시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

이 실험의 전반적인 목표는 세포 형태, 증식 및 운동성 분석을 결합한 체계적인 방식으로 인간 골육종 세포의 혈관신생 및 비혈관신생 표현형을 정량적으로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 인간의 암 발병 및 진행과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, 종양 휴면기로부터의 탈출과 내인성 전환(endogenic switch)이 그렇다.

이 기술의 주요 장점은 이 통합되고 확산이 높은 방법으로 다세포 매개변수를 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 여기에는 세포 면적, 세포 두께, 세포 부피, 증식 속도, 배가 시간, 운동성 속도, 이동 및 운동성이 포함됩니다. 시작하려면 수조에서 배양 배지를 섭씨 37도로 예열합니다.

그런 다음 액체 질소 탱크에서 혈관신생 및 비혈관신생 인간 골육종 세포의 극저온 바이알을 제거합니다. 바이알 바닥을 섭씨 37도의 수조에 담그고 극저온 바이알을 부드럽게 흔들어 해동 과정을 가속화합니다. 세포가 해동되는 즉시 바이알에 70% 에탄올을 분사하고 바이알을 닦아 살균합니다.

그런 다음 바이알에서 세포 현탁액을 즉시 흡인하고 10ml의 예열 배양 배지에 부드럽게 현탁시킵니다. 다음으로 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 후드로 돌아가서 상층액을 제거하고 10ml의 예열 된 배양 배지로 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 세포 현탁액을 T75 플라스크로 옮깁니다. 세포 현탁액을 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 세포를 고르게 분산시킵니다. 플라스크를 인큐베이터에 넣고 세포가 최소 12시간 동안 부착되도록 합니다.

2-3일마다 배양 배지를 교체하십시오. 세포가 80-100% 합류점에 도달하면 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 5ml의 멸균 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 0.25% 트립슨 EDTA 용액 1ml를 플라스크에 넣고 플라스크를 짧게 휘젓습니다.

플라스크를 2-3분 동안 배양한 다음 현미경으로 세포를 확인하여 세포가 둥글게 만들어지고 분리되었는지 확인합니다. 세포가 분리되면 피펫을 사용하여 10mL 배양 배지를 추가하고 배지를 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 남아 있는 세포 응집체를 분해합니다. 세포를 계수한 후 200만 개의 세포를 새로운 T75 플라스크에 파종합니다.

플라스크를 인큐베이터에 넣고 세포를 80%에서 100% 사이의 포화도로 성장시킨 후 정량적 위상 이미징 실험을 위해 세포를 파종합니다. 트립손 소화에 의하여 세포를 가을걷이하고 6개의 우물 판에 있는 씨 angiogenic 및 non-angiogenic 인간적인 osteosarcoma 세포를 50, 000에서 300 의 우물 당 000의 세포의 조밀도에 있는 씨를 뿌립니다. 총 5ml의 배양 배지로 세포를 덮습니다.

그런 다음 세포가 부착할 시간을 허용하기 위해 최소 12시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이미징하기 전에 배지를 새 배지로 교체하십시오. 커버 슬립을 흐르는 탈이온수로 여러 번 헹구어 청소하십시오.

그런 다음 75% 에탄올 용액에 15분 동안 담그십시오. 멸균된 커버 슬립을 층류 후드에 넣어 건조시킵니다. 그런 다음 덮개 슬립을 6웰 플레이트에 조심스럽게 넣고 명백한 거품을 피합니다.

플레이트를 인큐베이터에 넣어 최소 15분 동안 평형을 이룹니다. 접시 뚜껑에 김이 서리면 이미징하기 전에 멸균 면봉을 사용하여 깨끗이 닦으십시오. 정량적 위상 이미징 소프트웨어를 열고 시스템을 초기화합니다.

값이 노출 시간, 패턴 대비 및 홀로그램 노이즈의 자체 보정에서 허용되는지 확인합니다. 다음으로, 6웰 플레이트를 정량적 위상 이미지 현미경의 스테이지에 놓습니다. 소프트웨어로 돌아가서 라이브 캡처를 클릭합니다.

그런 다음 소프트웨어 초점 메뉴로 이동하여 수동을 선택합니다. 그런 다음 현미경 설정 메뉴로 이동하여 작업 거리를 조정하여 세포의 위상 이미지를 거칠게 초점을 맞추고 위상 이미지에서 세포의 윤곽을 얻습니다. 완료되면 소프트웨어 초점 메뉴로 돌아가서 초점 설정을 자동으로 변경합니다.

이제 새 실험을 클릭합니다. 마우스 또는 숫자 패드의 화살표 키를 사용하여 이미지 획득 위치를 선택하기 시작합니다. 각 선택 항목 뒤에 기억을 클릭합니다.

위치가 모두 선택되면 타임랩스 섹션으로 이동하여 이미징 간격을 5분 미만으로 설정하고 총 시간이 48시간이 되도록 합니다. 캡처를 클릭하여 실험을 시작합니다. 이렇게 하면 각 간격 시점의 선택한 위치에서 이미지의 초점을 자동으로 맞추고 획득할 수 있습니다.

이미지 획득 후 먼저 identify cells를 클릭하여 세포의 형태를 분석합니다. 셀 영역이 배경 노이즈와 잘 분리되도록 배경 임계값에 대한 숫자 설정을 조정합니다. 그런 다음 개체 크기에 대한 설정 번호를 조정하여 각 세포에 핵이 하나만 있도록 합니다.

이 요구 사항과 일치하지 않는 모든 셀 세그먼트는 수동 변경을 사용하여 수동으로 수정합니다. 그런 다음 소프트웨어의 데이터 분석 기능을 사용하여 세포를 분석합니다. 새 분석을 클릭하여 새 데이터 분석을 시작합니다.

선택한 이미지를 소스 프레임(source frames) 탭으로 드래그하고 각 개별 셀의 셀 면적, 광학 두께 및 부피를 포함한 셀 형태 매개변수를 기록합니다. 완료되면 산점도 또는 히스토그램 모드를 선택하고 데이터를 테이블 또는 그림으로 내보냅니다. 12시간 간격으로 촬영된 이미지를 5개 이상 선택하고 소프트웨어에서 제공하는 셀 번호를 기록합니다.

초기 세포 수로 정규화한 다음 세포 수를 플로팅하여 세포의 증식 속도를 추정합니다. 마지막으로, 지수 성장 곡선을 사용하여 데이터 점을 피팅하여 배가 시간을 추정합니다. 세포 움직임을 분석하려면 소프트웨어의 세포 추적 기능을 사용하십시오.

새 분석을 클릭하여 새 데이터 분석을 시작합니다. 그런 다음 관심 있는 기간의 일련의 이미지를 소스 프레임 탭으로 드래그합니다. 그런 다음 셀 추가 선택 모드에서 10-30개의 셀을 클릭하여 무작위로 선택합니다.

일련의 이미지에서 추적을 검토해야 합니다. 시스템이 셀을 추적하지 못하거나 잘못된 셀을 추적하는 경우 식별을 클릭하여 셀을 식별하거나 선택 모드로 이동하고 위치 수정을 클릭하여 셀의 위치를 수정하여 추적 셀을 수동으로 조정합니다. 완료되면 플롯 이동으로 이동하여 행 셀 궤적 플롯을 선택하거나 플롯 기능으로 이동하여 운동성 속도, 운동성, 마이그레이션 및 마이그레이션 직접성과 같은 다른 모션 관련 매개 변수를 플롯합니다.

데이터를 테이블 또는 Figure로 내보냅니다. 이 프로토콜에서는 정량적 위상 이미지가 홀로그래프로 표시됩니다. 여기에 표시된 세포는 혈관신생 및 비혈관신생 인간 골육종 세포의 전형적인 세포 형태를 나타냅니다.

셀 두께는 굴절률과 광학 경로 길이에 의해 계산되며 여기에 산점도로 표시됩니다. 두 가지 다른 세포 표현 유형은 서로 다른 분포 패턴을 보였으며 혈관신생 세포가 비혈관신생 세포보다 세포 면적이 더 작고 세포 두께가 더 크다는 것을 나타냅니다. 두 세포 유형의 세포 증식 속도는 이와 같은 2D 이미지에서 계산할 수 있으며, 이러한 이미지는 분할되어 이틀에 걸쳐 진행됩니다.

이러한 특정 세포 유형에 대해서는 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. 세포에 대한 세포 움직임 특성을 확인하려면 개별 세포를 선택하고 시간이 지남에 따라 추적해야 합니다. 여기서 추적된 셀은 다른 색상으로 윤곽선이 표시됩니다.

각 개별 셀은 여기에 설명된 총 경로 궤적을 사용하여 4시간 동안 추적되었으며, 여기서 0, 0 지점은 시작 위치이고 최종 위치는 색상이 지정된 점으로 표시됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 정량적 위상 이미징을 사용하여 세포, 형태학적 및 행동 매개변수 pan을 정량적으로 비교하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 경우, 혈관신생과 비혈관신생 세포 표현형 사이입니다.

이 개발 이후, 이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 종양 휴면 상태에서 벗어나 이 과정에서 혈관 신생의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 연속적이고 라벨링되지 않은 플랫폼에서. 인간 세포주를 이용한 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.