Name: 최적화 된 에반스 블루 마우스에서 혈관 누출을 평가 하는 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 배우세요 에반스 블루 염료법을 이용한 마우스 혈관 투과성 평가 방법을. FVB NJ 마우스의 정맥 카테터 삽입과 혈장 누출 정량화 기술을 익혀 혈관 생물학 연구에 활용하세요.

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저자는 그들의 귀중 한 도움과 편집이이 원고에 대 한 앤디 Poczobutt와 박사 파주시 조리 Leszczynski 감사 하고자 합니다.  국가 심 혼, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 RO3 HL095439) 및 학과의 재향 군인의 업무 (가치 평가)에서 받은 보조금으로 지원.

관심과 동물 (쥐)의 사용에 대 한 모든 해당 국제, 국가, 또는 기관 지침이이 원고에 설명 된 실험에 따라 했다.
이 방법은 사용 FVBN 성인 쥐, 세 16-20 주,이 연구의 목적에 대 한 수를 발견. 1 일 1-5 단계를 포함 하 고 하루 2 단계 6-7 (그림 1)을 포함.
1. 장비 준비
<ol><li>(권장)으로 케 타 민/xylazine는 마 취약으로 사용 하는 경우 멸 균, 일회용 주사기와 바늘의 충분 한 공급을 보호 합니다. Isoflurane 마 취로 사용 하는 경우 산소 탱크와는 시작 하기 전에 실험에 대 한 적절 한 공급 되도록 isoflurane의 유체 레벨을 확인 하십시오. 또한, 호흡 회로 nosecone 모이고 유도 상자; 연결 호흡 회로에 새로운 목탄 용기를 연결. 산소 설정 하 고 2 단계 약 50 psi를 읽고 확인 하 여 유도 상자를 준비 합니다.</li>
	<li>37 ° c가 열 패드 설정</li>
	<li>수술에 대 한 직장 온도 프로브를 준비 합니다.</li>
</ol>2. 마우스 준비
이 단계는 마 취, 탈모, 및 위치 (성인 FVBN 쥐 나이 16-20 주)를 포함 합니다.
<ol><li>쥐의 무게 고 무게를 기록 합니다.</li>
	<li>쥐 anesthetize<ol>
<li>마 취 제와 xylazine IP 관리 (80-100 mg/kg 및 7.5-16 mg/kg, 각각). 그러나, 그것 마 취 제와 xylazine의 더 낮은 복용량으로 시작 하는 것이 좋습니다 (30mg/kg 및 6 mg/kg에 대 한 각각).</li>
		<li>약 0.1와 마 취 유지-0.25 시간 초기 수술 내내 마 취 제/xylazine의 복용량. 마 취 제와 xylazine 더 재현성 및 생존 관찰 했다이 특별 한 연구에 있는 선택의 마 취 에이전트 했다. 다른 연구에서 선택의 마 취 에이전트 다를 수 있습니다.  Isoflurane 사용 하는 경우 마우스 유도 챔버에 넣고 5 %isoflurane 마우스 지 면 완전 한 의식 때까지 설정. 다음 절차의 나머지 부분에 걸쳐 1.5-2.5 %isoflurane 설정 비 nosecone를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 2-3 분 발가락 핀치 마 취의 적절 한 깊이를 확인 하 여 쥐를 모니터링 합니다.</li>
	<li>마우스의 복 부 목 부분을 면도.</li>
	<li>따뜻한 패드에 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 발 및 테이프로 수술 표면에 마우스의 발을 보호 합니다.</li>
	<li>수술 하는 동안 밖으로 건조를 방지 하기 위해 눈에 인공 눈물 연 고를 배치 합니다.</li>
</ol>3. 수술 정보
<ol><li>경 정 맥 이상 오른쪽 복 부 목에 1 cm 절 개를 하 게.</li>
	<li>혈관 확장을 촉진 하 고 통증 관리에 대 한 절 개 면에 하나 또는 두 방울 lidocaine (1-2%)를 적용 합니다. 적용 lidocaine에 대 일 분 기다립니다.</li>
	<li>노출 하 고 무딘 절 개를 통해 바로 내부 경 정 맥 혈관을 분리. 정 맥에서 4-0 봉합과 고 부드럽게 한 hemostat로 선박의 rostral 끝을 철회. 좋은 위, 아래 또는 넥타이, 꼬리 약 3 m m를 사용 하 여 정 맥의 직경을 통해 약 절반, 구멍을 잘라.</li>
	<li>태양광 발전-1 폴 리 비닐 카 테 터 끝에서 1.5 c m을 mark 선박 확장기를 사용 하 여 구멍을 통해 경 정 맥에 삽입 하 고 선박, 약 1.5 cm의 꼬리 끝 쪽으로 카 테 터를 스레드.</li>
	<li>4-0 실크 (컷), 아래 그릇의 꼬리 부분 내에서 안전 하 게 카 테 터를 묶어. Rostral 부분의 봉합 단계 3.3에서에서 rostral 경 정 맥을 연결 하는 데 사용 했다의 느슨한 끝을 가진 카 테 터의 외부에 선박을 묶어.</li>
	<li>느슨하게 압정 피부 체온의 손실과 조직의 건조를 방지 하는 4-0 실크로 테 주위 함께 다시.</li>
	<li>테 heparinized 염 (10 U/mL)를 포함 하는 주사기를 연결 하 고 카 테 터를 플러시.</li>
</ol>4입니다. 주사
<ol><li>경 정 맥 카 테 터, 다음 라인을 플러시 heparinized 염 분의 작은 볼륨으로 에반스 블루 솔루션 (0.9% 정상, unheparinized 염 분, 또는 약 50 mg/kg에 30 mg/mL 해결책의 50 μ)을 주사.</li>
	<li>2 분 후, 물질 P (0.9% 정상, unheparinized 염 분, 또는 1 nmol/kg에서 0.3 μ M 솔루션의 100 μ), 뒤에 라인을 플러시 heparinized 염 분의 작은 볼륨을 주입. 물질 P는 내 피 레이어; 통해 플라스마 단백질의 넘쳐 흐름을 증대 시킵니다. 이 프로토콜에서 그것은 일상적으로 쉽게 플라즈마 넘쳐 흐름 값을 측정 하는 약 1.5-fold의 플라즈마 넘쳐 흐름 값의 확대를 유도 합니다.</li>
	<li>물질 P 주입 후 18 분을 기다립니다. 이 기간 동안, 에반스 블루 염료 equilibrate 하 고 순환.</li>
	<li>자 궁 경부 전위와 마우스를 희생 하 여 물질 P (에반스 블루 주사 후 20 분)의 주사 후 18 분 실험을 종료 합니다. 그것은 가능성이 그 마우스 수 직접 cervically 탈 구, 첫 주는 취의 과다 복용 하지 않고 마우스는 아마 아직도 잘 마 취 수술에서. 그러나, 그것은 필요한 경우, 마 취약 케 타 민/xylazine, isoflurane, 또는 pentobarbital 과다 주어진 수 있습니다, 뒤에 자 궁 경관 탈 구.</li>
</ol>5입니다. 장기 절연
<ol><li>오픈 마우스의 흉 고 중력-perfuse (약 51 ㎝ 또는 20"의 높이)에서 심장 및 혈관 50mm 나트륨 시트르산, 산도 3.5의 50 mL와 함께. pH 3.5 아마도 에반스 블루 바인딩 알 부 민을 유지합니다.</li>
	<li>1-5 관련 기관 (조직) (예: 방광, 신장, 위, 간, 췌 장, 근 위 또는 원심 결 장, 회장, 십이지 장, 측면 피부, 귀, 꼬리, 심장, 또는 폐) 해 메스와 excise 고 경우 잔여 내용이 제거 현재.</li>
	<li>실 온 (RT) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS; 나2HPO4, KH2PO4, 8.0 g의 0.24 g의 NaCl, 1.44 g와 0.20 g 1 L, pH 7.4에에서 KCl의)에서 장기를 씻어.</li>
	<li>오 점 조직으로 장기, 각 기관 반으로 자르고 각 절반 무게 (젖은 중량 g에서).</li>
	<li>1 개를 말리십시오 호, 48 h에 150 ° C에서 건조 오븐에서 조직의 절반.</li>
	<li>장소는 microfuge에 formamide의 일관 된 볼륨 (최대 200 µ L)에서 절반 관 48 h에 대 한 (그리고 72 h까지) 다른 조직 에반스 블루를 추출.</li>
</ol>6입니다. 조직 OD의 측정
<ol><li>폴리스 티 렌 96 잘 접시의 한 잘에 microfuge 관 및 장소에서 에반스 블루 생긴 formamide (후 48-72 h RT 외피)의 50 µ L을 제거 합니다. 수는 formamide 함께 조직 조각을 전송 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>공백에 대 한 96 잘 접시의 두 빈 우물의 각 새로운, 순수한 formamide의 장소 50 µ L.</li>
	<li>측정 하 고 흡 광도 플레이트 리더에 96 잘 접시의 각의 OD620 기록. 620 nm에서 흡 광도 에반스 블루의 최대.</li>
</ol>7입니다. 플라즈마 넘쳐 흐름의 계산
<ol><li>건조 조직 무게 절반 48 h에 대 한 오븐에 왔다.</li>
	<li>특정 기관에서 각 개별 마우스,이 직물의 젖은 무게 반 시작 (5.4에서 얻은 단계), 관심의 절반이 같은 조직의 건조 중량으로 나눈 값 (7.1에서 얻은 단계)에 대 한 젖은 무게/건조 중량 비율을 계산 합니다.</li>
	<li>그것 전에 절반 젖은 여 formamide (단계 5.4에서에서 얻은)에 배치 했다 조직의 젖은 무게를 나누어 절반 formamide는 건조 중량 (g) 조직의 계산: 건조 중량 비율 (단계 7.2에서에서 계산)의 특정 기관에 대 한.</li>
	<li>OD620 수정 값을 계산 합니다. OD620 부터 (에반스 블루 주입 formamide 단계 6.3에서에서 얻은 각 조직에서를 포함 하는) 96 잘 접시의 각 실험 우물에서 값 빼기 빈 잘 OD620 값 (평균 OD620 의 가치 준비 단계 6.2에서 순수한 formamide를 포함 하는 두 개의 우물620 값 단계 6.3에서에서 얻은 세) 각 실험 값에서.</li>
	<li>계산 플라즈마 넘쳐 흐름 값 수정된 OD620 (에서 계산된 단계 7.4) 조직의 건조 중량으로 나누어 절반 formamide (에서 계산된 단계 7.3). 플라즈마 넘쳐 흐름의 단위 OD620/g 건조 중량을 될 것입니다.</li>
	<li>데이터를 분석 하 고 평균 ± SEM. 통계 t 시험 또는 단방향 분산 분석 고 있어의 다중 비교 테스트 (lycofs01.lycoming.edu), 적절 한 그룹을 비교 하는 표현.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

위에서 설명 했 듯이, 플라즈마 넘쳐 흐름의 연구의 원인에 관한 새로운 지식 또는 억제 또는 플라즈마 넘쳐 흐름을 치료 하는 새로운 방법에 궁극적으로 이어질 수 있습니다. 현재 원고에서 플라즈마 넘쳐 흐름 프로토콜 (위)의 성공적인 사용 입증 되었습니다 에반스 파란색 염료를 사용 하 여. 표시 된 데이터를 다시 있지만 NEP는 맥 관 구조를 보호 수 있습니다 가설 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 이것은 보조 목표 현재,와 함께 기본 목표에 대 한 평균 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 최적화 된 프로토콜을 제시 되는 플라즈마 넘쳐 흐름의 미래 연구입니다. 여기 보고 프로토콜 다른 목표, 동물, 기관, 및 다른 조건, 미래 연구에 적응성에 초점을 맞추고 특히 유용 하기 때문에이 프로토콜은 사용 하 여 단순, 신뢰성, 경제적, 그리고 고려는 일반 일반적인 재료, 시 약, 및 유능한 직원의 가용성. 그러나 그것은 지적 이다,,이 프로토콜 그룹 동물 (8-12 반복 제안)의 당 반복의 공정한 금액을 요구할 것 이다 통계적으로 유효한 결과를 ...

장기에 혈관 누출 넘쳐 흐름, 참조 또는 누설의 피에서 생산 하는 격차를 통해 혈장의 장기에 모 세관 venules 게시. 이 플라즈마 넘쳐 흐름 또는 증가 혈관 침투성, 선 동적인 응답의 어떤 종류에서 발생할 수 있는 중대 한 결과 있을 수 있습니다. 따라서, 그것은이 현상, 그, 변조기, 원인과 결과, 공부 하 고, 이해는 하 고 마찬가지로, 그 수 사관 좋은 도구 고 프로토콜 들을 공부 하는. 내 피 간격 다양 한 자극을 통해 생성 될 수 있습니다 하지만 일반적으로 endothelia에 tachykinins 펩 티 드 신경 전달 물질의 작용에 의해 생산 됩니다. Undecapeptide tachykinin neuropeptide, 물질 P1증가 플라즈마 넘쳐 흐름에서 결과,이 과정의 주요 자연적 중재자 중 하나입니다.
에반스 블루 염료의 알 부 민-바인딩 속성을 사용 하 여 조사 하 고 혈관 침투성 또는 플라즈마 넘쳐 흐름, 측정 방법 개발 되었습니다, 그리고 일반적으로 그들의 정확도, 단순, 경제, 안전, 그리고 허용 하는 기능에 대 한 알려져 있다는 플라즈마 넘쳐 흐름 여러 조직에서 한 번에 결정 그렇다면 원하는2,3,,45,6,,78,9 . FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한이 에반스 블루 프로토콜, 사용 하지만 일반적으로 유용 하 고 적응력이 미래 연구를 실시 하 고 또는 평균 실험실을 포함 하는 몇 가지 중요 한 수정 추가 플라즈마 넘쳐 흐름 또는 혈관 침투성와 관련 된 요인의 중요 한 연구를 실시 합니다. 이 프로토콜에서 물질 P 1 nmol/kg, 1.5-fold에 의해 플라즈마의 넘쳐 흐름을 증대는에 쥐에 소개 된다. 이 프로토콜, 더 쉽게 관찰 하 고 얻을 수 있는 결과에 결과의 감도 증가 합니다. 침투성, 다양 한 다른 펩 티 드, 화학, 등 어떤 형태의 독성 부상에 영향을 주는 다른 요인 또는 사용 수 있습니다 원하는 대로 다른 실험실에 의해 공부. 경 정 맥 주사는 터미널 수술을 요하는 에반스 블루와 물질 P를 체계적으로, 소개 하는 것이 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 경 정 맥 주사5,7,10을 필요한 터미널 수술 기법의 고려 사항 후에는 쉽게 마스터 하 고 다른 사람 보다 더 일관 된 결과의 생산으로 이어질 꼬리를 포함 하 여 정 맥 주사, 주사4,9정 맥. 복고풍 궤도 정 맥 공동 주사에 의해 배달 될 블루 에반스에 대 한 수 있습니다, 비록 문학에서 참조가 없습니다 발견 되었습니다 에반스 블루의 납품의이 메서드를 사용 하는. 그러나, 꼬리 정 맥 주사에 대해서 높은 수준의 전문성과 reproducibly 크게이 기술을 마스터 하는 것 성공적인 에반스 블루 주사에 대 한 그것의 사용을 제한 합니다. 반면, 대체 경 정 맥 주입 방법 우리의 프로토콜에 설명 된 대로 기술적으로 얻을 수 있는 솔루션을 제공 합니다. 마우스의 혈관의 관류에 대 한 중요 한 절차 수행 직후 에반스 블루 끼얹는다 마우스의 희생 초과 에반스 파란색 염료를 제거 하 고이 프로토콜 표준화 되었습니다. 관류의 앞에서 설명한 방법은 신중 하 게 검사 하 고 되었습니다 현재 절차를 수정. 여기에 설명 된 다른 수정 모두 최적화 하 고, 간단 하 고 저렴 한 있습니다.
에반스 블루 염색 방법의 몇 가지 중요 한 제한이 있습니다. 예를 들어 낮은 감도 가끔이 방법으로 관련 된 몇 가지 추가 총 병 리 학적 및 조직학 검사 조직의 에반스 블루 주입 동물에서 방지할 수 있습니다. 그러나,이 및 다른 제한은 그럼에도 불구 하 고, 여전히 에반스 블루를 사용 하는 모델과 다른 방법의 개발에 이르렀다. 에반스 블루의 측정 형광 (여 보다 시각 범위) 분광학 방법의 감도 증가 시킬 수 있습니다. 또한, 형광 현미경 검사 법 에반스 블루 스테인드 직물의 더 뚜렷한 위치11혈관 누출의 관찰에 대 한 허용 하도록 개발 되었다. 또한, 전체-바디 이미징 및 살아있는 동물의 스캔 이전 에반스 블루12 연속 방식에서 에반스 블루 농도의 조사에 대 한 수와 함께 주입 보다는 실험의 시간을 선택 하는 한 특정 시점. 그러나,이 메서드는 적절 한 영상 시설의 가용성을 필요로 하며 매우 비쌀 수 있습니다. 수정 에반스 블루와 수행 모델의 생체 외에서 종류에 관련 된와 같은 셀에 문화 또는 병아리 chorioallantoic 모델13 (CAM)는 또한 설명. 이러한 모델14 intravital 현미경 검사 법, 형광에 의해 모니터링 됩니다 시간이 지남에, 혈관 침투성 변화의 정량화를 허용 하지만 비보에 조건의 정확한 모델링에 관한 질문을 올릴 수 있고 수도 있습니다. 비싼.
에반스 블루의 관리를 포함 하지 않는 다른 방법을 결정 하 고 계량 혈관 누출 또는 침투성, 개발 되었습니다. 이러한 메서드 (예: 알 부 민 또는 fluorescein), 적절 한 형광 분자 또는 isotopically 레이블 또는 기타 태그 분자, 동물을 살 수를 고용할 수 있습니다 (또는 세포 문화 또는 chorioallantoic (캠)을 모델13, 비-침략 적 이어서 (애완 동물 스캐닝, MRI, intravital 현미경 검사 법, 전신 스캔) 이미징 또는 침략 이미징 (형광 현미경 검사 법)3,,1215. 이러한 기술을 다양 한 장점이 다른 에반스 블루 방법을 제공할 수 있습니다, 하지만 그들은 또한 그들의 상당한 복잡성, 필요한 전문 지식, 자원, 및 높은 금융 비용 포함 될 수 있습니다 있는 불리 있다.
Neprilysin16 (peptidase 효소 NEP, 또한 CD10, MME, 또는 Enkephalinase) 효소 대사와 내 인 성 물질 피의 비활성화를 통해 부분에서 플라즈마 넘쳐 흐름, 적어도 억제에 참여 제안 되었습니다. 따라서, 조직 세포 표면 peptidase NEP 발생 하는, 있을 수 있습니다 아마도 묻힐 peptidase 활동으로 물질 p, 효과의 감쇠
처음에, 우리는 FVBN 야생 타입 (WT)와 NEP 녹아웃 (KO) 마우스 수정된이 에반스 블루 프로토콜을 이용 하 여 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 테스트. 물질 P 증강 플라즈마 넘쳐 흐름에 NEP 참여 이러한 초기 연구에서 의심 되었다 우리는 이것을 설명 하 고 추가 플라즈마 넘쳐 흐름에 관련 된 NEP의 역할 실험. 그러나,이 원고는 하지 NEP 또는 그것의 역할에서 플라즈마 넘쳐 흐름, 오히려 플라즈마 넘쳐 흐름 스스로 실험. NEP 결과이 수정된 프로토콜의 사용을 통해 얻을 수 있는 결과의 종류를 대표 합니다. 플라즈마 넘쳐 흐름을 측정 하는 에반스 블루 메서드 최적화 되었고 수정, FVBN 마우스 아래 자세히 설명 된 대로.

<table><tbody><tr><td>이소플루란</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>흡입 마취</td></tr>제 <tr><td>케타민</td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>주사 가능한 마취</td></tr>제 <tr><td>자일라진</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>주사 가능한 마취</td></tr><tr><td>주사기(10,3 & 1cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657, 309659</td><td></td></tr><tr><td>바늘(20G1,23G1 & 26G1/2)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane 유도 챔버</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td>1</td></tr>리터 <tr><td>노즈콘 호흡 회로&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>설치류 회로 컨트롤러 2</td></tr><tr><td>산소 탱크</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100% 의료용</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>CWE Inc.</td><td>TC-1000</td><td>온도 컨트롤러</td></tr><tr><td>직장 온도 프로브</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td><td>마우스</td></tr><tr><td>밸런스 (설치류용)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>수술 도구-가위</td><td>Fine Science 도구</td><td>15000-00</td><td>Vannas 스프링 가위 3mm 직선 칼날 (절단 용기)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>수술 도구-겸자</td><td>Fine Science 도구</td><td>11151-10</td><td>Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)</td></tr><tr><td>수술 도구-지혈</td> Fine <td>Science tools</td><td>13009-12</td><td>Halstead-mosquito 지혈 (둔기 절개, 조직 유지)</td></tr><tr><td>수술 도구 -봉합사 드라이버</td><td>Fine Science 도구</td><td>12502-12</td><td>Olsen-Hegar 봉합사 드라이버 (봉합)</td></tr><tr><td>수술 도구-겸자</td><td>Fine 과학 도구</td><td>11627-12</td><td>Adson-Brown 악어 겸자 (조직 파악, 봉합, 쥐)</td></tr><tr><td>수술 도구 - 가위</td><td>Fine Science 도구</td><td>14110-15</td><td>Mayo 터프 컷 가위 15cm (수술, 해부, 뼈, 쥐)</td></tr><tr><td>수술 도구 - 집게</td><td>Fine Science 도구</td><td>18025-10</td><td>봉합 묶는 집게 (Millar cath에 사용)</td></tr><tr><td>수술 도구 - 가위</td><td>Fine Science 도구</td><td>14078-10</td><td>Lexer Baby 가위 스트레이트 (수술, 마우스)</td></tr> <tr><td>수술 도구 - 집게</td><td>Fine Science 도구</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 미세 팁 집게 (쥐 혈관, 해부)</td></tr> <tr><td>수술 도구 - 가위</td><td>Fine Science 도구</td><td>14082-09</td><td>해부 가위 12mm (수술, 쥐 마우스)</td></tr><tr><td>수술 도구 - 집게</td><td>Fine Science 도구</td><td>11051-10</td><td>10cm Graefe 집게 (조직 잡기, 쥐 쥐)</td></tr><tr><td>수술 도구-겸자</td><td>Fine Science 도구</td><td>11251-35</td><td>Dumont 5/45 겸자(혈관용 도입기)</td></tr><tr><td>수술 도구-견인기</td><td>Fine Science 도구</td><td>17012-11</td><td>Weitlaner 견인기 2/3 치아(쥐 수술)</td></tr><tr><td>수술 도구-집게</td><td>Fine Science 도구</td><td>11294-00</td><td>Dumont #4 집게(혈관 격리 쥐, 생쥐)</td></tr><tr><td>수술 도구-집게</td><td>Fine 과학 도구</td><td>11297-00</td><td>Dumont # 7 집게 (조직 잡기, 해부)</td></tr><tr><td>수술 도구 - 가위</td><td>Fine Science 도구</td><td>14058-11</td><td>터프 컷 홍채 가위 (마우스 해부, 뼈)</td></tr><tr><td>수술 도구 - 집게</td><td>Fine Science 도구</td><td>11009-13</td><td>톱니 모양, 곡선 Semken 집게 (조직 잡기, 쥐 쥐)</td></tr><tr><td>수술 도구 - 지혈</td><td>Fine Science 도구</td><td>13003-10</td><td>Hartman 곡선 지혈 (무딘 절개, 조직 유지)</td></tr> <tr><td>수술 도구 - 집게</td><td>Fine Science 도구</td><td>11006-12</td><td>Adson 톱니 겸자 (조직 잡기)</td></tr> <tr><td>클리퍼</td><td>Oster</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td>테이프</td><td>Fisherbrand</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>인공 눈물 연고</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>lidocaine</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td>2% 주사 가능한</td></tr><tr><td>폴리비닐 카테터</td><td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans 블루</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Substance P</td><td>Bachem&nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>Sagent 제약</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>식염수</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0.9% 염화나트륨</td></tr><tr><td>페노바르비탈&nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>시트르산 나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P4417-50TAB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>블로팅용 Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>마이크로밸런스</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>마이크로퓨지 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 96 웰 플레이트</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr>흡<tr><td>광도 플레이트 독자</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>폴리아크릴아미드 젤</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분자량 표준</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran 지지 니트로셀룰로오스</td><td>Amersham(GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>젤 상자</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>일차 NEP 다클론 항체&nbsp;</td><td>R & D 시스템</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린 차우</td><td>테클라드 (HARLAN)</td><td>TD.130750&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FVB/NJ 야생형 마우스</td><td>Jackson</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체(염소 항토끼)</td><td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>ECL 솔루션-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>필름</td><td>피어스</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

최적화 된 에반스 블루 마우스에서 혈관 누출을 평가 하는 프로토콜

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

혈관 누출 또는 플라즈마 넘쳐 흐름, 원인, 수 있으며 심각한 결과 또는 염증 반응의 증상이 있을 수 있습니다. 이 연구의 원인에 관한 새로운 지식 또는 억제 또는 플라즈마 넘쳐 흐름을 치료 하는 새로운 방법을 궁극적으로 발생할 수 있습니다. 연구원은 가장 좋은 방법 플라즈마 넘쳐 흐름을 공부에 대 한 사용할 수를 포함 하 여 적절 한 도구는 중요 하다. 이 문서에서 우리는 FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한 에반스 블루 염색 방법을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 의도적으로 간단를 훌륭한 가능한 정도 하지만 제공 한다 고품질 데이터. 주로 하기 때문에 그것은 쉽게 사용 하 여 평균 실험실 에반스 블루 염료 선정 되었습니다. 우리 효소 neprilysin 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 맥 관 구조를 보호 수 있습니다 가설에 대 한 증거와 지원을 제공 하기 위해이 프로토콜을 이용 했다. 그러나이 프로토콜을 실험적으로 사용 하 고 쉽게 이해, 예방, 또는 치료에서 중요 한 다른 요소를 포함할 수 있습니다 연구에 대 한 쥐의 다른 긴장에 또는 다른 종에서 많은 다른 장기 또는 조직에서 사용 하기 위해 적응 수 있습니다, 플라즈마 넘쳐 흐름입니다. 이 프로토콜은 광범위 하 게 최적화 및 사용, 경제, 및 재료와 장비,이 프로토콜에 사용 하 여 평균 실험실에 대 한 우수한 만들기의 일반적인 가용성의 용이성 기존 프로토콜과 결합 안정성에서 수정 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름 측정

그림 1, 절차의 회로도 표시는 가장 안정적이 고 일관성 있는 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름 값 FVBN 쥐의 장기에서 발견 되었습니다. 이 절차는 일반적으로 작업, 대기 시간의 적어도 48 h 구분의 2 일 걸립니다. 비교할 모든 실험에 일관 되 게 이렇게 훨씬 더, 밖으로 확산 가능 하다. 예를 들어 장기 주 1 격리 후 장기 수 플래시 액체 질소에서 냉동 고-80 ° C에 저장 (1 주에 몇 일) 이내 장기를 신중 하 게 녹고, 따라 그들은 PBS로 세척 고 프로토콜의 나머지 전에 얼룩이. 또한, 비록 조직의 건조 할 수 명시 (150 ° C에서 48 h에 대 한), 조직의 블루 에반스의 추출 절반 formamide 확장할 수 있습니다에서 48-72, formamide에서 시간은 모든 실험에 대 한 일관 된.
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이 문서에는 다른 긴장, 종, 그리고 다른 장기 나 조직에 사용 하기 위해 적용할 수 있는 FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한 에반스 블루 염료 메서드를 사용 하 여, 최적화 된, 경제적이 고 간단한 프로토콜 설명 합니다.

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 변형된 Evans Blue Dye 방법을 사용하여 마우스 또는 기타 작은 동물 종의 장기에서 혈장 이탈 또는 누출을 평가하고 상대적으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 다음과 같은 혈관 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 어떤 내인성 또는 외인성 요인이 특정 종 또는 관심 기관에서 혈장 유출을 수정합니까? 이 기술의 주요 장점은 카테터 삽입에는 적당한 수준의 수술 능력이 필요하지만 이 방법은 지속적인 정맥 접근을 제공하고 마우스에서 마우스로 재현할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 카테터 삽입의 적당한 수술적 어려움으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 16주에서 20주 된 성인 FVB NJ 마우스의 체중을 측정한 후 동물의 발가락 꼬집기에 대한 반응 부족을 확인하고 배쪽 목 부위를 면도합니다. 예열된 패드에 누운 자세로 마우스를 놓고 네 발을 모두 수술 표면에 테이프로 붙입니다.건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 연고를 바르십시오. 경정맥 위의 오른쪽 복부 목을 1cm 절개합니다. 통증 관리와 혈관 확장을 위해 절개 부위에 1-2% 리도카인을 한두 방울 떨어뜨립니다.둔기 박리를 통해 올바른 내부 경정맥을 분리합니다. 4-0 봉합사로 정맥을 묶고 지혈제를 사용하여 혈관의 상부 끝을 부드럽게 후퇴시킵니다. 가는 가위를 사용하여 봉합사에서 꼬리 방향으로 약 3mm, 정맥 직경의 약 절반 정도에 구멍을 뚫습니다.다음으로, PV1 폴리비닐 카테터를 구멍을 통해 경정맥에 삽입하고 혈관의 꼬리 끝을 향해 약 1.5cm 떨어진 곳에 카테터를 끼웁니다. 새로운 4-0 봉합사를 사용하여 혈관의 꼬리 부분 내에 카테터를 단단히 묶고 혈관의 상부 부분을 원래 상부 경정맥을 묶는 데 사용된 봉합사의 느슨한 끝으로 카테터 바깥쪽에 묶습니다. 탈수, 체온 손실 및 조직 건조를 방지하기 위해 다른 4-0 봉합사로 카테터 주위의 피부를 느슨하게 다시 고정합니다.그런 다음 카테터를 헤파린 식염수가 함유된 주사기에 연결하고 식염수로 카테터를 플러시합니다. 관심 기관으로부터의 유출 및 누출을 평가하려면 먼저 50마이크로리터의 Evans Blue 용액을 경정맥 카테터에 주입한 다음 소량의 헤파린 식염수를 주입하여 라인을 세척합니다. 2분 후, 100마이크로리터의 Substance P를 카테터에 주입한 다음 헤파린 식염수를 두 번째 플러시합니다.물질 P 주사 후 18분 후 동물의 흉강을 열고 50밀리리터의 구연산나트륨 용액으로 심장과 혈관을 중력 관류하여 혈관 내에서 여분의 에반스 블루를 제거합니다. 관심 있는 장기와 조직을 적출하고 필요에 따라 각 조직의 잔여 내용물을 제거합니다. 실온 PBS에서 장기를 헹구고 실험실 물티슈로 장기를 닦아내고 각 장기를 반으로 자릅니다.저울에 각 장기의 젖은 무게를 절반으로 구하고 각 장기의 1/2을 섭씨 150도의 건조 오븐에서 호일 조각으로 48시간 동안 건조합니다. 그런 다음 Evans Blue Dye 추출을 위해 48-72시간 동안 마이크로분리 튜브에 최대 200마이크로리터의 포름아미드에 각 장기의 나머지 절반을 놓습니다. Neprilysin 녹아웃 마우스는 야생형 동물에 비해 방광에서 Substance P-유도 혈장 유출이 증가한 것으로 나타나 방광에서 Substance P-유도 혈장 유출의 음성 조절에서 Neprilysin의 역할을 시사합니다.Neprilysin의 과발현을 활성화하기 위해 일주일 동안 Neprilysin의 과발현을 위한 형질전환 마우스의 Doxycycline 처리는 독시사이클린 처리된 형질전환 동물이 야생형 또는 녹아웃 동물의 독시사이클린 처리 후 관찰되지 않는 세 그룹의 동물 모두에 비해 십이지장에서 현저히 감소된 물질 P 유도 혈장 유출을 나타내기 때문에 십이지장 외피에서 이 효소의 추가 역할을 나타냅니다. 일단 숙달되면 카테터 삽입, 주사 및 장기 분리 단계를 적절하게 수행하면 45-55분 안에 완료할 수 있습니다. 프로토콜의 나머지 부분에 대해 추가로 2-3일을 허용합니다.이 기술을 처음 배울 때는 실험을 수행하기 전에 최소 10-20마리의 연습 동물에게 이 절차를 반복하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 변형된 Evans Blue Dye 방법을 사용하여 생쥐 또는 기타 작은 동물 종의 장기에서 혈장 이탈 또는 누출을 평가하고 상대적으로 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 마우스 모델에서 옴마야 매개 뇌실 내 주사를 보여줍니다. 이 방법은 잠재적인 약물 후보의 국소 전달을 가능하게 하고 혈액-뇌 장벽을 회피합니다.

쥐의 Intracerebroventricular Injection: 마우스 뇌의 뇌실에 약물을 전달하기 위한 Ommaya 매개 직접 약물 투여 방법

<em&gt; 생체 내</em혈관 투과율을 테스트하려면&gt; 분석

비만 세포와 호염기구의 활성화를 특징으로 알레르기 반응은, IgE 항체의 가교 및 염증 매개 물질의 방출에 의해 구동된다. 알레르기 반응의 정량적 인 평가는 알레르겐 공격 후 혈관 투과성의 변화를 모니터하는 에반스 블루 염료를 사용함으로써 달성 될 수있다.

마우스에 현지 아나필락시스 측정

망막 질환의 동물 모델에서 혈액-망막 장벽 투과성과 내부 제한 막 무결성을 조사하기 위해 여러 아데노 관련 바이러스(AAV) 변종을 망막 뉴런과 신경교세포를 라벨링하는 도구로 사용했습니다. 그런 다음 바이러스 매개 리포터 유전자 발현을 망막 장벽 투과성의 지표로 사용합니다.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

이 프로토콜은 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈 - 재관류 (IR) 모델의 유도를 설명합니다. 맞춤 제작 된 생체 내에 이미징 모델을 사용하여, 우리는 생체 내 염증 반응 후 재관류에서 공부합니다. 이러한 기술의 발달 배후의 이론적 근거는 백혈구 IR 피부 손상에 반응하는 방법에 대한 이해를 확장하는 것이다.

면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상

이 절차의 전반적인 목표는 비보에 허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 평가 대 한 높은 재현 기법을 제공 하는입니다.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

여기, 선물이 murine 피부에 침투성 홍보 요원의 피부 관리에 의해 유도 된 혈관 누설을 측정 하는 프로토콜. 이 기술은 홍보 또는 혈관 누설을 억제 하거나 혈관 침투성을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 분자의 능력을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

이 프로토콜은 설치류 뇌 샘플의 동일한 세트에서 허혈성 뇌 손상의 세 가지 가장 중요한 매개 변수를 측정하는 새로운 기술을 설명합니다. 하나의 뇌 샘플만 사용하는 것은 윤리적 및 경제적 비용 면에서 매우 유리합니다.

설치류 뇌 샘플의 단일 세트에서 뇌졸중 후 뇌 부종, 경색 영역 및 혈액 뇌 장벽 고장 측정

여기에서는 장미 벵골을 사용한 망막 정맥 폐색에 최적화된 프로토콜과 유전자 변형 균주에서 재현성을 극대화하기 위한 권장 사항과 함께 레이저 유도 망막 영상 현미경 시스템에 대해 설명합니다.

가변성을 제한하기 위한 망막 정맥 폐색 마우스 모델의 최적화

저산소 조건(자간전증의 한 측면 모델링)에서 배양된 태반 외식에서 분리된 소형 EV(sEV)가 임신하지 않은 성인 암컷 마우스의 혈액-뇌 장벽을 파괴하는지 여부를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

저산소성 인간 태반의 작은 세포외 소포에 의한 생쥐 혈액-뇌 장벽의 파괴

서로 다른 시점의 마우스에 두 개의 형광 염료를 투여하여 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인한 염료 유출을 시각화하는 방법이 개발되었습니다. 동결 보호제로서 글리세롤을 사용함으로써 동일한 샘플에 대한 면역조직화학이 촉진되었습니다.

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

배우세요 에반스 블루 염료법을 이용한 마우스 혈관 투과성 평가 방법을. FVB NJ 마우스의 정맥 카테터 삽입과 혈장 누출 정량화 기술을 익혀 혈관 생물학 연구에 활용하세요.

최적화 된 에반스 블루 마우스에서 혈관 누출을 평가 하는 프로토콜

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