Name: Trichostatin A와 비타민 C의 조합 치료 체세포 핵 이식에 의해 생쥐 복제의 효율성 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 학습하세요 체세포 핵 이식을 이용한 생쥐 복제 효율 향상 방법을. 트리코스타틴 A와 비타민 C 처리가 배아 발달과 핵 재프로그래밍을 개선하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 JSP KAKENHI 보조금 번호 JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 기본 과학 연구 프로젝트 (K.M.에 150810) K.M. 스미 토모 재단 보조금에 의해 지원 되었다. 긴 대학 연구 그랜트 (15-나-2 K.M.과 석사). 지 암 연구 영국 (C6946/A24843) 및 Wellcome 트러스트 (203144/Z/16/Z)에 의해 제공 하는 핵심 지원을 인정 합니다.  우리 양 북 아 일 Backes-카 미 무라와 씨 제이 Horvat 증거 독서에 대 한 감사.

모든 동물 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 긴 대학교의 지침을 준수.
1입니다. 배양 기의 준비
<ol><li>95 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 0.35 m m KH2포4, 0.2 m m MgSO4 · 구성 된 배아 문화에 대 한 수정된 KSOM (mKSOM) 매체 준비 7 H2O, 1.71 m m CaCl2 · 2 H2O, 0.2 m m D (+)-포도 당, 0.2 m m 나트륨 Pyruvate, 1.0 m L-글루타민, 1.0 g/L Polyvinylpyrrolidone (PVP), 25.07 m m NaHCO3, 10 mM 나트륨 DL-젖 산, 페니실린, 0.05 g/L 및 0.05 g/L 살 균 물에 스.</li>
	<li>Hepes 버퍼 CZB (HCZB) 매체 81.5 m m NaCl, 4.8 m m KCl, 1.7 mM CaCl2 · 구성 된 배아 조작에 대 한 준비 2 H2O, 1.18 m m MgSO4 · 7 H2O, 1.18 m m KH2포4, 0.11 m m EDTA · 2Na, 36.1 m m 나트륨 DL-젖 산, 5.55 m D m (+)-포도 당, 0.025 g/mL 페니실린, 0.035 g/L 스, 0.014 m m 페 놀 레드, 1.0 g/L 폴 리 비닐 알코올, 5.0 m m NaHCO3및 20.0 mM Hepes 나트륨 소금 살 균 물에.</li>
	<li>Oocyte 활성화에 대 한 정품 인증 매체를 준비: mKSOM 매체와 50 nM TSA, 2mm EGTA, 5 µ g/mL cytochalasin B (CB), 5 mM SrCl2보충.</li>
</ol>2. 준비의 이온 소 혈 청 알 부 민 (dBSA)
<ol><li>상 온 (12%의 최종 농도)에서 살 균 물 10 mL에 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 1.2 g을 용 해.</li>
	<li>부드러운 교 반으로 실내 온도에서 살 균 물에 BSA의 12%를 준비 위의 혼합된 이온 교환 수 지 구슬의 약 0.12 g을 추가 합니다.</li>
	<li>구슬 파란색-녹색에서 색을 변경 하는 때 금, 복구는 피 펫을 사용 하 여 표면에 뜨는 솔루션. 다음 대체 구슬 신선한 것 들 (그림 1). 참고: 구슬의 교체 일반적으로 한 번만 수행 됩니다. 아마도 완전 이온화를 몇 가지 교체를 필요합니다. 가이드, 구슬의 색상에서 그대로 하는 경우로 골드에 파란 녹색, 그것은 이온 교환이 완료 되 나타냅니다.</li>
	<li>구슬 색상 변경 확인 솔루션을 복구 합니다. 참고: 복구 솔루션 흐린 경우, 원심 (175 x g, 5 분) 필터 막힘을 방지 하기 위해.</li>
	<li>복구 된 보충 10.5% NaHCO3의 250 µ L로 솔루션. 참고:이 프로세스 dBSA 솔루션 중화 pH 조건에 대 한 것입니다. 그러나, NaHCO3 피할 수 있습니다.</li>
	<li>0.45 μ m 필터를 사용 하 여 상쾌한 소독 고 dBSA 재고 솔루션으로-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
</ol>3. oocyte 컬렉션
참고: 모든 마우스 빛 제어 및 에어컨을 갖춘 객실에서 유지 되었다.
<ol><li>슈퍼-배 란 각 여성 B6D2F1 마우스 (세 8-10 주) 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)의 7.5 IU의 복 주입 및 인간 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 48 h PMSG 주사 후의 7.5 IU.</li>
	<li>자 궁 경부 전위 14-16 h 여 안락사를 수행 hCG 주사 후. 복 부 생식로 표준 해 부 기법13를 사용 하 여 액세스를 incise합니다 간단히, 피부를 꼬 집 고 작은 측면 절 개는 중간에가 위. 단단히 위에 피부 절 개 아래 고 머리와 꼬리 쪽으로 피부를 당겨. 잘라가 위를 사용 하 여 복 막 하 고 밀어 용기의 코일 방식의 oviducts, 자 궁, 난소의 두 뿔의 존재를 확인 합니다.</li>
	<li>작은 똑 바른가 위와 핀셋 oviducts extirpate, 표면 떨어져 피를 닦아 필터 종이. 미네랄 오일에는 oviducts를 설정 합니다. 그런 다음 절 개 바늘을 사용 하 여 수 란 관의 ampulla 잘라 고 적 운 oocyte 단지 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체의 200 µ L 상품에는 수 란 관의 ampulla에서 오는 이동 합니다. 지구 온난화 접시에 5 분 동안 품 어. 주의: 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체에 10 분 이상 노출 된 oocytes에 대 한 해로운 것입니다.</li>
	<li>적 운 세포 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA 일부 남은 적 운 세포 전송 두 번째 meiotic 분열 (MII) 무대 oocytes에는 stereomicroscope에서 적 운 oocyte의 단지에서 해제 됩니다 확인 하십시오. 그런 다음, 아래로 pipetting으로 MII 무대 oocytes 4 번 세척 (의 피 펫을 사용 하 여 < 100 µ m 내부 직경) mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA 나머지 적 운 세포 분리에. 참고: 작은 피 펫의 사용 적 운 세포의 분리를 촉진 한다.</li>
	<li>37 ° C에서 5%에서 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA Mll 무대 oocytes를 품 어 enucleation까지 CO2 배양 기. 참고:는 oocyte의 그것 보다 약간 큰 직경을 가진 작은 피 펫 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 핵 이식 기증자 세포의 준비
<ol><li>단계 3.3-3.5, 후 denuded oocytes 적 운 oocyte 단지에서 격리 됩니다. 나머지 적 운 세포는 stereomicroscope 아래 피 펫을 사용 하 여 HCZB 보통 6 %dBSA 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체에 적 운 oocyte 단지에서 분산의 소량 (약 2 µ L)를 전송 합니다.</li>
	<li>SCNT에 필요한 때까지 37 ° C에서 지구 온난화에 6 %dBSA HCZB 매체에 적 운 세포를 놓습니다. 참고: 때 fibroblast 세포 (예., murine 태아 섬유 아 세포 세포)는 조직 배양 접시에서 세포를 분리 하 고 펠 릿으로 원심 기증자 세포로 사용. HCZB 매체 6 %dBSA 포함 된 셀의 펠 릿 resuspend</li>
</ol>5입니다. Oocytes enucleation
<ol><li>0.9 g PVP 10 mL HCZB 매체를 추가 하 여 9 %PVP 매체를 준비, 하룻밤 냉장고 (4 ° C), 및 다음 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독.</li>
	<li>디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 5 mL에 CB의 5 mg을 추가 하 여 CB 재고 솔루션 (1 mg/mL의 농도)를 준비 합니다. HCZB 매체 (5 µ g/mL의 최종 농도)와 CB 재고 솔루션을 희석 하 고 enucleation 솔루션으로 사용 합니다.</li>
	<li>흡입 및 멸 균된 피 펫을 통해 좀처럼 5 µ g/mL CB (enucleation 솔루션)를 포함 하는 HCZB 매체의 20 µ L에서 Mll 무대 oocytes를 세척 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에). 5 번 세척 절차를 반복 합니다. Enucleation 프로세스를 시작 하기 전에 enucleation 솔루션에서 지구 온난화에 약 10 분을 기다립니다.</li>
	<li>그림 2A와 같이 enucleation 챔버를 준비 합니다. Mll oocytes enucleation 챔버 흡입 하 고 길게는 피 펫을 사용 하 여 전송 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에); enucleation 솔루션의 4 µ L를 배치 하 고 미네랄 오일 챔버 커버. 참고: 챔버, 대신 60 mm 페 트리 접시의 커버를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>스핀 들 및 현미경 (400 X) 실 온에서 MII 무대 oocyte의 염색체를 식별 합니다. 동양 발음 첫 극 지 몸, Mll 무대 oocyte는 스핀 들 및 염색체의 위치는 3 또는 9 시 micropipette를 들고 피 펫을 사용 하 여 (그림 2B) 위치. 참고: 사용 하는 현미경 총에서 400 배 확대의 렌즈는. 또한, 목표 렌즈 한다 5 배 / 0.12과 40 X / 0.55 이다. Piezo 펄스 모는 피 펫의 zona pellucida의 빠른 드릴링 허용 합니다. 또한, 레이저 시스템 (예, XYClone) 압 전 구동 시스템 대신 zona pellucida 드릴링에 대 한 사용할 수 이기도 합니다.</li>
	<li>3-6, 압 맥 박 강도 설정 하 고 운전 피 펄스 micromanipulation 피 펫 (7-8 µ m 내부 직경 평면 종단 팁)를 사용 하 여 zona pellucida 드릴. Zona pellucida에 구멍을 연 후 완전히 스핀 들 및 세포질 (그림 2C)의 최소한의 금액으로 염색체 enucleate. 참고:이 프로세스 동안 oocytes 경향이 단단히 접시 바닥에 붙이거나 BSA14없이 매체 때문에 플라스틱. 10 분 이내 enucleation 프로세스를 완료 해야 합니다, 그리고 enucleated oocytes 인큐베이터에 반환. 적절 한 수 한 enucleation에서 조작할 수 있습니다 oocytes의 10와 20 사이입니다. Oocytes의 큰 배치 enucleation 절차 반복 됩니다.</li>
	<li>가시광선 (그림 2C, 중간), 아래는 세포질에서 염색체의 부재를 확인 한 다음 0.3% dBSA CB 부족을 포함 하는 mKSOM 매체에 enucleated oocytes를 철저 하 게 세척 합니다. 37 ° C에서 5%에서 인큐베이터에 접시 소개 셀 퓨전까지 CO2 . 참고: 후 enucleation, ooplasm에서 제거 하는 세포질 포함 스핀 들 및 염색체.</li>
</ol>6. 기증자 세포와 Enucleated Oocyte의 융합
<ol><li>
HVJ-E의 준비
	<ol>
<li>동결 건조 된 HVJ-E에 차가운 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션의 260 µ L를 추가 (키트, 참조 테이블의 재료) 및 플라스틱 아래로 완전히 중단 될 때까지. 참고: 동결 건조 된 HVJ-E의 적절 한 금액은 한 병에 준비 하 고 260 µ L HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 키트에 포함 된다.</li>
		<li>5 µ L aliquots HVJ E 솔루션을 준비 하 고 셀 퓨전까지-80 ° C에서 저장. 주의: 그것 이기 때문에 온도 민감한 얼음, HVJ E를 신중 하 게 취급 합니다. 실험, 적절 하 게 압력솥 HVJ 전자 재료 및 컨테이너 바이러스 구성 요소를 완전히 비활성화를 완료 후</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 융합
	<ol>
<li>즉시 사용 하기 전에 셀 퓨전 버퍼의 20 µ L로 HVJ 전자 솔루션의 5 µ L를 희석. 장소 사용까지 얼음에 희석된 HVJ E 솔루션. 참고: 셀 퓨전 버퍼 HVJ 전자 키트에 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>그림 3A와 같이 셀 퓨전 챔버를 준비 합니다. HCZB 매체는 피 펫을 사용 하 여 셀 퓨전 챔버 enucleated oocytes 전송 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에); 각 솔루션의 장소 4 µ L (9% 6%-BSA 기증자 세포, HVJ E 솔루션, HCZB 매체를 포함 하는 HCZB 매체 HCZB 매체에 PVP) 약 1 mL의 미네랄 오일와 챔버 커버. 참고: 적절 한 수 한 셀 퓨전 절차 동안 조작에 대 한 상공 회의소에 전송 되는 enucleated oocytes의 5에서 30입니다. Oocytes의 큰 배치, 셀 퓨전 절차 반복 됩니다. 챔버, 대신 60 mm 페 트리 접시 커버를 사용할 수 있습니다, 사용할 수 있는 경우.</li>
		<li>HCZB 매체 400 X magnificationat 실 온에서 현미경 아래에 enucleated oocytes를 놓습니다. 기증자 세포 (6-7 µ m 내부 직경 평면 종단 팁), micromanipulation 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 셀 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션으로 추방.</li>
		<li>다음에 분리 될 것 동등 하 게 서로 다른 직렬 세포 융합을 활성화 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 적 운 세포 하나 하나 발음. HCZB 중간 지주 피 펫을 사용 하 여 enucleated oocytes를 하십시오. Micromanipulation 피 펫 piezo 펄스 (2-3의 3-6, 속도의 강도)와 zona pellucida 드릴.</li>
		<li>Zona pellucida에 구멍을 연 후 oocyte 멤브레인을 거치지 않고 볼륨 5 번 적 운 세포의 볼륨 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 함께 oocyte 막에 단단히 적 운 세포를 놓습니다. 참고: 적 운 세포에 대 한 6-7 µ m 내부 직경은 평면 종단 팁 micromanipulation 펫의 준비. 펫 부드러운 셀 출시를 유지 하기 위한 9 %PVP 매체를 사용 하 여 정기적으로 세척 되어야 한다. 단계 6.2.3-6.2.5 10 분 안에 완성 해야 합니다 또는 세포 융합의 효율 낮은 것 이다. HVJ-E의 막 융합 활동 압력가 마로 소독, 세제, 또는 70% 에탄올 치료에 의해 비활성화 됩니다. 실험 후 HVJ E 솔루션의 적절 하 게 삭제 수 해야 합니다.</li>
		<li>세포 융합의 조작, 후 즉시 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA, oocytes는 전송 고 37 ° C에서 5%에서 인큐베이터로 이동 1 h의 CO2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 재건축된 Oocytes 및 Trichostatin A 치료와 비타민 C의 활성화
<ol><li>
TSA의 준비
	<ol>
<li>5mm TSA 솔루션 3 µ L aliquots로 분배 하 고-20 ° c.에 솔루션 저장</li>
		<li>DMSO (12.5 µ M의 농도)의 1 mL에 5mm TSA 재고 솔루션의 2.5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>12.5 µ M TSA 재고 솔루션 활성화 매체 mKSOM 매체의 2 ml에서의 8 µ L를 희석 (50의 최종 농도 nM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VC의 준비
	<ol>
<li>메 마른 내 무료 물 1 mL로 VC의 1 밀리 그램을 추가 하 고-20 ° c.에 저장</li>
		<li>MKSOM 매체 (10 µ g/mL의 최종 농도) VC 재고 솔루션을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재건축된 Oocytes의 활성화
	<ol>
<li>셀 퓨전 후 1 시간 조기 염색체 응축 (PCC) 재건축된 oocytes (그림 3B)에서 현미경 (400 X)를 사용 하 여 확인 합니다.</li>
		<li>정품 인증 매체를 재건축된 oocytes를 전송 (1.3 단계 참조) TSA를 포함 하 고 37 ° C에서 5%에서 6 h에 대 한 품 어 CO2 공기 (그림 3C). SCNT 배아에서 프로-핵의 형성을 관찰 후 2 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA (그림 2C)에 TSA 치료의 더 많은 시간을 적용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MKSOM 보통 VC 보충 TSA 치료 배아를 전송 및 그림 3D와 같이 7 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>VC 치료의 7 h 후 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA, VC 치료 배아를 전송 하 고 37 ° C에서 5%에서 4 일 동안 품 어 공기에 CO2 . 참고: 복제 된 생쥐를 생산, 형태학 상으로 정상적인 2 세포 단계 태아에 전송 oviducts 의사 임신 여성 쥐 (MCH(ICR)) 질 플러그 (pseudopregnancy의 하루 0.5)15를 발견 하는 날에. 19.5 일 후 이식 사이트 및 신생아의 수는 제왕 절 개 후 기록 됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

결론적으로, 이러한 결과 제시 SCNT 메서드 수 기술적인 어려움을 줄일 수 및 유전 수정 및 mRNA 보충 (표 1, 표 2), 필요 없이 SCNT의 효율성을 증가 하 고 좋습니다 보장 복제 된 배아의 안정적인 생산입니다. 이 방법을 통해 더 나은 생존 율 및 단순화 된 프로토콜 기존의 방법 보다 더 많은 SCNT 배아를 재구성 하 수 있습니다. 이 프로토콜에서 하나의 중요 한 단계는 세포 융합 이다. 복제 된 생쥐를 성공적으로 생성 하려면 HVJ-E 프로토콜에 설명 된 적절 한 양의 셀 퓨전 프로세스 동안 유지 되 고 oocytes 단계 6.2.3-6.2.5 동안 인큐베이터 10 분 이내에 반환 하는 데 필요한 생명 이다. 이후 20 ~ 30 기증자 세포 조작 피 펫에서 한 번에 HVJ-E 함께 발음 될 수 있다, 한 작업에서 얻은 oocytes 수는 기존 방법 보다 더 큰. 결국, 우리는 약 20 ~ 30 10 분 이내 다시 생성 된 oocytes를 생성할 수 있습니다. 한 시간 걸릴 한다 oocytes (100 이상)의 큰 배치와 셀 퓨전 절차를 작업 하는 경우에 또는 단계 6.2.3-6.2.5 반복 하 여 더 적은. 여기에 제시 된 기술과 방법 단순화 된 기술 요구 사항을 효율적인 프로토콜 사용할 수 있습니다.
현재, SCNT 배아의 개발 기본 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 이 향상 된 SCNT 메서드는 또한 같은 재활 메커니즘 공부 하는이 방법은 하나의 실험에 많은 복제 배아를 생산할 수 있기 때문에 기여. 이 방법은 세포 융합에 대 한 손상 세포 막과 체세포를 사용. 따라서,와 같은 꼬리 팁16세포, sertoli 세포17, 미 발달 줄기 (ES) 세포18다른 셀에이 접근을 적용 하 수 있습니다. 꼬리 끝 셀, 등 비교적 큰 세포를 주입에 대 한 기존의 SCNT 방법을 사용 하는 경우 직접 oocyte 세포질에 그것은 된다도 라이브 배아를 더 기술적으로 까다로운. 또한, 상대적으로 하드 세포, sertoli 세포 등는 pipetting 주입 하 여 어렵다입니다. 이러한 다양 한 셀 형식으로 간주 됩니다 때 HVJ-E를 이용 하 여 세포 융합 방법 간단 하 고 효과적입니다. 비록 HVJ-E의 안전과 가치 설득 시연된19,20왔다, 다시 농업 또는 생물 의학 목적을 위한 복제 동물 생산 HVJ-E를 사용 하 여의 타당성을 고려 하는 중요 한 수 있습니다.
또한, 최근 한 그룹은 성공적으로 복제 된 쥐 소변 세포21에서 파생 된 생산. 구조 포유류 멸종, 이제부터 SCNT 소변 셀 등 비-침략 적 방식으로 수집 된 셀을 사용 하 여 있을 것 이다 이상적인. 더 최근에, 다른 그룹은 직접 생성 된 항 원 특정 CD4를 사용 하 여 복제 마우스+ T22세포. 그것은이 방법은 효율적으로 쥐 같은 세포에서 복제에 적용 됩니다 경우 검사 흥미로울 것입니다. 또한, Latrunculin A enucleation SCNT oocytes23parthenogenetic 활성화 동안 말라 중 합 억제에 대 한 더 나은 대안으로 보고 되었습니다. 미래 연구는 Latrunculin A 치료 cytochalasin B, 대신 복제 된 자손의 세대를 더 향상 되는지 여부 공개 수 있습니다. 또한, TSA 치료는 성공적으로 사용 되었습니다 쥐, 돼지24및 토끼25 치료 시간, 기간, 및 농도 변경 하 여. 또한, VC 돼지 SCNT10, 배아 개발 향상 뿐만 아니라 또한 인간 및 쥐26iPS 셀 생산을 향상 시킵니다. 따라서, 그것은 다른 포유류 종에 TSA 및 VC 치료를 적용할 수 있습니다 그리고 우리가 각 종족에 대 한 TSA와 VC의 처리 시간을 최적화 할 수 있습니다 추측 하 듯.
결론적으로,이 방법은 간단한 절차와 효율성의 실용적인 수준으로 복제 된 쥐 생성 가능 하 게 것 이다. 따라서,이 연구의 결과 우리 SCNT 기술을 사용 하는 희귀 동물의 유전 자원 보존 및 핵 프로그래밍 및 초기 배아 발달의 분자 메커니즘을 이해를 발생할 수 있습니다.

SCNT 기술 enucleated oocyte 전송에 하나의 체세포 또는 핵을 사용 하 여 복제 동물의 생산을 수 있습니다. SCNT 기술의 목적 중 하나는 복제 된 배아에서 핵 이식 배아 줄기 세포 (NT-ESCs) 라인의 유래입니다. 1998 년에 와카야마 외 알., 보고 된 첫 번째 시간1Cumulina 라는 성공적으로 복제 된 마우스를 생산. 그 이후, 쥐의 복제 널리 연구 되었습니다, 그리고 체세포 핵의 핵 프로그래밍에 많은 중요 한 통찰력을 얻은. 다른 한편으로,이 기술은 꽤 어려운 수많은 micromanipulation 단계를 동반 된다 마스터, 3 개월2이상의 집중적인 훈련을 필요로.
SCNT를 사용 하 여 복제 된 쥐의 생산 일본 (HVJ)4의 Hemagglutinating 바이러스에 의해 셀 퓨전 메서드는 원래 호놀룰루 방법1, electrofusion 방법3에서 진화 했다. 그러나,는 있던 통해 세포 핵의 직접 분사는 해롭게 oocyte 생존에 영향을 미칠 경향이 있다. electrofusion은 각 세포 막에는 다른 경도, 최적의 상태를 결정 하 고 어려운 있기 때문에 효율성, 낮은. HVJ 처리 연구자 및 실험 동물의 안전에 대 한 특정 장비를 필요로 하기 때문에 힘 드는입니다. 최근, 기증자 세포와 oocyte 세포질 융합 HVJ-E 사용된5되었습니다. 만 HVJ-E는 바이러스의 증식 또는 감염 능력 없이 세포 막 융합 기능이 있다. Genomic RNAs HVJ HVJ e에서 완전히 활성화 되지 않습니다. HVJ-E의 사용은 따라서 SCNT 동안 세포 융합의 쉬운 취급을 지원합니다.
여러 보고서 TSA, 히스톤 deacetylase 억제 물와 SCNT 배아의 치료 1% ~ 6.56,7미만에서 라이브 새끼의 생산 효율을 크게 향상 됩니다 나타났습니다. TSA 치료 SCNT 배아8에서 히스톤 부호 수정 통해 프로그래밍을 가속 한다. 최근, 특정 mRNAs, 히스톤 lysine demethylase 인도의 히스톤 H3 lysin 9 (H3K9)을 제거 하는 (KDM4), 4의 주입 SCNT 배아, reprograming-내성 지역에서 특히에 trimethylation의 개발을 증가 표시 되었습니다 복제 마우스 배아9. 한편, 히스톤 한정자 역할도, VC H3K910trimethylation를 감소 했다. 또한, VC 돼지 SCNT10배아 발달을 향상 시킵니다. 그것은 SCNT 배아 dBSA 주입 배아 개발11의 개선에 지도 보고 되었습니다.
우리는 이전 작은 분자의, 즉 TSA 및 VC, dBSA, 함께 조합 SCNT 배아12의 개발을 극적으로 향상 된 것을 발견. 여기, 우리는 매우 효율적이 고 간단한 복제 절차12를 나타내는 마우스, 이전에 보고 된 SCNT 방법 선발. 우리는 또한 HVJ. 처리 설명 이들은이 SCNT 방법을 통해 유전자 변형된 동물 유전 자원 보존 하거나 발달 및 생식 생물학의 분야에서 많은 연구를 도울 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치, Co., Lcc.</td><td>28-2270-5</td><td>중형</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-03542</td><td>중형</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>165-04242</td><td>중간</td></tr><tr><td>MgSO4 &middot; 7H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>137-00402</td><td>매체</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00431</td><td>미디엄</td></tr><tr><td>D(+)-글루코스</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>041-00595</td><td>피</td></tr><tr><td>루브산 나트륨</td><td>중형 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-03062</td><td>매체</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>G3126</td><td>중간</td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈</td><td>용 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>168-17042</td><td>매체</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31213-15</td><td>중간</td></tr><tr><td>나트륨 DL- 젖산염</td><td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31605-72</td><td>매체</td></tr><tr><td>페니실린</td><td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td><td>4987222637671 (GTIN-13)</td> <td>매체 용</td></tr><tr><td>스트렙토 마이신</td><td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td><td>4987222665643 (GTIN-13)</td><td>중간</td></tr><tr><td>멸균수, 내독소 무함유</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>196-15645</td><td>중간</td></tr><tr><td>EDTA 및 미드 도트; 2Na</td><td>Dojindo Lab.</td><td>345-01865</td><td>매체</td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P0290</td><td>중간</td></tr><tr><td>HEPES 나트륨 염</td><td>용 Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>H3784</td><td>중간</td></tr><tr><td>폴리비닐 알코올</td>용 <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P8136</td><td>중간</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td>용 <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A3311</td><td>매체</td></tr><tr><td>BT AG 501-X8 (D) Resin</td><td>Bio-Rad Lab., Inc.용</td><td>143-7425</td><td>dBSA</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc의 제조를</td> 위해<td>H3506</td><td>난모세포 및 적운 세포 수집용</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>034-17554</td><td>적출 및 난모세포 활성화용</td></tr><tr><td>피에조 마이크로 매니퓰레이터</td><td>프라임 테크</td> 주식회사<td>PMM-150FU</td><td>마이크로 조작</td></tr><tr><td>HVJ 봉투 세포 융합 키트 GenomONE-CF</td><td>Ishihara 산업 kaisha, Ltd.</td><td>세포 융합을 위한 HVJ-E 현탁액 0.5mL와 세포 융합 완충액 10mL를 함유</td>한 <td>CF001</td></tr><tr><td>SrCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>193-09442</td><td>난모세포 활성화를 위해</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>E8145</td><td>난모세포 활성화용</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>045-24511</td><td>용제</td></tr><tr><td>트리코스타틴 A</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>T1952</td><td>SCNT 배아로 배양</td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A5960</td><td>SCNT 배아로 배양하기 위해</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>M8410</td><td>매체 커버용</td></tr></tbody></table>

trichostatin a와 비타민 c의 조합 치료 체세포 핵 이식에 의해 생쥐 복제의 효율성 향상

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

체세포 핵 이식 (SCNT) 직접 기증자 세포에서 복제 동물을 생산 하는 독특한 기회를 제공 하 고 숙련 기술의 사용을 요구 한다. 또한, 복제의 효율성 복제 동물, 특히 쥐의 성공적인 생산 이후 낮은 남아 있다. 복제 효율성을 개선 하기 위해 많은 시도 되었습니다 그리고 trichostatin A (TSA), 히스톤 deacetylase 억제 물 복제의 효율성을 향상 시키기 위해 널리 사용 되었습니다. 여기, 우리는 생쥐에서 극적으로 향상 된 복제 방법 보고. 이 체세포 핵 이식 방법은 일본 봉투 (HVJ-E), 쉽게 조작 가능 하 게의 Hemagglutinating 바이러스의 사용 포함. 또한, 두 개의 작은 분자, TSA와 이온된 소 혈 청 알 부 민 (dBSA), 비타민 C (VC)를 사용 하 여 치료 배아 발달에 대 한 매우 효과적입니다. 이 방법은 추가 주입도 유전자 조작, 요구 하 고 따라서 실제 사용에 대 한 간단 하 고, 적합 한 메서드를 제공. 이 메서드는 연구자 배양된 세포에서 유전자 변형된 동물 생산에 대 한 기술적으로 가능한 접근 될 수 있다. 또한, 복제를 통해 멸종 위기 동물의 구조에 대 한 유용한 방법을 수 있습니다.

복제 마우스 배아를 생성 하려면 적 운 세포와 태아 섬유 아 세포 세포는 사용 되었다. 재건축된 oocytes oocyte 활성화 후 2 셀 단계에 개발의 수는 표 1에 표시 됩니다. Pronuclear (89 ~ 100%) 형성과 발전 2 세포 단계 (77 89%)의 아주 높은 속도 모든 조건 하에서 관찰 되었다. 적 운 세포에서 파생 되었고 2 셀 단계에 개발, 복제 된 배아의 일부 의사 임신 여성의 oviducts 전송 했다. 6 복제 된 자손 72 전송된 배아에서 TSA와 VC (그림 4)의 직렬 처리에 의해 세 임신 여성에서 생산 되었다. 복제 된 배아의 약 15%가 SCNT 절차12에 따라 용어를 개발 보고 되었습니다. 또한, 다른 기관에서 2 셀 배아 복제 전송 복제 배아에 단일 TSA 치료 보다 더 나은 개발을 대표 하는 9 ~ 15% 라이브 자손을 달성 했다. 또한, TSA와 VC 치료는 크게 blastocyst 단계에 체 외에서 배아 개발의 효율성을 개선 (표 2, P &lt; 0.05, 스튜던트 t-검정). 이러한 생체 외에서 발달 데이터 TSA와 VC의 긍정적인 효과 마우스 종자도 셀 유형에 의해 제한 하는 방법을 보여 줍니다. 이 결과이 SCNT 메서드 복제 된 배아의 발달 능력을 용이 하 게 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig1.jpg"> 그림 1: dBSA 준비 합니다. DBSA 솔루션을 준비 하기 위한 단계별 절차 묘사 된다. 이온 교환 범위 구슬의 색깔 변화에 의해 재판 될 수 있습니다. 위 왼쪽된 그림 쇼 BSA의 1.2 g 실내 온도에서 살 균 물 10 mL에 녹입니다. BSA, 해산 후 이온 교환 수 지 구슬 (오른쪽 상단) 추가 됩니다. 이온 교환 수 지 구슬 BSA 솔루션의 혼합물에서 파랑-녹색 색상을 변경 하는 때 골드 (오른쪽 아래), 신선한 것 들으로 구슬 바꿉니다. 왼쪽 아래 그림의 구슬의 색상이 블루-그린, 유지 및 이온 교환 완료 수 있습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig2.jpg"> 그림 2: Enucleation 절차입니다. (A) enucleation 챔버의 그림. Oocytes enucleation CB와 HCZB 매체에서 수행 됩니다. 압 전 구동 시스템에 대 한 9 %PVP 매체의 자리는 enucleation 위한 유리 피 펫을 준비 하는 데 사용 됩니다. 관광 명소는 미네랄 오일에 포함 됩니다. (B) 다이어그램 및 한 현미경 사진 스핀 들 및 enucleation 전에 염색체의 위치를 표시합니다. 화살촉을 블랙: 스핀 들 및 염색체. 붉은 화살표: 첫 번째 극 시체. (C) A 다이어그램 그리고 성공적인 enucleation 보여 현미경 사진. 화살촉을 블랙: 스핀 들 및 염색체. 붉은 화살표: 첫 번째 극 시체. 파란색 화살표: zona pellucida에 구멍. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig3.jpg"> 그림 3: 셀 퓨전 절차 및 문화 SCNT 배아의 상태. (A<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig4.jpg"> <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig4large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td colspan="2" rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td colspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="6"></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 trichostatin A, 비타민 C, 그리고 이온된 소 혈 청 알 부 민을 사용 하 여 복제 하는 극적으로 향상 된 방법을 설명 합니다. 우리는 복제 된 배아의 효율적인 개발을 지 원하는 단순화, 재현 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 따라서,이 메서드는 마우스 복제에 대 한 표준화 된 절차 될 수 있다.

Trichostatin A와 비타민 C의 조합 치료 체세포 핵 이식에 의해 생쥐 복제의 효율성 향상

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

이 실험의 전반적인 목표는 체세포 핵 이식을 사용하여 재건된 배아와 복제된 마우스의 생산 효율성을 향상시키는 것입니다. 이 방법은 기본 생물학, 발달 생물학 및 멸종 위기에 처한 동물 구조 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 배아 발달, 핵 프로그래밍 및 유전자 연구 보존과 같은.이 방법 및 기술의 주요 장점은 간단한 절차로 실용적인 수준의 효율성으로 복제 된 마우스를 생성 할 수 있다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배양 배지를 준비한 후 1.2g의 BSA를 10mL의 멸균 실온수에 용해시킵니다. 약 0.12g의 혼합 이온 교환 수지 비드를 실온에서 부드럽게 저어주면서 BSA 용액에 추가합니다.구슬의 색이 청록색에서 금색으로 변하면 피펫을 사용하여 상층액을 회수한 다음 구슬을 새 배치로 교체하십시오. 신선한 구슬의 색이 변하지 않는 것을 확인한 후 용액을 회수하십시오. 그런 다음 250 마이크로 리터의 10.5 % 중탄산 나트륨을 첨가하십시오.0.45 미크론 필터를 사용하여 상등액을 멸균 한 다음 DBSA 원액으로 표시하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 과배란을 실시한 암컷 마우스에 대해 안락사를 수행한 후, 표준 해부 기술을 사용하여 복부를 절개하여 생식관에 접근했습니다. 작은 가위와 핀셋을 사용하여 난관을 제거하고 여과지로 옮겨 표면의 혈액을 닦아냅니다.다음으로, 난관을 미네랄 오일에 넣은 다음 해부 바늘을 사용하여 난관의 앰플라를 절단하고 팽글러에서 나오는 적운 난모 세포 복합체를 0.1% 히알루로니다아제가 함유된 HCZB 배지 200마이크로리터 방울로 이동합니다. 조직을 보온 플레이트에서 5분 동안 배양합니다. 실체현미경을 통해 적운 세포가 적운 난모세포 복합체에서 방출되었는지 확인한 다음 일부 남아있는 적운 세포와 함께 두 번째 감수분열 또는 M2 중기 난모세포를 0.3%DBSA를 포함하는 MKSOM 배지로 전달합니다.M2 단계 난모세포를 배지에서 위아래로 피펫팅하여 나머지 적운 세포를 분리하여 4회 세척합니다. 그런 다음 난모세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 적출될 때까지 배지에서 배양합니다. 적운 난모세포 복합체에서 탈락된 난모세포를 분리하기 위해 피펫을 사용하는 동안 실체현미경으로 적운 난모세포 복합체에서 분산된 소량의 나머지 적운 세포를 6%DBSA가 있는 HCZB 배지로 전달합니다.체세포 핵 이식 또는 SCNT에 필요할 때까지 섭씨 37도의 온난판에 적운 세포를 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 PVP 배지 및 CB 원액을 준비한 후 CB 1밀리리터당 5마이크로그램이 포함된 20마이크로리터의 HCZB 배지가 있는 멸균 피펫을 사용하여 M2 단계 난모세포를 세척합니다. 세척을 5회 반복한 후 보온 플레이트에서 적출 용액에 난모세포를 10분 동안 배양합니다.다음으로, 적출 챔버를 준비한 다음 피펫을 사용하여 M2 난모세포를 챔버 내로 이동합니다. 4마이크로리터의 적출 용액을 넣고 챔버를 미네랄 오일로 덮습니다. 실온에서 현미경으로 M2 단계 난모세포의 방추체와 염색체를 확인합니다.그런 다음 홀딩 피펫과 마이크로피펫을 사용하여 방추체와 염색체의 위치가 3:00 또는 9:00 위치에 있도록 뚜렷한 첫 번째 극성체로 난모세포의 방향을 지정합니다. 파이조 펄스 강도를 3에서 6으로 설정하고 미세 조작 피펫을 사용하여 투명대에 구멍을 뚫고 구멍을 엽니다. 그런 다음 최소한의 세포질로 방추체와 염색체를 완전히 적출합니다.가시광선 아래에서 세포질에 염색체가 없는지 확인한 다음 CB가 결핍된 0.3% DBSA를 함유한 MKSOM 배지로 적출된 난모세포를 철저히 세척합니다. 세포 융합이 이루어질 때까지 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 접시를 배양합니다. HBJE를 준비하기 위해 동결건조된 HVJ-E에 260마이크로리터의 얼음처럼 차가운 HBJE 현탁액을 첨가하고 완전히 현탁될 때까지 위아래로 피펫팅합니다.용액의 5마이크로리터 분취액을 준비하고 세포 융합 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 세포 융합을 수행하려면 20마이크로리터의 세포 융합 완충액을 사용하여 5마이크로리터의 HVJ-E 용액을 희석합니다. 희석된 HBJE 용액을 사용할 때까지 얼음 위에 놓습니다.본 그림과 같이 세포 융합 챔버를 준비한 후, 피펫을 사용하여 적출된 난모세포를 챔버 내의 HCZB 배지로 이동시킵니다. 그림과 같이 각 용액을 4마이크로리터씩 넣고 약 1ml의 미네랄 오일을 사용하여 챔버를 덮습니다. 적출된 난모세포가 있는 챔버를 실온에서 400x 배율로 현미경으로 놓습니다.그런 다음 micromanipulation 피펫을 사용하여 공여자 세포를 HVJ-E 현탁액으로 옮깁니다. 적운 세포를 하나씩 흡인하여 서로 균등하게 분리하여 연속 세포 융합을 가능하게 합니다. 그런 다음 홀딩 피펫을 사용하여 적출된 난모세포를 HCZB 배지에 유지하고 미세 조작 피펫과 함께 파이조 펄스를 사용하여 투명대를 드릴링합니다.투명대(zona pellucida)의 구멍을 뚫은 후 HVJ-E 용액의 약 5배 부피를 가진 적운 세포를 피펫으로 삽입하고 막을 거치지 않고 난모세포막으로 단단히 배출합니다. 세포 융합 조작 후 즉시 난모세포를 0.3% DBSA가 포함된 MKSOM 배지로 옮기고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터로 1시간 동안 이동합니다. 그 단계는 HCVB 배지에 적출된 난모세포를 현미경 아래에 놓고 인큐베이터로 되돌릴 때까지 10분 이내에 완료해야 합니다.세포 융합 후 400x 배율에서 현미경으로 재구성된 난모세포의 조기 염색체 응축을 확인합니다. 재구성된 난모세포를 트리호스타틴 A 또는 TSA를 함유한 활성화 배지로 옮기고 섭씨 37도에서 공기 중 5%의 이산화탄소에서 6시간 동안 배양합니다. SENT 배아에서 전핵 형성을 관찰한 다음 0.3%TBSA가 함유된 MKSOM 배지에서 TSA 처리를 2시간 더 적용합니다.텍스트 프로토콜에 따라 비타민 C 치료를 수행하십시오. 이 표에서 볼 수 있듯이, 복제된 마우스 난모세포에 대한 TSA 및 비타민 C 처리는 매우 높은 전핵 형성률을 보였으며 모든 조건에서 두 세포 단계까지 발달했습니다. 적운 세포에서 유래하여 두 세포 단계로 발달한 일부 복제된 배아는 유사 임신한 암컷의 난관으로 이식되었습니다.이 그림은 TSA와 비타민 C의 연속 처리에 의해 3명의 임산부로부터 생산된 72개의 이식된 배아에서 발달한 6개의 복제된 자손을 보여줍니다.마지막으로, 여기에서 입증된 바와 같이, TSA와 VC를 사용한 처리는 배반포 단계까지 체외 배아 발달의 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 절차를 시도하는 동안 필요한 모든 배지와 시약이 미리 준비되어 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 절차 자체는 따라하기 쉽고 잘 준비된 자료로 예상 결과를 얻을 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 재건된 난모세포를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 체세포 핵 전송 (SCNT)를 통해 epigenetic 프로그래밍이 사전 정의된 T 세포 수용체 (TCR) specificities와 마우스 모델을 생성하는 도구로 사용할 수 여기를 보여줍니다. 이러한 transnuclear 생쥐는 내생 모터의 제어하에 자신의 내생 로커스에서 해당 TCR을 표현.

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

신생아 생쥐의 중추 신경계에 치료 요원들을 소개하는 뇌 (intracerebroventricular)와 (정맥 주사) 2) 체계로 : 1)이 문서 분사의 두 가지 방법을 보여줍니다.

마우스에 Intracerebroventricular을 통해 치료 대리점 납품 (ICV)과 정맥 (IV) 사출

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

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이 연구는 기형종의 생성 없이 생체 내에서 다능성을 향한 체세포의 재프로그래밍을 보여줍니다. 우리는 Yamanka 인자를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 사용하여 성체 간세포의 생체 내 재프로그래밍을 강화된 다능성의 세포로 유도했습니다.

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

여기 우리는 새로운 장비를 사용 하지 않고 키메라 생산을 증가 하는 프로토콜을 제시. 주입에 대 한 배아의 단순한 방향 변경 생산, 배아의 수를 증가 하 고 잠재적으로 생식 전송 타임을 줄일 수 있습니다.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

본 프로토콜은 2i 및 LIF 배지를 사용한 배양 중 마우스 배아 줄기 세포의 역 다중-transfection 방법을 설명합니다. 이 방법은 기존의 forward transfection 프로토콜보다 더 높은 생존력과 효율성을 제공하는 동시에 plasmid 비율의 one-pot 최적화를 가능하게 합니다.

핵산 비율의 신속한 탐색을 위해 최적화된 마우스 배아 줄기 세포 기반 역 Poly-transfection 기술

이 프로토콜은 냉동 보존된 말 정액에서 생존 가능한 체세포(SCs)를 분리하는 간단한 미세 흡인 기법을 제시합니다. 전통적인 방법과 달리, 이 기술은 장기간 시험관 배양을 피하고 정자 오염을 극복하여 체세포 클로닝에 즉각적으로 활용할 수 있게 합니다.

클로닝을 위한 핵 기증자로서 냉동 보존된 말 정액에서 체세포를 분리하는 간단한 미세 흡기 기법

학습하세요 체세포 핵 이식을 이용한 생쥐 복제 효율 향상 방법을. 트리코스타틴 A와 비타민 C 처리가 배아 발달과 핵 재프로그래밍을 개선하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

Trichostatin A와 비타민 C의 조합 치료 체세포 핵 이식에 의해 생쥐 복제의 효율성 향상

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