 타임랩스 사진을 사용한 라이브 셀 이미징

이 프로토콜은 살아있는 인간 유방암 세포의 무표지, 비침습적 표현형을 위해 라만 분광법과 단층촬영상 현미경을 결합한 다중 모드 접근 방식을 제시합니다. 여기에는 신속하고 정량적인 형태 화학 분석을 위한 사용자 친화적이고 인간 편견이없는 분석 파이프라인이 포함되어 있으며, 암 연구 및 세포 생물학에 응용하여 상세한 분자 및 구조적 통찰력을 제공합니다.

살아있는 무표지 유방암 세포의 표현형 분석을 발전시키기 위한 다중 모드 이미징 프레임워크

배우세요 정량적 위상 이미징을 활용한 인간 골육종 세포의 혈관형성 및 비혈관형성 표현형 분석 방법입니다. 이 기술은 세포 형태, 증식, 운동성을 동시에 측정하여 암 진행 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

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