Trichostatin A와 비타민 C의 조합 치료 체세포 핵 이식에 의해 생쥐 복제의 효율성 향상

이 실험의 전반적인 목표는 체세포 핵 이식을 사용하여 재건된 배아와 복제된 마우스의 생산 효율성을 향상시키는 것입니다. 이 방법은 기본 생물학, 발달 생물학 및 멸종 위기에 처한 동물 구조 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 배아 발달, 핵 프로그래밍 및 유전자 연구 보존과 같은.

이 방법 및 기술의 주요 장점은 간단한 절차로 실용적인 수준의 효율성으로 복제 된 마우스를 생성 할 수 있다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배양 배지를 준비한 후 1.2g의 BSA를 10mL의 멸균 실온수에 용해시킵니다. 약 0.12g의 혼합 이온 교환 수지 비드를 실온에서 부드럽게 저어주면서 BSA 용액에 추가합니다.

구슬의 색이 청록색에서 금색으로 변하면 피펫을 사용하여 상층액을 회수한 다음 구슬을 새 배치로 교체하십시오. 신선한 구슬의 색이 변하지 않는 것을 확인한 후 용액을 회수하십시오. 그런 다음 250 마이크로 리터의 10.5 % 중탄산 나트륨을 첨가하십시오.

0.45 미크론 필터를 사용하여 상등액을 멸균 한 다음 DBSA 원액으로 표시하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 과배란을 실시한 암컷 마우스에 대해 안락사를 수행한 후, 표준 해부 기술을 사용하여 복부를 절개하여 생식관에 접근했습니다. 작은 가위와 핀셋을 사용하여 난관을 제거하고 여과지로 옮겨 표면의 혈액을 닦아냅니다.

다음으로, 난관을 미네랄 오일에 넣은 다음 해부 바늘을 사용하여 난관의 앰플라를 절단하고 팽글러에서 나오는 적운 난모 세포 복합체를 0.1% 히알루로니다아제가 함유된 HCZB 배지 200마이크로리터 방울로 이동합니다. 조직을 보온 플레이트에서 5분 동안 배양합니다. 실체현미경을 통해 적운 세포가 적운 난모세포 복합체에서 방출되었는지 확인한 다음 일부 남아있는 적운 세포와 함께 두 번째 감수분열 또는 M2 중기 난모세포를 0.3%DBSA를 포함하는 MKSOM 배지로 전달합니다.

M2 단계 난모세포를 배지에서 위아래로 피펫팅하여 나머지 적운 세포를 분리하여 4회 세척합니다. 그런 다음 난모세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 적출될 때까지 배지에서 배양합니다. 적운 난모세포 복합체에서 탈락된 난모세포를 분리하기 위해 피펫을 사용하는 동안 실체현미경으로 적운 난모세포 복합체에서 분산된 소량의 나머지 적운 세포를 6%DBSA가 있는 HCZB 배지로 전달합니다.

체세포 핵 이식 또는 SCNT에 필요할 때까지 섭씨 37도의 온난판에 적운 세포를 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 PVP 배지 및 CB 원액을 준비한 후 CB 1밀리리터당 5마이크로그램이 포함된 20마이크로리터의 HCZB 배지가 있는 멸균 피펫을 사용하여 M2 단계 난모세포를 세척합니다. 세척을 5회 반복한 후 보온 플레이트에서 적출 용액에 난모세포를 10분 동안 배양합니다.

다음으로, 적출 챔버를 준비한 다음 피펫을 사용하여 M2 난모세포를 챔버 내로 이동합니다. 4마이크로리터의 적출 용액을 넣고 챔버를 미네랄 오일로 덮습니다. 실온에서 현미경으로 M2 단계 난모세포의 방추체와 염색체를 확인합니다.

그런 다음 홀딩 피펫과 마이크로피펫을 사용하여 방추체와 염색체의 위치가 3:00 또는 9:00 위치에 있도록 뚜렷한 첫 번째 극성체로 난모세포의 방향을 지정합니다. 파이조 펄스 강도를 3에서 6으로 설정하고 미세 조작 피펫을 사용하여 투명대에 구멍을 뚫고 구멍을 엽니다. 그런 다음 최소한의 세포질로 방추체와 염색체를 완전히 적출합니다.

가시광선 아래에서 세포질에 염색체가 없는지 확인한 다음 CB가 결핍된 0.3% DBSA를 함유한 MKSOM 배지로 적출된 난모세포를 철저히 세척합니다. 세포 융합이 이루어질 때까지 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 접시를 배양합니다. HBJE를 준비하기 위해 동결건조된 HVJ-E에 260마이크로리터의 얼음처럼 차가운 HBJE 현탁액을 첨가하고 완전히 현탁될 때까지 위아래로 피펫팅합니다.

용액의 5마이크로리터 분취액을 준비하고 세포 융합 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 세포 융합을 수행하려면 20마이크로리터의 세포 융합 완충액을 사용하여 5마이크로리터의 HVJ-E 용액을 희석합니다. 희석된 HBJE 용액을 사용할 때까지 얼음 위에 놓습니다.

본 그림과 같이 세포 융합 챔버를 준비한 후, 피펫을 사용하여 적출된 난모세포를 챔버 내의 HCZB 배지로 이동시킵니다. 그림과 같이 각 용액을 4마이크로리터씩 넣고 약 1ml의 미네랄 오일을 사용하여 챔버를 덮습니다. 적출된 난모세포가 있는 챔버를 실온에서 400x 배율로 현미경으로 놓습니다.

그런 다음 micromanipulation 피펫을 사용하여 공여자 세포를 HVJ-E 현탁액으로 옮깁니다. 적운 세포를 하나씩 흡인하여 서로 균등하게 분리하여 연속 세포 융합을 가능하게 합니다. 그런 다음 홀딩 피펫을 사용하여 적출된 난모세포를 HCZB 배지에 유지하고 미세 조작 피펫과 함께 파이조 펄스를 사용하여 투명대를 드릴링합니다.

투명대(zona pellucida)의 구멍을 뚫은 후 HVJ-E 용액의 약 5배 부피를 가진 적운 세포를 피펫으로 삽입하고 막을 거치지 않고 난모세포막으로 단단히 배출합니다. 세포 융합 조작 후 즉시 난모세포를 0.3% DBSA가 포함된 MKSOM 배지로 옮기고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터로 1시간 동안 이동합니다. 그 단계는 HCVB 배지에 적출된 난모세포를 현미경 아래에 놓고 인큐베이터로 되돌릴 때까지 10분 이내에 완료해야 합니다.

세포 융합 후 400x 배율에서 현미경으로 재구성된 난모세포의 조기 염색체 응축을 확인합니다. 재구성된 난모세포를 트리호스타틴 A 또는 TSA를 함유한 활성화 배지로 옮기고 섭씨 37도에서 공기 중 5%의 이산화탄소에서 6시간 동안 배양합니다. SENT 배아에서 전핵 형성을 관찰한 다음 0.3%TBSA가 함유된 MKSOM 배지에서 TSA 처리를 2시간 더 적용합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 비타민 C 치료를 수행하십시오. 이 표에서 볼 수 있듯이, 복제된 마우스 난모세포에 대한 TSA 및 비타민 C 처리는 매우 높은 전핵 형성률을 보였으며 모든 조건에서 두 세포 단계까지 발달했습니다. 적운 세포에서 유래하여 두 세포 단계로 발달한 일부 복제된 배아는 유사 임신한 암컷의 난관으로 이식되었습니다.

이 그림은 TSA와 비타민 C의 연속 처리에 의해 3명의 임산부로부터 생산된 72개의 이식된 배아에서 발달한 6개의 복제된 자손을 보여줍니다.마지막으로, 여기에서 입증된 바와 같이, TSA와 VC를 사용한 처리는 배반포 단계까지 체외 배아 발달의 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 절차를 시도하는 동안 필요한 모든 배지와 시약이 미리 준비되어 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 절차 자체는 따라하기 쉽고 잘 준비된 자료로 예상 결과를 얻을 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 재건된 난모세포를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.