Name: 냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학을 위한 자기 나노입자 바이러스 벡터 전착법을. 냉동 절편 제작과 저세포독성 고효율 유전자 전달 기술로 장 질환 연구 및 치료 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), 미국 폐 협회, 알레게니 건강 네트워크의 보조금에 의해 지원되었다 홉킨스 연구 기금과 홉킨스 소화기 질환 기초 연구 핵심 센터.

이 프로토콜은 존스 홉킨스 의료 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시된 방법10,11,12,13에서수정됩니다.
1. 시약의 준비
<ol><li>신선한 293T 배지를 몇 시간 전에 준비하고 사용 하기 전에 적어도 10 분동안 수조에서 37 °C로 따뜻하게 준비하십시오 (표 1).</li>
	<li>바이러스 성 포장을 위한 플라스미드 DNA2,13,14를 준비한다. (표2).</li>
	<li>기타 필요한 모든 재료(재료표)를획득합니다.</li>
</ol>2. 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 입자 생산
<ol><li>인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포 시종 (1일차)
	<ol>
<li>실온(RT)에서 1시간 동안 인산완충 식염수(PBS; 10 mL/접시)에 용해된 50 μg/mL 폴리-D-리신을 코팅하여 150mm 배양 접시 를 준비합니다.</li>
		<li>인산완식염수(PBS)/폴리-D-리신을 제거하고 코팅된 접시를 5 mL PBS로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>종자 293T 셀(8\u201210x 10 6)에서 293T 배지(표 1)에서 총 부피 15 mL.</li>
		<li>배양 293T 세포는 표준 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 하룻밤 동안.</li>
	</ol></li>
	<li>HEK 293T 세포 형질감염 (2일차)
	<ol>
<li>세포가 70-80 % 합류에 도달하면 형질 감염을 수행하십시오 (일반적으로 8 \u201210 x 106 세포를 시드 한 후 약 24 시간).</li>
		<li>상업적인 양이온 리포솜 제형(표1\u20122,재료표)과 같은 효율적인 접근법을 사용하여 형질전환 혼합물을 제조한다2.<ol>
<li>렌티바이러스 DNA는 12개(총 ~24 μg 플라스미드 DNA, 표2)를 형질전환 배지의 1.2 mL에 생성하고 RT에서 5분 동안 배양하여 1.5 mL 튜브(물자 표)를 생성한다.</li>
			<li>1.2 mL의 형질전환 섭정(36 μL)을 트랜스펙션 배지(재료 표)에 희석하고 제조업체의 지침에 따라 5mL 튜브로 배양합니다.</li>
			<li>렌티바이러스 시약(2.2.2.1단계)을 형질감염 시약(단계 2.2.2.2)에 넣고 5 mL 파이펫을 사용하여 천천히 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.</li>
			<li>RT에서 20 분 동안 혼합물을 배양합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>293T 세포를 5 mL의 형질전환 배지로 부드럽게 세척하고 10 mL의 형질전환 매체로 교체하십시오.</li>
		<li>DNA 지질 복합체(단계 2.2.2.3)를 293T 세포의 배지에 떨어뜨리고 각 접시에 DNA 지질 복합체의 균등한 분포를 보장하기 위해 수평 및 수직 방향으로 이동하여 배양 접시의 매체를 조심스럽게 혼합합니다.</li>
		<li>표준 조직 배양 인큐베이터에서 6시간 동안 배양(37°C, 5% CO2).</li>
		<li>배양 후, 배지를 20 mL 의 신선한바이러스 수집 매체로 교체한다(표 1).</li>
	</ol></li>
	<li>바이러스 수집(일 3\u20125)
	<ol>
<li>50 mL 튜브에 바이러스 매체를 수집하고, 추가 농도를 위해 4°C 냉장고에 보관하십시오.</li>
		<li>신선한 바이러스 수집 매체의 20 mL를 24 시간마다 교체하고 밤새 배양 (~ 24 h). 다음 2일 동안 미디어 컬렉션을 반복합니다(일 4\u20125).</li>
		<li>5일 이후 수집된 배지의 총 부피가 ~ 60 mL(20 mL/day x 3일)인지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>바이러스 농도 (5일차)
	<ol>
<li>수집된 매체(60 mL)를 400 x g에서 5분 동안 원심분리한다. 이어서, 상급자를 필터(0.45 μm 기공)를 통과하여 세포 이물질을 제거한다.</li>
	</ol></li>
	<li>원심 필터 유닛에 여과된 바이러스 매체 15 mL을 추가하여 바이러스를 집중시켰다(재료 표). 2,500 x g에서 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리기. 바이러스는이 필터를 통과 할 수 없기 때문에, 그것은 필터의 상부 챔버에 집중될 것이다.
	<ol>
<li>튜브(bottom chamber)로부터 유동을 흡기하고 동일한 원심 필터 유닛에 잔류 바이러스 수집 매체상수의 또 다른 15 mL을 추가한다. 위와 같이 원심분리기(4°C에서 15분 동안 2,500 x g)를 초상으로부터 추가의 바이러스를 농축한다.</li>
		<li>원하는 농도에 도달할 때까지 단일 트랜스듀싱 플레이트에서 60 mL 용지에 대해 동일한 필터를 사용하여 과정을 반복합니다(~100배). 참고: 우리는 일반적으로 ~600 μL에 바이러스 수집 매체의 ~60 mL농축.</li>
		<li>1 mL 파이펫을 사용하여 필터의 상부 챔버에서 농축 된 바이러스를 제거한 다음 나중에 사용하기 위해 -80 °C에서 1.5 mL 튜브 (50\u201260 μL / 튜브)에 aliquot 및 보관하십시오. 농축 입자를 최대 6\u201212개월 동안 저장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 토굴 격리
<ol><li>현지 IACUC 지침에 따라 CO2를 사용하여 마우스를 안락사시한다.</li>
	<li>안락사 된 동물을 등에 놓고 70 % 에탄올로 살포하여 복부를 씻으하십시오.</li>
	<li>흉골에서 사타구니까지 세로 중간선 절개를 수행하고 먼저 피부를 절개한 다음 피하 조직을 절개합니다.</li>
	<li>장에서 장내를 제거하십시오.</li>
	<li>소장 내에서 관심 영역을 식별; 지하실은 십이지장, 제주넘 및 ileum에서 분리될 수 있습니다.</li>
	<li>10 mL 주사기를 사용하여, 10cm 조직 배양 접시에 토굴 해리 완충액 (1 mM dithiothreitol (DTT),1% 페니실린 /연쇄상 구균 (No Ca2+ 및 Mg2 +)를 포함하는 미리 냉각 된 PBS)로 분리 된 소장을 플러시 (표) 1)</li>
	<li>말초 지방 조직을 제거하고 멸균 유리 판 (15cm x 15cm)에 장 조직을 세로로 열거나 "모깎기"하십시오.</li>
	<li>세포 스크레이퍼를 사용하여 장 상피 융모를 부드럽게 긁어 냅니다.</li>
	<li>소장을 2\u20123 cm 길이로 자릅니다.</li>
	<li>편평한 집게(116 mm)를 사용하여 미리 냉각된 PBS를 함유하는 15 mL 튜브로 조직을 옮니다. ~30s (반대 방향으로 튜브를 이동 ~60 시간)에 대 한 손으로 힘차게 흔들어 조직 조각을 씻어.</li>
	<li>PBS를 새로 고치고 PBS가 명확해질 때까지 다시 씻습니다. 참고: 일반적으로 조각 2\u20123 번 세척합니다.</li>
	<li>10 mL의 토굴 해리 완충제(표 1)를 함유하는 15 mL 원엽 튜브에서 조직을 중간 속도로 궤도 셰이커상에서 4°C에서 10분 동안 배양한다.</li>
	<li>튜브를 ~30s (반대 방향 에서 60 번 반대 방향)로 힘차게 흔들고 평평한 집게를 사용하여 10 mL의 토굴 해리 버퍼를 포함하는 다른 15 mL 원추형 튜브로 조직을 옮니다. 얼음에 이 분수를 배양하십시오. 그것은 주로 융모를 포함하기 때문에 오르가노이드 문화에 대한 첫 번째 분획을 사용하지 마십시오.</li>
	<li>3.11\u20123.13단계를 3\u20124번 반복하여 각 분수를 수집하고 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>반전된 현미경(4x)에서 각 분획에서 200 μL 샘플을 스캔하여 장 내 토굴의 가장 높은 비율로 농축된 분획을 선택합니다. 앞서 설명한 바와 같이 전형적인 형태에 의한 토굴을 식별한다 (그림1A)10. 참고: 그(것)들은 모양에 있는 둥근 타원형 표시하고 과립된 창 세포를 포함할 것입니다. 대조적으로, 융모는 과립판 세포가 결여된손가락형 구조이다(도 1B).</li>
	<li>필요한 경우 유사한 크기의 토굴을 얻기 위해 40 μm 셀 스트레이너를 통해 선택한 분획을 전달합니다. 대안적으로, 마우스가 EGFP-Lgr5+ 배경 또는 Lgr5+ 세포의 식별을 가능하게 하는 다른 적합한 모델에 교차되는 경우 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한유세포측정을 기반으로 Lgr5+ 줄기 세포를 분리한다 2.</li>
	<li>선택한 분수의 총 토굴 수를 다음과 같이 계산합니다.
	<ol>
<li>선택된 분획의 피펫 50 μL을 혈세포계로 넣고 반전된 광 현미경(4x)을 사용하여 토굴의 수를 계산한다. 48웰 플레이트를 사용할 때 3\u20126 웰이 유전자 침묵 또는 과발현을 위해 실험 조건당 변환되는 트랜스덕트 실험을 허용하기 위해 웰당 ~100개의 토굴을 배치한다.</li>
		<li>50 μL당 토굴 수를 기준으로 필요한 토굴 해리 버퍼의 부피를 계산하고 해당 볼륨을 1.5mL 튜브로 전송합니다. 참고: 예를 들어, 50 μL당 10개의 토굴이 계산되고, 300개의 토굴에 6 x 50 μL 또는 300 μL이 필요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1.5 mL 튜브의 토굴을 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>상층을 조심스럽게 버피팅하여 상류층을 제거하고 100 μL의 성장 인자에 펠렛을 다시 일시 중단시켜얼음에 지하 막 매트릭스를 감소시켰다(재료 표).</li>
	<li>매트릭스 함유 토굴을 37°C 미리 데운 48웰 플레이트(30 μL/well, ~100 토굴/웰)로 시드한다. 매트릭스 겔화를 허용하기 위해 5\u201215 분 동안 표준 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를배양 (37 °C, 5 % CO2).</li>
	<li>각 겔을 250 μL 오르가노이드 배양(ENR) 배지(표 1)로 중첩시키고 48웰 플레이트를 표준 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 다시 놓습니다. 24 시간 후 작은, 둥근, 낭포 모양으로 토굴 조직에 대한 문화를 확인; 싹은 2 \u20125 일 후에 형성됩니다.</li>
	<li>3일마다 ENR 미디어를 부드럽게 교체하십시오. 부드러운 흡입으로 오래된 ENR 용지를 제거하고 미디어를 교체할 때 매트릭스를 만지지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>통로 오르가노이드 배양은 앞서 설명한 바와 같이 4\u20127 일마다11.</li>
</ol>4. 오르가노이드 조각 준비
<ol><li>일단 형성되면 (1\u20122 주 이내) 또는 통과 된 후에 오르가노이드를 변환합니다. 단일 트랜스덕션 실험의 경우, 실험적 트랜스덕션 조건당 ~100\u2012200 오르가노이드/웰 또는 ~200\u2012600 오르간을 가진 조건당 48웰 플레이트에 배양된 오르가노이드 2\u20123 웰을 준비합니다.</li>
	<li>ENR을 250 μL 형질전환배지(표 1)로 교환하고 3일 이상 또는 오르노이드가 낭포성 형태를 채택할 때까지 형질전환 배지에서 배양한다. Wnt3a 및 ROCK 억제제(Y27632)를 형질전환 배지에 모두 포함하여 줄기 및 파네스 세포의 수를 증가시키고; 니코틴아미드(Nic)는 배양 효율을 향상시킨다(표 1의 형질전환 배지 참조).</li>
	<li>1mL 파이펫을 사용하여 매질과 파이펫 팁으로 돔과 같은 지하 멤브레인 매트릭스 구조를 기계적으로 파열시킵니다.</li>
	<li>오르가노이드와 매더를 멸균 된 1.5 mL 튜브로 옮김.</li>
	<li>기계적으로 200 μL 파이펫 ~ 10 \u201215 번 파이펫팅하여 매트릭스를 더 방해합니다.</li>
	<li>500 x g에서 500 x g에서 5 분 동안 오르가노이드 조각을 원심 분리합니다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 상급자를 조심스럽게 버리고 펠릿을 1 mL DMEM/F12배지(표 1)에 다시 놓습니다.</li>
	<li>디스파제 I(10 mg/mL에서 6 μL)과 DNase I(10 mg/mL에서 2.5 μL)을 추가합니다. 1 mL 파이펫을 사용하여 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞습니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에서 20 분 동안 37 °C에서 오르가노이드를 배양합니다.</li>
	<li>ENR 매체의 500 μL을 첨가하여 해리 반응을 종료하는; ENR의 혈청은 반응을 종료합니다.</li>
	<li>20 μm 세포 스트레이너를 통해 오르가노이드 세포를 통과시키고 5 분 동안 400 x g에서 오르가노이드 단편을 원심 분리합니다.</li>
	<li>150 μL 형질전환 배지로 오르가노이드단편을 재중단한다(표 1).</li>
</ol>5. 바이러스 성 전적에 의한 오르가노이드 또는 토굴 세포의 유전 공학
참고: 그림2를 참조하십시오.
<ol><li>종자 오르가노이드 세포 클러스터를 200 μL 형질전환 배지/웰을 48웰 플레이트에 및 표준 조직 배양 인큐베이터에서 배양한다(37°C, 5% CO2). 대안적으로, 신선하게 단리된 토굴 세포(~1,000개의 토굴)를 200 μL 트랜스덕션 배지/웰에 48웰 플레이트에 놓고 표준 조직 배양인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 배양한다.</li>
	<li>48웰 플레이트에서 각 웰의 트랜스덕션을 위한 농축 바이러스의 ~50 μL을 허용하는 트랜스덕션용 바이러스의 해동 또는 24웰 플레이트에서 웰당 농축 바이러스의 ~100 μL.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에서 RT에서 15 분 동안 12 μL의 자기나노 입자 용액으로 바이러스를 인큐베이트 (표 3).</li>
	<li>변환할 셀에 자기 나노입자 용액/바이러스 혼합물을 추가합니다.</li>
	<li>세포 배양판을 자기 판 상에 놓고 표준 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 적어도 2시간(및 최대 ~6시간)동안 배양한다.</li>
</ol>6. 감염된 오르가노이드 조각의 시딩
<ol><li>감염된 오르가노이드 세포 클러스터 및 형질전환 매체를 각각의 우물에서 1.5 mL 튜브로 옮김을 전달한다.</li>
	<li>500 x g의 원심분리기5분.</li>
	<li>부드러운 흡입으로 상류물질을 버리고 얼음에 펠릿이 들어있는 튜브를 5 분 동안 식힙니다.</li>
	<li>지하 멤브레인 매트릭스 120 μL을 추가하고 천천히 위아래로 파이펫팅하여 펠릿을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>매트릭스 세포 혼합물의 종자 30 μL 방울을 새로운 48 웰 플레이트내로 하였다.</li>
	<li>매트릭스가 고화될 때까지 플레이트를 5\u201215 분 동안 37 °C에서 배양합니다.</li>
	<li>각 웰에 트랜스덕션 배지를 첨가하고 3\u20124 일 동안 표준 조직 배양 인큐베이터에서배양 (37 °C, 5 % CO2).</li>
	<li>3\u20124 일 후에, 유기체 구조물로 세포 클러스터의 조직을 확인하기 위하여 가벼운 현미경 (10x)의 밑에 배양을 검사하십시오. 그런 다음 250 μL ENR 배지로 감전 매체를 부드럽게 교체하십시오.</li>
	<li>3\u20124일마다 미디어를 교체합니다.</li>
</ol>7. 선택(해당되는 경우)
<ol><li>2\u20123 일 후, 적절한 경우, 변환 매체에 선택을위한 관련 항생제 또는 호르몬을 추가합니다. 참고: 플라스미드는 퓨로마이신 내성 유전자2,14를품고 있기 때문에 렌티브리얼 트랜스덕션의 선택을 위해 퓨로마이신(2 μg/mL)을 사용하였다.</li>
</ol>8. 성공적인 전이 및 유전자 발현 또는 침묵의 확인
<ol><li>FUGW 렌티바이러스2,14를사용하는 경우 형광 현미경 또는 유세포 분석을 통해 GFP 신호를 측정하여 감전 효율을 추정합니다.</li>
	<li>대조군 및 실험적인 오르가노이드 배양에서 mRNA의 정량적 비교를 위해 정량적 역사체 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 유전자 과발현 또는 침묵을 검증한다.</li>
	<li>웨스턴 블롯 또는 면역 염색 2에 의한 단백질 코딩 유전자발현 또는 침묵에 대한 단백질 수준을 확인한다.</li>
</ol>9. 지하 막 매트릭스의 오르노이드 냉동 절
참고: 그림3을 참조하십시오.
<ol><li>지하 멤브레인 매트릭스를 교란하지 않도록 조심하고 500 μL의 PBS로 한 번 부드럽게 씻지 않도록 부드럽게 흡입하여 ENR 배지를 제거하십시오.</li>
	<li>1.0 mL의 파라포름알데히드(PFA) 용액(재료 표)으로 오가노이드를 RT에서 30분 동안 고정합니다.</li>
	<li>흡입하여 PFA를 제거하고 1 mL PBS로 두 번 부드럽게 씻으십시오.</li>
	<li>흡입으로 PBS를 제거하고 각 샘플에 30 % 자당 완충액 1.0 mL을 추가하십시오. 냉장실, 냉장고, 또는 얼음에서 4°C에서 1시간 동안 자당에 고정 된 오르가노이드를 배양하여 샘플을 탈수합니다.</li>
	<li>흡입에 의해 자당 완충을 제거하고 각 우물에 매트릭스 층 (~ 300 μL / well)을 덮을 만큼 충분한 임베딩 화합물(재료표)을 추가하십시오.</li>
	<li>RT에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 -80°C 냉동고에 10분 동안 보관하거나, 임베딩 화합물이 고체와 흰색으로 변할 때까지 놓습니다.</li>
	<li>가장자리를 따라 화합물의 용융을 최소화할 수 있도록 RT에 냉동 임베딩 화합물이 있는 접시를 놓습니다. 메스를 사용하여 블록을 우물 의 벽에서 분리하십시오.</li>
	<li>집게를 사용하여 매트릭스 임베딩 화합물 블록을 제거하고 용융을 방지하기 위해 신속하게 작업하는 시편 블록 (예 : cryomold)에 배치하십시오.</li>
	<li>몰드를 임베딩 화합물로 완전히 채우고 -80 °C에서 30 분 동안 얼어 붙습니다.</li>
	<li>블록은 추가 사용을 위해 -80°C 냉동고에서 단면화 또는 보관용이다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다

오르가노이드로서 성인 장 상피의 1차 배양은 줄기세포 기능, 장상피 항상성 및 병리학 1,2,3에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 4. CRISPR/Cas9 기술은 오가노이드9를유전자 조작하는 데 사용될 수 있지만 원하는 유전 적 변화에 대한 서열 분석에 기초한 광범위한 스크리닝 및 선택에 대한 필요성에 의해 제한됩니다. 이 프로토콜의 목표는 렌티 또는 레트로바이러스가 장내 오르가노이드에 자성 나노입자 전달을 위한 비디오 기반 자습서를 통해 명확하고 간결한 지침을 제공하고 추가 분석을 위해 동결된 절편을 제공하는 것입니다.
이 프로토콜은 장 오르가노이드를 유전적으로 엔지니어링하고 ...

장기간에 걸쳐 소장이나 결장에서 3차원 (3D) 오르가노이드로 마우스 또는 인간 토굴 세포를 배양하는 능력은 이러한 문화가 생체 내에서 장 상피의 특징을 정의하기 때문에 중요한 돌파구를 제공했습니다. 1개 , 2개 , 3. 기본 토굴에서 파생 된 오르가노이드는 자기 갱신 및 자기 조직능력이 뛰어나며, 기원조직과 유사한 세포 기능을 나타낸다. 실제로, 오르가노이드는 생체 내 토굴의 구조적 조직뿐만 아니라 많은 분자 특징을 재구성하여 정상적인 생물학 및 질병 상태를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 설명하기 위하여, organoid 연구 결과는 조직 재생에관련시킨 새로운 분자 통로를 밝혔습니다 1, 2,3,4,5 뿐만 아니라 기능을 강화할 수 있는 약 병리학 설정6,7.
장 내 벽 줄기 세포의 연구는 장 내 의 박테리아, 독소 및 기타 병원체로부터 유기체를 보호하기 위해 3-5 일마다 자신을 갱신하는 가장 높은 재생 포유류 조직 중 하나이기 때문에 특히 관심이 있습니다. 장 루멘. 장 줄기 세포 (ISCs)는이 놀라운 재생 능력에 대한 책임이 있으며, 따라서 성인 줄기 세포기능을 공부하기위한 독특한 패러다임을 제공 1,2. 마우스의 계보 추적 실험은 분리된 Lgr5 양성 줄기 세포가 생체 내 대조물과 밀접하게 미러링되는 체외에서 3D 오르가노이드 또는 '미니 장'을 생성하기 위해 배양될 수 있음을 입증했습니다. 오르가노이드 배양은 또한 전구, ISCs 및 판세포로 구성된 장내 토굴 세포 분리체로부터 유래될 수 있으며, 그 중 후자는 생체 내 상피 틈새 세포를 구성한다. 사실, 1 차 적인 창 자 crypt 세포에서 organoid 문화는 널리 이용 가능한 시약을 사용 하 여 대부분의 실험실에서 구현 하기 쉬운 상대적으로 일상적인 기술로 진화 했다. 이 모델은 또한 질량 분석, 면역성 화학, 또는 면역 형광 염색 2,4,8에의한 RNA-Seq(RNA-Seq) 및 단백질에 의한 유전자 발현의 정량적 분석을 수행할 수 있다. 또한, 기능성 유전학은 기능의 이득(유전자 과발현 또는 활성화 돌연변이 유전자의 발현) 또는 기능 상실(유전자 침묵 또는 기능 상실 돌연변이의 발현)을사용하여 연구될 수 있다 2.
중요한 것은, 폴리브레인을 가진 표준 플라스미드 DNA 또는 바이러스성 감전 프로토콜의 낮은 효율 및 높은 독성은 필드에 있는 중요한 장애물 남아 있습니다. CRISPR/Cas9 기술은 정확한 게놈 편집을 허용하지만, 이 접근법은 시퀀스 유효성 검사9뒤에 시간이 많이 걸리는 선택이 필요합니다. 여기에서, 우리는 자기 나노 입자에 공고하고 자기장의 응용에 의해 바이러스 입자의 전달을 최적화하는 1 차장 오르가노이드를 위한 바이러스성 전달 프로토콜을 제시합니다. 이전 프로토콜 4,5,10,11,12,13 및 효율성을 향상시키기 위한 권장 사항에 대한 주요 수정사항이 제공됩니다. 우리는 또한 면역 조직 화학 또는 면역 형광 염색을 가진 추가 분석을 위해 3D matrigel (이제부터 지하 막 매트릭스 또는 매트릭스로 지칭)에서 배양된 손상되지 않은 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성하는 접근 법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>293T 세포용 기본 배지</td></tr><tr><td>DMEM/F12+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td>오가노이드 배양 배지 및 오가노이드 분해 완충액용 기본 배지</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>바이러스 플라스미드 형질주입 배지</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td>바이러스 채취 배지 및 293T 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>오가노이드 배양 배지 및 crypt dissociation buffer</td></tr><tr><td>PBS (Ca2+, Mg2+)</td>의 구성 요소<td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>10010049 세척 버퍼 및 crypt 해리 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>Mem-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>오가노이드 배양 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>GlutamaxII</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>오가노이드 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>오가노이드 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9644</td><td>오가노이드 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38 B</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>R&의 구성 요소; D</td><td>7150-RS-025/CF</td><td>오가노이드 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>인간 재조합 인슐린</td><td>Millipore Sigma</td><td>I9278-5ml</td><td>오가노이드 배양 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>니코틴아미드</td><td>Millipore Sigma</td><td>N3376-100G</td><td>형질 도입 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>Wnt3A</td><td>R& D</td><td>5036-WN-010</td><td>형질 주입 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Millipore Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td>형질 전달 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>크립트 해리 버퍼</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol)</td>의 구성 요소<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>크립트 해리 버퍼</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Millipore의 구성 요소 Sigma</td><td>D4818-2MG</td><td>오가노이드 분해 완충액</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>오가노이드 분해 완충액</td></tr><tr><td>성분(성장 인자 감소)</td><td>코닝</td><td>356231</td><td>오가노이드 내장을 위한 매트릭스로 사용</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>바이러스 생산에서 트랜스펙션을 위한 배지</td></tr><tr><td>ViralMag R/L</td><td>Oz Biosiences</td><td>RL40200</td><td>바이러스 형질도입의 자성 입자</td></tr><tr><td>자석 플레이트</td><td>Oz Biosiences</td><td>MF10000</td><td>바이러스 형질도입을 촉진하는 마그네틱 플레이트</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>바이러스 생산에서의 형질주입 에이전트</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Millipore Sigma</td><td>A-003-E</td><td>293T 세포 파종 전 플레이트용 코팅</td></tr><tr><td>4% 포름알데히드 용액</td><td>Boster</td><td>AR1068</td><td>오가노이드</td></tr><tr><td>O.C.T 임베딩 화합물</td><td>고정용 솔루션 Thermo Fisher Scientific</td><td>4583S</td><td>오가노이드 포매</td></tr>용 <tr><td>5mL 팔콘 폴리스티렌 튜브</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50mL 팔콘 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260250</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Inverted microscop CK30</td><td>Olympus</td><td>CK30</td><td>crypt 스캔 및 카운팅용</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td><td>Nikon</td><td>Axiovert 200</td><td>crypt 형광 관찰용</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Ultracel-100 멤브레인이 있는 원심 필터 장치</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td>바이러스</td></tr> <tr><td>농축용pluriStrainer 20 &마이크로; m (Cell Strainer)</td><td>pluriSelect</td><td>SKU 43-50020</td><td>오가노이드 단편 준비용</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340</td><td>크립트 분리 후 비슷한 크기의 cyrpts 준비용</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&nbsp; 멀티웰 배양 플레이트 48웰(뚜껑으로 TC 처리)</td><td>Millipore Sigma</td><td>M8937-100EA</td><td>ForD2:D37+D16:D37g 오가노이드 절편</td></tr><tr><td>동물 균주: C57BL/6J</td><td>Jackson Lab</td><td>#000664</td><td>오가노이드 배양용</td></tr></tbody></table>

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

장 내 오르가노이드 배양은 시험관내에서 장 줄기 세포를 조사하고 생물학을 토굴할 수 있는 독특한 기회를 제공하지만, 오르가노이드의 유전자 발현을 조작하는 효율적인 접근법은 이 분야에서 제한된 진전을 이루었습니다. CRISPR/Cas9 기술은 오르가노이드 생성을 위한 세포의 정확한 게놈 편집을 허용하는 동안, 이 전략은 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 서열 분석에 의하여 광범위한 선택 및 검열을 요구합니다. 여기에서, 우리는 장 오르가노이드의 능률적인 바이러스성 전송을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 접근 방식은 빠르고 매우 효율적이므로 CRISPR/Cas9 기술에 내재된 시간과 비용을 줄입니다. 우리는 또한 유전자 발현 또는 침묵을 확인하기 위하여 이용될 수 있는 면역 조직화학또는 면역형광 염색을 가진 추가 분석을 위한 본래 오르가노이드 문화에서 동결된 단면도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자 발현 또는 침묵에 대한 바이러스 벡터의 성공적인 환전이 달성된 후, 장 줄기 세포 및 토굴 기능을 빠르게 평가할 수 있다. 대부분의 오르가노이드 연구는 시험관 내 분석을 사용하지만, 오르가노이드는 생체 내 기능 분석을 위해 마우스에 전달될 수 있습니다. 더욱이, 우리의 접근은 현재 유효한 치료가 일반적으로 게놈을 바꾸기 보다는 오히려 유전자 발현 또는 단백질 기능을 변조해서 작동하기 때문에 약에 치료 반응을 예측하기 위한 유리합니다.

여기에서는 자기장에 노출된 자기 나노 입자를 활용하여 관심 있는 세포에 렌티바이러스를 전달하는 신속하고 고효율의 트랜스덕션 기술을 설명합니다. 쉽게 사용할 수있는 도구를 사용하여, 우리는 갓 단리 된 토굴 세포 (그림1A)를변환할뿐만 아니라, 오르가노이드 (그림2)및 더 일상적인 형질전환 접근법에 불응성 다른 세포를 변환하기 위해이 방법을 적용했습니다. 렌티바이러스 입자는 자기 나노입자에 쉽게 공액화될 수 있으며, 생성된 바이러스-나노입자 복합체는 자기판을 사용하여 자기장을 적용함으로써 효율적으로 전달된다. 이 접근을 낙하하기 위하여는, 우리는 GFP가 형광 현미경 검사법으로 형질전환한 세포를 확인하기 위하여 이용될 수 있었다 는 것을 GFP에 연결된 lentiviral 벡터를 처음으로 시험했습니다. GFP는 유기체 발달의 각 단계에서, 토굴 세포가 낭종 과 같은 ...

우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

오르가노이드는 기본 구조 조직뿐만 아니라 생체 내 장 상피의 많은 분자 특징을 재구성하기 때문에이 기술은 실험실에서 정상적인 생물학 및 질병 상태를 연구 할 수 있게합니다. 이 기술의 주요 장점은 낮은 세포 독성을 가진 매우 효율적인 트랜스듀션 접근법을 사용하여 유기체를 유전적으로 설계하여 이러한 유전자 조작 된 오르가노이드의 기능적 연구를 가능하게하는 능력입니다. 이 기술의 의미는 우리가 마약 및 그밖 에이전트 또는 내정간섭에 장 기관가노이드를 드러날 수 있기 때문에 장 질병을 위한 치료로 확장합니다.이 방법은 유방 조직과 같은 오르가노이드 배양또는 표준 2D 조건하에서 성장하는 세포에 대한 다른 시스템에서 발달 및 병리학 적 과정을 연구하기 위해 적용 될 수있다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인은 엔지니어가 어려운 오르가노이드 또는 다른 세포에서 트랜스듀션으로 성공할 것입니다. 우리는 먼저 우리가 우리의 유기체와 줄기 세포를 변환하는 어려움을 만났을 때이 방법에 대한 아이디어를 했다.이 방법의 시각적 데모는 극저온 절개를 위해 지하 매트릭스에 포함 공정 중에 샘플이 제대로 처리되지 않으면 오르가노이드의 구조적 손실이 발생할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 바이러스 성 트랜스듀션을 위한 오르가노이드를 성장시키기 위해, 48웰 플레이트에서 잘 당 200 마이크로리터의 트랜스듀션 배지를 가진 종자 오르가노이드 세포 배양, 표준 조직 배양 배양인에서 배양한다. 48웰 플레이트에서 각각의 우물의 전도를 위해 농축 바이러스의 약 50 마이크로리터를 허용하는 트랜스듀션을 위한 바이러스의 해동 유리병.1.5 밀리리터 튜브에서 바이러스를 자기 나노 입자 용액의 12 마이크로 리터와 혼합하고 실온에서 15 분 동안 배양합니다. 15분 후, 자기 나노입자 용액및 바이러스 혼합물을 세포에 추가하여 유도한다. 48웰 플레이트를 마그네틱 플레이트에 놓고 표준 조직 배양 배양인인 배큐베이터에서 최소 2시간 동안 배양합니다.바이러스 성 형질 전환이 완료되면 감염된 오르가노이드 세포 클러스터 및 트랜스듀션 배지를 각각 웰에서 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 5분간 500배 g의 원심분리기. 상체를 부드러운 흡입으로 버리고 얼음에 펠릿이 들어있는 튜브를 5 분 동안 식힙니다.각 튜브에 120 마이크로리터의 지하 멤브레인 매트릭스를 추가하고 천천히 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 분리합니다. 새로운 48웰 플레이트에 매트릭스 세포 혼합물의 30 마이크로리터 방울을 종자. 매트릭스가 고화될 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 5~15분간 배양합니다.각 우물에 트랜스듀션 배지를 추가하고 표준 조직 배양 인큐베이터에서 3~4일 동안 배양합니다. 3~4일 후에는 세포 클러스터를 오르간성 구조로 조직할 수 있도록 10배 배율로 광 현미경으로 배양을 검사합니다. 유기 배양 ENR 배지의 250 마이크로 리터로 각 우물의 트랜스듀션 배지를 부드럽게 교체하십시오.접시를 인큐베이터에 반환합니다. 부드러운 흡입에 의해 ENR 매체를 제거하고 지하 막 매트릭스를 교란하지 않도록주의함으로써이 절차를 시작합니다. PBS 500 마이크로리터로 부드럽게 씻으십시오.잘 당 4%의 파라포름알데히드 용액의 마이크로리터 1개를 추가하여 오르가노이드를 수정하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 흡입에 의해 파라포름알데히드 용액을 제거합니다. 부드럽게 잘 당 PBS의 마이크로 리터 를 추가 한 다음 부드러운 흡입에 의해 PBS를 제거합니다.이런 식으로 PBS로 두 번 씻으시면 됩니다. 두 번째 세척에서 PBS를 제거하고 각 샘플에 30% 자당 버퍼1개를 추가합니다. 샘플을 탈수하기 위해 섭씨 4도에서 1 시간 동안 자당에 고정 된 오르가노이드를 배양하십시오.흡입에 의해 자당 버퍼를 제거하고 각 우물의 매트릭스 층을 덮을 만큼 충분한 포함 화합물을 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 다음으로, 샘플을 영하 80도 의 냉동고에 10분 동안 또는 포함 화합물이 고체와 흰색으로 변할 때까지 놓습니다.가장자리를 따라 화합물의 최소 용융을 허용하기 위해 실온에 냉동 포함 화합물플레이트를 배치합니다. 메스 나 주걱을 사용하여 우물의 벽에서 블록을 분리하십시오. 용융을 방지하기 위해 신속하게 작동하여 집게를 사용하여 매트릭스 포함 화합물 블록을 제거하고 시편 블록에 배치하십시오.내장 화합물로 금형을 완전히 채웁니다. 단면에 블록을 사용하기 전에 30 분 동안 영하 80도에서 동결하십시오. 이 프로토콜은 먼저 GFP에 연결된 렌즈바이러스 벡터로 장 오르가노이드를 유도하여 최적화되었습니다.GFP는 오구체 발달의 각 단계에서 시각화되었으며, 토굴 세포가 낭종과 같은 구조로 구성될 때 또는 오르가노이드가 싹을 형성할 때 나중에 지점을 구성하는 경우를 포함하여 초기단계로 시각화되었습니다. 성공적으로 유도된 장 기관지들은 그 때 포르말린 고정, 저온절면, 면역형광 영상에 의해 분석되었다. 이 이미지에서 핵은 파란색으로 염색되고 녹색은 세포 경계를 구분하는 상피 세포 접착 분자를 나타냅니다.빨간색은 창세포를 식별하기 위해 리소솜 염색을 나타냅니다. 일단 마스터되면, 트랜스듀싱 오르가노이드는 약 3시간 안에 수행될 수 있고, 오르가노이드 크라지섹션 포함은 약 2 1/2시간 안에 행해질 수 있다. 이 절차를 시도할 때는 지하 매트릭스 시약을 처리할 때 얼음 작업을 하는 것이 중요합니다.이 절차를 완료한 후, 단백질 또는 세포기관을 검출하는 면역형광 분석 및 기타 방법을 수행하여 국소화 또는 상대적 풍부를 평가할 수 있다. 이 기술은 연구원이 생체 외에서 정상 생물학 과 질병 상태를 탐구하는 방법을 포장하고 또한 생체 내 연구 결과에 대한 트랜스 포이드 오르가노이드 또는 세포가 마우스로 이식 될 수 있는지. 이 비디오를 시청한 후에는 자기 라벨이 부착된 바이러스를 사용하여 저온 절전을 위해 유기체를 유전적으로 설계하는 방법을 잘 이해해야 합니다.바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행할 때 적절한 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 수행해야 합니다.

genetic-engineering-primary-mouse-intestinal-organoids-using-magnetic

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서와 함께 비디오 organoid 단위 온 발판 접근법을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기 위해 우리의 프로토콜을 제시한다.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

기본 생쥐 대장 종양 organoid을 설정하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 대장 종양 세포가 생존하고 상피 정상적인 결장하지 않는 반면, 제한된 성장 인자를 포함하는 미디어 organoids로 성장하는 기능을 사용합니다.

기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다   모델 시스템.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

이 비디오 프로토콜에서는 1차 장 상피의 오가노이드에서 렌티바이러스 형질전환과 정량적 RT-PCR, RNA-마이크로어레이 및 면역조직화학에 의한 이러한 배양의 처리 및 다운스트림 분석에 대해 단계별로 설명합니다.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 기술을 사용하여 다중 유전자 녹아웃을 만드는 데 사용되는 하나의 가이드 RNA concatemer 벡터에 여러 단일 가이드 RNA를 복제하는 단계를 설명합니다. 장 organoids에 이중 knockouts의 생성은이 방법의 가능한 응용 프로그램으로 표시됩니다.

CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

배우세요 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학을 위한 자기 나노입자 바이러스 벡터 전착법을. 냉동 절편 제작과 저세포독성 고효율 유전자 전달 기술로 장 질환 연구 및 치료 개발에 활용할 수 있습니다.

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

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