Name: 세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 배우세요 인간 정밀 절단 폐 조각(PCLS)을 이용한 세포 독성 및 면역 조절 효과 평가 방법을. 이 기술은 호흡기 질환 모델링 및 공기 중 물질의 안전성 평가에 활용됩니다.

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우리는 인간의 웹와 위험 평가 대 한 대체 테스트 전략에 대 한 그녀의 사전 작업에 대 한 Lan Lauenstein를 감사 하 고 싶습니다. 연구의 일부는 6번째 프레임 워크 프로그램 센스-그것-4 "생체 외에서 알레르기 증상의 평가 대 한 새로운 테스트 전략" 내 유럽 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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저자는 공개 없다. 프라운호퍼 항목 대신 생명 공학, 제약, 화학, 및 화장품 산업 계약 연구 수행 연구, 대 한 독립적인 공공 비영리 연구 조직 이다. 연구소의 자금 국내외 공공 프로젝트에서 온다.

인간의 웹 기술은 우리의 실험실에서 잘 설립입니다. 현재 종이이 기술과 폐 조직 비보 전물질의 독성 시험에 대 한 사용 설명을 제공 합니다. 일반적으로, 정량 범위 정의 variabilities, 그리고 실험의 타당성을 보장 하는 품질 제어의 추정 관련 모든 실험실을 사용 하 여이 기술을 설정 분석 결과를 받아야 한다. 가능한 표준 절차 수, 예를 들어 각 끝점, 예를 들어, 샘플 등 긍정적인 당 2 ~ 3 기술 복제의 최소 최소 3 명의 생물 학적 기증자 (개별 실행)에서 세포 독성 분석 실험을 반복 하 고 네거티브 참조 합니다. 실험실 인원 분석 결과 일관성을 증가 분석 결과 변화를 최소화 하 고 훈련 한다.
폐 조직에 물질의 immunomodulatory 효과 평가 하기 위해 자주 사용 하는 끝점 포함 세포 독성 측정 (예를 들어, LDH 분석 결과, 서 부 표준시-1 분석 결과, 분석 결과 얼룩이 지기 현미경) 다른 분석 실험을 사용 하 여, cytokine 방출 분석 실험도 식 프로필과 immunohistopathological 방법6세포 인구에 있는 변화의 특성의 변화. 또한, 인간의 웹으로 또한 옮겨질 수 있다 하 고 따라서 전에 세포 구성에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다 murine 웹28 폐 수지상 세포와 같은 셀의 시각화를 설명 하는 기술이 있다 고 후에 상 상속 세포 독성 물질과 치료.
이 기본 프로토콜 및 인간의 폐 조직 단면도의 준비에 대 한 기술 간행물29에 잘 설명 되어 있는 기술을 비교입니다. 즉, 기관 자료 절제술 또는 이식 수술을 받아야 할 폐 암, 등 라이브-위협 하는 만성 질병 으로부터 고통 받는 환자에서 얻은 것입니다. 연구는 지역 윤리 위원회에 의해 승인을 받아야 한다. 환자 정보 동의서가 필요 합니다. 클리닉 및 연구소 간의 워크플로 설정은 중요 한 문제 이며 통신, 인터페이스 및 두 사이트 간 인프라의 정의. 인간의 폐 재료 조직의 생존을 유지 하기 위해 절제 후 직접 처리할 수 있다. 그것은 젊은이 노인 모두 폐를 건강 하 고 병에 걸리는 폐 인간 웹에 대 한 여기에 설명 된 기술을 적용할 수 있습니다 언급할 가치가 있다. 예를 들어 미국에서 폐를 건강 한 장기 기증자 사고에서 죽은 또는 그 장기 이식에 대 한 거부 되었습니다에서 가능 하다.
프로토콜의 첫 번째 중요 한 단계는 기도 및 주변 실질 agarose 솔루션의 인플레이션입니다. 이 단계는 후속 조각화 절차에 대 한 매우 부드러운 조직을 공고히 하는 데 필요한. 여기 질병 배경에 따라 인간의 폐 재료의 질이 중요 합니다. 그대로 늑 막에와 함께 엽만 채울 수 있습니다. 기관지 근처 말기 종양은 가끔 작성 프로세스를 방지합니다. 인간의 재료를 팽창 하기 전에 agarose 솔루션의 온도 철저 하 게 검사할 수 있다. 너무 많은 혈액 (또는 다른 체액, exudates) 인간 안에 폐 조직 agarose의 원치 않는 희석 고 중 합 과정에 영향을 미칠 것 이다. 폐 조직의 인플레이션 및 얼음에 agarose의 고, 후 폐 200 ~ 300 µ m 두께의 섹션으로 절단 됩니다. 조직의 일관성은 매우 중요 한 문제입니다. 조직 너무 연약한 경우에, 동일한 섹션의 슬라이스 하는 것은 어렵습니다. 각 폐에 대 한 매개 변수는 각 기증자, 기증자 사이 조각의 두께 다를 수 있습니다에 대 한 설정 되어 동일한 톰, 개별로 조건 및는 팽창 하는 동안 변경 내용을 처리 하는 경우에. 조직의 휘도가 작성 다른 슬라이스 두께에 발생 합니다. 측정 하 고 표준화 하는 조각의 두께, 대신 총 단백질 함량의 측정 폐 슬라이스 두께 직접 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 여러 가지 말기 질병 방해 조각화 프로세스; 예를 들어, 혈액 혈관은 폐 고혈압과 거리 조직에 두꺼워 매우 단단하게 가능 하다 조직 실린더의 조각화와 톰 블레이드 매우 자주 교체 해야 그래서 뻣 뻣 한 수 있습니다.
인간 웹 및 집중 단계 세척의 준비, 후는 세포 파편을 제거 하는 데 필요한 하 고 출시 효소, 조직 실험29의 섹션은 사용할 수 있습니다. 인간의 웹 정상 세포 배양 조건에서 배양 되며 노출 하는, 예를 들어 화학 물질, 약물, 또는 lipopolysaccharides. (알 수 없음된) 감염으로 인해 웹의 가끔 오염 인간 폐 재료의 문화에 특별 한 문제입니다. 감염을 표시 하는 조직 문화를 폐기 해야 하 고 장비를 철저 하 게 소독 해야 합니다. 다른 한편으로 준비를 위해 한 손으로 사용 하는 실험실 장소 및 경작 사이 공간 별거 교차 감염을 피하기 위해 도움이 됩니다. 장비에 관하여는 톰 누설 수 있습니다, 그리고 느슨한 육각 나사 모터 손상 및 블레이드 운동의 중지 발생할 수 있습니다. 슬라이서의 모든 부분 스테인레스 스틸로 만들었고 그래서 그것 건조 하지 경우 산화 됩니다 즉시 청소 변경. 장비 문제를 해결 하려면 적어도 하나의 백업 장치를가지고 필요할 수 있습니다.
이전 간행물에서 agarose 씻 겨 보고 되어과 집중 준비 후 단계를 세척 하는 동안 제거. 사실, 이것은 불가능 하는 agarose를 제거할 수 없습니다. agarose의 완전 한 제거, 조직을 파괴 하는 것을 높은 온도에서 다시 녹 인 될 필요 합니다. 폐 포 및 항공 agarose 설명된 끝점 방해 하지 않습니다. 다른 끝점 agarose의 존재에 의해 영향을 받을 수 있습니다 (제한 참조). 조직 생존 능력은 문화에서 중요 한 문제가 매우 신선한 조직 단면도 준비할 필요가 강조 되어야 했다. 기관지는 생존에 대 한 유효한 매개 변수가 아니다. 적어도 2 개 또는 3 개의 독립적인 세포 독성 분석 실험을 사용 하 여 주변 실질;의 생존 능력을 확인 하는 것이 좋습니다. 이것은 모든 실험30에 체크 합니다. 세포 독성 분석 실험에서 품질 컨트롤 부족 조직 생존 능력의 지표 역할을 합니다. 따라서, 모든 세포 독성 분석 실험에 세제와 같은 효과적인 독성 물질에의 조직, 예를 들어 응답을 평가 하는 것이 좋습니다. 복용량 응답 곡선을 바탕으로, 흡수의 최소 및 최대 값 세포 독성 분석 실험에 대해 정의 하는 데 필요한 하 고 후속 실험을 위해 만났다. 추가 수정 프로토콜에 주로 적용 된 화학 물질과 관심의 끝점에 따라 달라 집니다. 불 용해성 또는 반응성이 매우 높은 화학 물질의 적용은 제한 됩니다. DMSO에 대 한 높은 용 매 농도 1%로 제한 됩니다. 높은 농도 사용할 수 있지만 프로 염증 성 cytokines, IL-8 등의 발음 릴리스에서 발생할 수 있습니다. 다른 한편으로, 사용 하는 자극은 상대적으로 약한 수 있습니다. 이 경우에, 조직의 양은 2 잘 당 4 조각에서 늘릴 수 있습니다. 이 방법은 24 시간을 생존 능력을 제한합니다.
인간의 웹의 주요 한계는 독일에서 그들은 준비 될 수 있다 질병 인간 폐 자료에서 이다. 수술을 받을 환자는 일반적으로 50 년 보다 더 오래 된와 폐암에서 고통 받는 환자의 80%는 흡연 자 수 하는 데 사용. 환자, 스테로이드 제제 등의 약물도 인체 조직을 사용 하 여 실험의 결과 좌우할 수 있다. 따라서, 그것을 필수적 이다: i) 긍정적인 참조 생존 능력, 기능, 및 개별 조직의 감도 확인 하 여 각 실험의 유효성을 검사 하 고 ii) 크로스-건강, 비 병에 걸리는, 중간 나이 폐 조직에서를 사용 하 여 결과 확인 실험 동물 (cynomolgus 같은 비 인간 영장류 고, 가능 하면, 마우스, 쥐, 기니 피그). 병에 걸리는 직물의 더 나은 병 리 점수는 더 나은 실험 결과. 주로 병에 걸린 조직을 거의 사용할 수 하 고 매우 자주 쇼 제한 가능성, inadequately 낮거나 매우 높은 cytokine 수준, 세균 이나 곰 팡이 감염, 그리고 적은 기관지. 기증자 기증자 변형 높은 인간의 개별 다양성을 반영 하는 실험실 동물에서 얻은 결과와 비교 됩니다. 그러나 이것은,, 하지 한계 일반적으로; 다른 국가에서 (예를들면, 미국) 그것 죽은 장기 기증자 이식에 대 한 거부에서 건강 한 폐를 얻을 수, 위에서 언급 했 듯이. 조직의 응답 급성 노출 실험에서 48 h에 대 한 첫 번째 최대에 대 한 잘 설명 하고있다. 문화의 많은 일 후에 또는-80 ° c.에 저장 후 생존 및 조직의 기능 감소 약 14 일에 대 한 문화 인간의 폐 조직에 가능 하다. 이 시간 동안 계속 생존 능력 그러나, 다양성, 여러 세포 인구 세포, 조직에서 등의 기능의 손실에 있는 증가 관찰, 제한 된 사이토카인 릴리스 mitogens에 대 한 응답에서 결과. 일부 끝점에 대 한 또 다른 한계는 agarose 방해, 예를 들면, 높은-품질 및 충분 한 양의 RNA31 의 격리 또는 후속 cytometry에 대 한 단일 셀 정지의 준비 조직에 존재 하 고 형질 세포의. 단일 셀 반응과 기능에 기계 통찰력을 얻을 수 있는 가능성은 따라서 제한 됩니다.
Organotypic 조직 모델, 인간의 웹 기본 및 비 임상 연구에 높은 영향을 간주 됩니다. 인간의 폐 재료는 밀접 하 게 정상적인 기관 아키텍처를 반영 하는 생물 학적 구성. 그것은 예를 들어 주거 치경과 기관지 상피 세포, 평활 근 세포, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 신경 섬유, 및 대 식 세포 포함. 조직 실용적 이며 여러 가지 자극에 응답 하는 셀. 비록 섬유, 신경 절단, 활성화 될 수 있다 로컬, 터미널 반사 응답14선도. 따라서,이 비보 전 모델 세포질 타고 난 면역 반응, 방위 응답, 신호, cytokine 유도 세포 표면 마커 연구 가능성을 제공 합니다. 몇 가지 개선 기술, 경작, 및 끝점의 유효성 검사 변환 과학에서 인간의 웹의 사용을 허용합니다. 미래 접근의 예는: i) 유효성 검사의 새로운 대상으로 인간의 폐 조직, 노출, 면역 반응의 평가 ii)에 예를 들어 화학 물질, 약물, 나노 입자, 등, iii), 면역 세포와 폐 조직 보완 등 T-세포, iv)으로 식별 및 호흡기 sensitizers, 질병 유도 물질, 또는 통로; 억제 활성 화합물에 노출 후 분자 패턴 등의 수정 또한, v) 개장 하는 기도 vi) 신경 규정32. 과학 분야는 웹과 현재와 미래의 이러한 접근에 관심을. 또한, 다양 한 다른 개발 cryo 보전20및 조직 호흡 하는 동안 또는 기계적인 직물의 자연 스러운 움직임을 모방 하33 스트레칭 등 웹 기술을 향상 하는 데 도움이 됩니다 있다 환기입니다.
다른 3D 모델에 비해 인간의 웹의 주요 장점은 면역 세포와 신경 섬유의 존재입니다. 실험 또한 마우스, 쥐, 및 아직도 약리학과 독물학에서 가장 자주 사용 되는 동물 종 비 인간 영장류에서 수행할 수 있습니다. 인간의 폐 조직의 복잡성 결과 인간을 동물에서 생체 외에서 vivo에서에서 번역을 지원합니다. 호흡기 sensitizers의 식별에 대 한 기존 대안 분석의 맥락에서 인간의 웹은 매우 복잡 하 고 단일 세포 응답에 대 한 통찰력을 허용 하지 않습니다. 그러나, 현미경 및 흐름 cytometry 바로 세포 마커 사용 하는 경우에, 예를 들어 apoptosis, 괴 사, 또는 세포내 표식 세포질 응답에 대 한 정보를 줄 수도 있습니다. 검증 되 고 호흡기 sensitizers의 식별을 위해 사용 되었다고 보고 있는 게시 된 분석 실험을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 단일 세포 분석 실험을 통해 그들의 모든 장점 가진 웹을 사용 하 여에서 발전 하고있다 귀중 한 기여를 기술은 높은 처리량 검열을 위해 사용 될 수 있다는 의미에서 왓슨 외 에 설명 된 대로 34 그들은 murine cryo 보존 웹에서 기도 독성을 예측 하는 높은 처리량 검열 분석 결과 개발. 그들의 소형된 96 잘 웹 형식으로 그들은 murine 게 액체, 가능한 높은 처리량 분석 결과 웹을 만들기에 유사한 정보를 발견.

알레르기 성 천식, 직업 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 기종, 위와 더 낮은 기도의 감염 등 호흡기 질병 증가 하 고 전세계 건강 부담1,2를 나타냅니다. 적합 한 테스트 시스템은 적절 한 물질의 개발 뿐만 아니라이 질병을 기본 기본 메커니즘의 일부를 식별 하는 데 필요한. 임상 약물 개발 뿐만 아니라 기본 연구는 생체 외에서 또는 vivo에서 분석 실험에서 얻은 결과에 집중 된다. 그러나이 분석 실험은, 그들의 한계3있다. 첫째, 분석 실험 체 외에 활용 인간의 세포는 고립 되었고 인접 한 조직이 나 장기에서 제거 되며 따라서 더 이상와 상호 작용 하거나 다른 세포3에 의해 보호 될 수 있습니다. 둘째, 동물 모델은 종종 생리 및 생 화 확 적인 차이점4차이로 인해 인 간에 게 번역. 이러한 한계를 최소화는 3Rs의 맥락에서 (, 세련미, 감소) 원칙5, 새로운 대체 모델은 끊임없이 발전 하는.
대체 인간의 3 차원 조직 모델, 웹, 생체 외에서 인간 기반 및 복잡 한 동물 vivo에서 모델 간의 링크는. 웹은 호흡기6에 모든 관련 셀 종류와 기능이 반영합니다. 또한, 웹 기술은 단일 동물 또는 인간 조직 기증자 로부터 정확한 두께의 여러 얇은 조각의 재현할 준비의 이점이 있다. 이 내부 제어 뿐만 아니라 다른 농도 또는 테스트할 마약.
피셔 그 외 여러분 에 의해 1994 년에 인간의 폐 한 가득 조각의 첫 번째 도입 이후 7 조각화 및 폐 조직 배양 기술을 크게 향상 되었습니다. 기독교 마틴 외. 이 기술은 더 화학과 약리학 응용 프로그램8을 개선 했습니다. 우리의 그룹이이 기술은 기독교 마틴에 의해 2007 년에 도입 되었다. 그 이후, 연구에서 웹의 응용 프로그램 기능에 대 한 응답, 기도9,10 , vasoconstriction11, 같은 면역학, 약리학12,13, 테스트에서 확장 했다 그리고 독물학7 여러 실험실에서 다양 한 종에서 테스트. 예를 들어, Schlepütz 외. 14 종의 차이 대 한 기도 응답을 조사 하 고 비교 주변 신경 활성화 전기 필드 자극 (EFS) 또는 capsaicin 쥐, 쥐, 기니 돼지, 양, marmosets, 및 인간. 그들은 신경 중재 기관지의 고유 하지만 다른 패턴을가지고 다양 한 종족을 발견 하 고 일반적으로 사용 되는 실험실 동물 (쥐, 쥐)는 항상 인간의 응답을 반영 하지 않습니다 결론을 내렸다. 폐 독성 테스트와 이러한 맥락에서 헤스 외 동물의 수를 줄이기 위해 15 미리 흡입 독성 연구를 위한 비보 전 대신 쥐 웹 확인. 이 multicentric 사전 검증 연구 결과 유망한 결과 함께 웹을 사용 하 여 두 개의 예측 모델의 개발.
또한, 기초 연구에 웹 칼슘 신호16, 초기 알레르기 성 응답17및 바이러스 감염 응답18,19명료 하 사용 되었습니다. 기술 진보는 지속적인 고 더 진보 탐구 되 고 있다. 예를 들어 필드 저장 및 냉동된 조직의 재사용에 의해 인간의 조직 혜택을 증가 하고있다. 로즈 그 외 여러분 설명 중지 및 재개 능력 기도의 자극에 따라 계약을 유지 하는 murine 웹의 기술: 따라서, 기술은 연장 가능한, 그리고 그래서 더 조직 유지 하는 제한 된 시간 창 분석 실험은 동일한 기증자20시간이 지남에 따라 적용할 수 있습니다. 이러한 연구 발전, Lauenstein 그 외 여러분 뿐만 아니라 21 은 최근 인간의 웹 직업 천식에 대 한 잠재적인 sensitizers 역할을 수 있는 다양 한 화학 물질의 위험 평가 조사.
그 증상은 공기 흐름 방해와 기도 hyperresponsiveness, 유사한 알레르기 성 천식, 직업 천식, 높은-분자-무게 (HMW)22 또는 저 분자 무게 (LMW) 물질23 에 노출에 의해 유도 된다 (예: , 백 금 화합물) 직장 환경에서. LMW 에이전트 haptens 형성 때 잠재적인 높은 민감성을가지고 고 캐리어 단백질21에 바인딩합니다. 새로운 HMW 또는 LMW 화학 물질의 등록 잠재적인 putative 그들의 민감성에 관한 생체 외에서 그리고 vivo에서 위험 평가가 필요한 (예., OECD 가이드라인 429)24. 그러나 잠재적인, 상 상속 민감성을 결정 하는 데 사용 하는 테스트, 원래 설계 되지 않은 호흡기 sensitizers, 위험 평가 하지만 연락처 sensitizers, 물질25의 작은 하위 집합에 대 한 몇 가지 적합성 있을 듯 하지만 . Lauenstein 그 외 여러분 에 의해 작업 putative 접촉 또는 폐 sensitizers21의 위험 평가 대 한 대체 테스트 전략을 개발 하기 위해 센스-그것-4 유럽 연합 프로젝트의 일환으로 설계 되었다. 이 프로젝트를 위해 우리는 대체 테스트 도구로 인간의 웹의 유용성을 테스트에 집중 했다. 따라서, immunomodulatory 끝점 (예를 들어, 생존 및 cytokine 분 비)의 집합 LMW 백 금 화합물 등의 화학 물질의 자극 또는 염증 성 잠재력을 결정 하기 위해 선정 됐다. Lauenstein 외. 모든 호흡기 sensitizers;에 적용할 수 있는 일반적인 패턴을 발견 그러나, 그들의 작품26최근에 출판 된 프로토콜 대 한 기초를 제공합니다.
요약 하면, 준비와 인간의 웹의 후속 노출에 대 한 여기에 제시 된 프로토콜 메서드를 제공 합니다 도움이 잠재적으로 폐 독성의 평가 및 호흡기의 개발에 참여 있을 immunomodulatory 물질 질병, 직업 천식 등입니다.

<table><tbody><tr><td>실리콘 호스 3.0 x 5.0 mm</td><td>A. Hartenstein (Leipzig, Germany)</td><td>SS04</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Faust Lab Science (Klettgau, Germany)</td><td>9.410 050</td><td></td></tr><tr><td>코어링 도구</td><td>맞춤 제작</td><td>맞춤 제작</td><td></td></tr><tr><td>트리밍 블레이드 핸들 (FEATHER)</td><td>pfm medical ag&nbsp; (독일 쾰른)</td><td></td><td></td>205530001</tr><tr><td>트리밍 블레이드 (FEATHER)</td><td>pfm 의료 농업&nbsp; (독일 쾰른)</td><td>205500000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰: 티슈 슬라이서</td><td>앨라배마 R& D (Bad Homburg, Germany)</td><td>303400-ADPT</td><td>Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)</td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Wilkinson Sword (Solingen, Germany)</td><td>ENR-4027800011506</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>Sigma (M&uuml; nchen, Germany)</td><td>Z666246-420EA</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 필터 (100 &micro; m 나일론)</td><td>Becton Dickinson (독일 하이델베르크)</td><td>BD352360</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop</td><td>Copan Diagnostics (미국 무리에타)</td><td>&nbsp; </td><td></td>CD176S01</tr><tr><td>TPP 조직 배양 플레이트 24wells</td><td>Sigma (M&uuml; nchen, Germany)</td><td>Z707791-126EA</td><td></td></tr><tr><td>Cassette</td><td>Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td><td>1000957</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp flat-bottom</td><td>Fisher Scientific GmbH (하노버, 독일)</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well&nbsp;</td><td>Thermo Scientific (Schwerte, 독일)</td><td>260836</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss (예나, 독일)</td><td></td><td>Confocal LSM Meta 510</td></tr><tr><td>이미지 렌더링 소프트웨어</td><td>Bitplane AG (Z&uuml; Rich, Switzerland)</td><td></td><td>IMARIS 7.6</td></tr><tr><td>LSM Image Browser</td><td>Zeiss (예나, 독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiwell-Reader</td><td>Tecan Group Ltd. (M&auml; nnedorf, 스위스)</td><td>Tecan infinite F200Pro</td><td>Plate Reader</td></tr><tr><td>Plate shaker</td><td>Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)</td><td>KM-2 Akku</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark ULTRA</td><td>Ventana Medical Systems (Tucson, USA)</td><td></td><td>Automated IHC/ISH slide staining system</td></tr><tr><td>Assays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Proliferation Reagent WST-1</td><td>Roche (Basel, Switzerland)</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td><td>Roche (Basel, Switzerland)</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>현미경 생명력 염색&nbsp;</td><td>Invitrogen(미국 칼즈배드)</td><td>L-3224</td><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay</td><td>Thermo Scientific(독일 Schwerte)</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 분석 키트</td><td>R & 다양한 D 시스템</td><td>, 예: DY210(TNF-&alpha;) 또는 DY200(IL-1&alpha;)</td><td>듀오셋</td></tr><tr><td><강>시약</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아가로스, 낮은 겔화 온도&nbsp;</td><td>시그마(M&uuml; nchen, Germany)</td><td>A9414-100G</td><td></td></tr><tr><td>균형 잡힌 염 혼합물 및 용액, 세포 배양, 클래식 배지 및 염, Earle' s 평형 소금 (EBSS)</td><td>시그마 (M &uuml; nchen, Germany)</td><td>E2888-500ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>Lonza (Verviers, Belgium)</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s 변형 독수리&급성; s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12)</td><td>Gibco (Darmstadt, Germany)</td><td>11039-047</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s 인산염 Ca 및 Mg (DPBS)</td><td>Lonza (Verviers, Belgium)</td><td>BE17-513F&nbsp; &nbsp;</td><td>완충 용액</td></tr><tr><td>소 혈청에서 추출한 알부민(BSA)</td><td>시그마(M&uuml; nchen, Germany)</td><td>A9647-500G</td><td></td></tr><tr><td>Detergent</td><td>Sigma (Saint Louis, USA)</td><td>X100-100ML</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>Washing buffer</td><td>Merck (Darmstadt Germany)</td><td>524653</td><td>&nbsp; 0.05% PBS에서 트윈 20</td></tr></tbody></table>

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 immunomodulatory 효과

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

그들의 광범위 한 다양성에 호흡기 질병 근본적인 메커니즘을 이해 하 고 새로운 치료제의 개발에 대 한 적절 한 모델 시스템 필요. 또한, 새로운 물질의 등록 다치게 되 고, 예를 들어 작업 환경에서 개인의 위험을 피하기 위해 적절 한 테스트 시스템과 적절 한 위험 평가 해야 합니다. 이러한 위험 평가 동물 연구에서 보통 지휘 된다. 3Rs 원리 및 동물 실험에 대 한 공공 회의론에 비추어 인간 대체 메서드를 정밀 컷 폐 조각 (웹), 진화 되었습니다. 현재 종이 암모늄 hexachloroplatinate (HClPt) 등의 저 분자 무게 물질의 immunomodulatory 잠재력 연구를 인간의 웹의 비보 전 기술을 설명 합니다. 측정 된 끝점 생존 등 지역의 호흡기 염증, cytokines 그리고 발산의 변경된 분 비에 의해 표시. 프로 염증 성 cytokines, 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α), 그리고 인터 루 킨 1 알파 (IL 1α) HClPt의 하위 독성 농도에 노출 된 후 인간의 웹에서 크게 증가 했다. 웹 기술은 지난 수 십년 동안 실질적으로 최적화 된, 비록 immunomodulation의 테스트에 대 한 그것의 적용은 아직도 개발. 따라서, 여기에 제시 된 결과 예비, 그들은 호흡 연구에 귀중 한 도구로 인간의 웹의 잠재력을 보여 비록.

현재 연구 방법으로 인간의 웹 준비 하 고 인간 폐 물질에 화학적 유도 immunomodulatory 효과 평가 하기 위해 산업 물질의 5 개의 농도에 노출 했다. 폐 조직 24 h. 독성에 대 한 영구 문화 발표 LDH, 미토 콘 드리 아 활동 및 미세한 생존 얼룩의 측정에 의해 평가 되었다 침수 조건에서 노출 되었다. 또한, 정상화와 프로 염증 성 cytokines에 대 한 총 단백질 함량 측정 되었다. 가능 하다 면, 비-선형 자형 곡선에 피팅 하 여 금지 농도 (IC) 75 값 계산 했다. 긍정적인 참조 물질, cytokine 타고 난 응답에 대 한 세포 독성 및 LPS에 대 한 세제는 각 실행의 유효성 검사를 위해 사용 되었다. 로그값으로 변환 된 IC75 [μ M] 값 (로그 IC50) 후속 cytokine 방출 측정 농도 "자극성"로 사용 되었다.
그림 1 과 그림 2 인간의 폐 소재와 모범 H &amp; E 염색 인간의 웹의 작성의 절차를 보여줍니다. 일상적인 위생 절차 건강에 불리 한 영향을 방지 하 고 인간의 폐 재료를 처리 하는 직원의 안전 보장에 따라 해야 합니다. 기술 인력 훈련 및 연습을 요구 한다. 다른 영역 (위/아래 돌출부 및 더 많은 중앙 대 subpleural) 구별 병리학 경험 대 병 하 고 건강 한 지역 인간의 폐 재료의 병 적인 상태를 평가 하는 데 필요한. 생성 된 인간의 웹 H &amp; E-얼룩진 얇은 섹션, 병리학 자에 의해 다시 계산 될 수 있는 준비를 위해 사용 되어야 한다. 이 절차는 사용자 차별 다른 병에 걸리는 지역 및 폐 내의 위치에서 연습을 얻을 수 있습니다.
그림 3 SLS와 24 시간 배양 후 인간의 웹에서 LDH 및 서 부 표준시-1 활동에 대 한 측정 결과 제공합니다. SLS, 0 µ g/mL SLS에서 표시 없이 치료 매체 제어는 중요 한 품질 관리. LDH에 비해 세제 lysed 조직에 대 한 값이 20% 미만 이어야 하 고 &gt; 서 부 표준시-1 분석 결과 대 한 0.7 흡 광도 단위. 이 질 통제는 또한 부족 한 조직 생존 능력의 지표 역할을 합니다. 효과적인 독성 물질, 세제 솔루션으로 인간 조직의 응답 긍정적인 컨트롤로 포함 되어야 합니다. 그것은 300-500% 증가 초래 한다 (&gt; 2.0 흡 광도 단위) 치료 조직 및 값에 비해 LDH의 &lt; 서 부 표준시-1 분석 결과 대 한 0.1 흡 광도 단위. SLS는 복용량-의존 감소 LDH 농도에서 서 부 표준시-1 분석 결과 대사 활동의 감소에 있는 증가 의해 측정 된 세포 생존 능력의 결과 &gt; 87 µ g/mL. 시그모이드 농도-응답 모델 IC75 또는 IC50 값을 계산할 수 있도록 데이터를 장착 했다. 이러한 값 cytokine 및 chemokine 수준에 대 한 농도 선택 하는 데 사용 이후 수: 매우 독성 농도에서 일반적으로 없음 또는 저하 cytokines 및 발산만 검출 될 수 있다. 따라서, 비 독성 또는 유일한 약간 독성 농도 (IC75)는 것이 좋습니다. 그것은 여기 표면에 뜨는 세포 배양에서 LDH 활동의 예상된 증가 종종 적용된 물질21에 의해 영향을 주의 하는 것이 중요. 자주, 방해 물질과 효소 활동, LDH 분석 결과 사용 하는 유일한 세포 독성 시험 하는 경우 결과의 오해로 이어지는 간에 발생 합니다. 따라서, 그것은 중요 하 고 안정적이 고 유효한 결과 얻기 위해 여러 가지 세포 독성 분석 실험을 수행 하는 데 필요한입니다. 또한, LDH 및 서 부 표준시-1 분석의 감도 매우 유사한 언급 한다.
그림 4에서 웹의 미세한 생존 이미지 효과적인 독성 물질로 서 세제에 인체 조직의 응답을 보여 줍니다. 결과 다른 생존 데이터를 확인 하는 매우 유용 하지만이 추가 장비가 필요 합니다. 독성 효과 시각적으로 calcein-긍정적인 조직 EthD-1-긍정적인 세포 핵에 비해의 평가 의해 평가 됩니다. 실질 내에서 임의로 선택 된 세그먼트 일반적으로 귀 착될 비교 데이터, 항공 또는 혈관을 피해 야 한다, 반면 큰 충 치 결과 교대로 수 있습니다. 우리의 경험에서 그리고 위에서 설명한 미세한 설정, 1.5 x 106 와 5 x 106 µ m3 의 컨트롤 조직 사이 평균 볼륨 측정 됩니다. 값에는 폐 소재 품질, 웹 품질, 그리고 또한 폐 조직 기증자의 질병에 따라 달라 집니다. 인간의 폐 조직 생존 기증자 마다 다릅니다, 비록 죽은 세포 핵 가능한 조직에 비해 수 조직 제어의 15%를 넘지 말아야 한다. 그러나 죽은 세포 핵 인 조직 제어에 주로 존재 하는 경우, 실험 포기 되어야 한다.
그림 5 는 인간의 폐 조직에 HClPt와 SLS의 immunomodulatory 효과 대 한 대표적인 데이터를 표시합니다. 프로 염증 성 cytokines 일리노이-1α 및 TNF-α는 염증에 노출 된 후 염증 성 프로세스의 시작을 나타내는의 생체 물질을 자극. 두 cytokines는 ELISA에 의해 측정 되었다. Extracellular IL 1α는 세포내 IL 1α 1000 pg/mL의 위 수준에 도달 하는 반면 인간의 웹에서 일반적으로 낮은. 세포내 IL 1α 감소 지속적인 세포 독성 프로세스-나타내고 인간의 웹의 화학 물질에 노출 후 주로 관찰 된다. 조직 LPS로 자극 하는 경우 활성기의 타고 난 면역 체계와 같은 긍정적인 치료 통제, 다음 유도 IL 1α의 대부분을만 24 시간 후 침 검출 될 수 있다. 반면에, LPS 자극에 의해 유도 하는 TNF-α 분 비 주로 측정할 수 있습니다 extracellularly. LPS와 같은 적합 한 긍정적인 컨트롤의 사용 방법의 타당성을 보여줍니다. 현재 연구 방법으로 인간의 웹 HClPt (32, 64, 및 125 µ g/mL)의 3 개의 농도 또는 24 h. Cytokine 분 비 세포 외 및 세포내 cytokines의 합으로 결정 했다에 대 한 SLS (1, 10 µ g/mL)의 2 개의 농도에 노출 됐다 그림 5에서 같이 총 단백질 농도를 정상화. 그러나 그것은 BCA 분석 결과 총 단백질 함량의 결정에 대 한 일반적으로 사용 된다,, 그것은 또한 물질 유도 된 세포 독성을 반영 여기 언급 가치가 있다. 따라서, 높게 유독한 농도에서 cytokine 데이터의 정규화에 대 한 총 단백질 콘텐츠를 사용할 수 없습니다. IL 1α의 분 비 증가 크게 263 ± 38 pg/mg에서 887 ± 216 pg/mg와 TNF-α에 대 한 263 ± 38 pg/mg에서 1160 ± 286 pg/mg (그림 5A, B). 또한, LPS 유발 IL 1α 및 TNF-α 분 비 unstimulated 조직 제어에 비해 제공 됩니다. 병원 체 관련 된 분자 패턴, LPS, 등으로 프로 염증 성 cytokines의 유도 방법의 타당성 및 고 immunomodulatory 효과 조사 하기 위해 인간의 웹 작업할 때 사용 하는 것이 좋습니다. 에 대 한 자세한 내용은 HClPt 및 SLS 데이터, 참조 하십시오 연구를 Lauenstein 그 외 여러분 에 의해 21
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig1.jpg"> 그림 1 : 인간의 폐 소재를 채우는 절차. 인간의 폐 절제 후 즉시 준비 된다. 폐는 일관 된 작성 agarose와을 피하기 위해 작성 하는 동안 갑자기 agarose 중 합을 위한 실내 온도에 저장 되어야 합니다. 폐는 주요 기관지 또는 기관지 (A &amp; B 기관지에 근접 촬영을 위한)에 최적의 보기 위해 밖으로 확산 하는 돌출부와 가로로 배치 됩니다. 기관지 유연한 실리콘 튜브와 cannulated 되며 고정 클램프 (C). 충전 절차 및 agarose 중 합 조직에서 후 훈련된 병리학 폐 3-5 cm 두께 (D)에 대 한의 조각으로 잘라. 이러한 조각에서 원통형 조직 코어 (Ø 예를 들어, 8 m m)는 coring 도구 (E)을 준비 하 고 있다. 이러한 조직 코어 매체 가득 접시 정상 세포 배양 조건 (E)에서 부 화에 대 한로 전송 즉시 웹에 조직 슬라이서와 절단 됩니다. 후 여러 세척 단계는 웹 잔여 세포 파편 및 출시 셀 중재자 (F) 제거 세포 배양 배지 (예를 들어, 24-잘 잘하고 500 µ L 매체 당 두 개의 웹 판)로 전송 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig2.jpg"> 그림 2 : H &amp; E 염색에 의해 인간의 웹의 건강 상태의 결정. 폐 종양과 기증자에서 준비 하는이 이미지에 웹 보여줍니다 치경 실질으로 그대로 폐 조직 주변 항공 (*)과 혈관 (화살촉) 개요 (A). 더 높은 확대, 항공 그대로 ciliated 호흡기 상피 (화살촉) (B), 수많은 적혈구 (화살촉) (C)와 모 세관을 포함 하 여 가능한 pneumocytes 늘어서 그대로 치경 구조와 실시 치경 공간 치경 대 식 세포 (CD68 immunohistochemistry)를 포함 (D), 그대로 피 (CD31 immunohistochemistry)와 혈관 뿐만 아니라 (E)를 관찰할 수 있다. 만 조직 종양-무료 아무 거시적 질병 영역은 표시 하는 이유는 웹에 대 한 사용 되었다. 웹 달리 기종 같은 다른 폐 질환과 기증자에서 준비 또는 섬유 증, 치경 구조를 방해 하지는 웹은 약간 외부 보더, 대부분 준비 단계 때문에 마모 됩니다. 스케일 바 1000 µ m (A)와 50 µ m (EB-), 각각 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig3.jpg"> 그림 3 : 문화 매체로 LDH 효소의 누설 (A)와 서 부 표준시-1 (B) 염료와 평가 하는 대사 효소 활동의 손실에 의해 인간의 웹에 SLS에 의해 유도 된 세포 독성의 측정. 인간의 웹 SLS의 농도 증가에 노출 되었다. Sigmoid 농도-응답 모델은 IC75 또는 IC50 값 (억제 농도에서 세포 생존 능력의 25% 및 50% 감소) 계산된 (오른쪽 그림) 될 수 있도록 데이터를 연속적으로 장착 됩니다. 데이터는 ± SEM을 의미 하는 대로 표시 됩니다 n = 3-5. 492에서 LDH 분석 결과의 흡 광도 측정 했다 nm (630에서 참조 nm)와 서 부 표준시-1 450에 분석 결과의 nm (630에서 참조 nm). 데이터 적응 되었고 Lauenstein 그 외 여러분 에서 수정 21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig4.jpg"> 그림 4 : 인간의 웹의 3 차원 미세 얼룩 및 이미지 렌더링의 대표 이미지. 살아있는 조직 제어 및 조직의 효과적인 독성 물질, 세제, 응답 속도 표시 됩니다 calcein 오전와 인간의 웹 (노란색) 및 EthD-1 얼룩 후 (빨간색). 30 µ m의 10 X 목표 (A)와 함께 촬영 했다와 (B)를 렌더링 합니다. 눈금 막대는 100 µ m. 여기 파장 488 nm 및 543 nm, 방출 필터 BP 505-550 nm와 LP 560 nm를 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig5.jpg"> 그림 5 : 암모늄 hexachloroplatinate (HClPt)-유도 IL 1α 및 TNF-α 분 비 인간의 웹에 24 시간 노출 후. 웹 3 농도 (32 µ g/mL, 64 µ g/mL, 및 HClPt의 125 µ g/mL)와 SLS의 두 개의 다른 농도 (1 µ g/mL와 10 µ g/mL)에 노출 되었다. Extracellular 세포내 IL 1α (A)와 TNF-α (B) ELISA에 의해 결정 되었고 총 단백질 함량에 정규화. 표시 방법의 유효성을 타고 난 면역 계통, LPS의 긍정적인 활성 세포내 IL 1α (A)에 대 한 고 extracellular TNF-α (B) 출시, 총 단백질 콘텐츠를 정규화 된 참조로 표시 됩니다. 데이터는 ± SEM을 의미 하는 대로 표시 됩니다 *p &lt; 0.05와 * * *p &lt; 0.001; HClPt와 SLS: n = 9, IL 1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 기술 중복 (맨-휘트니 테스트)에서 4. 이 그림 Lauenstein 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig1.jpg"> 보충 그림 1: 미세한 생존 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 얼룩의 이미지에 대 한 자세한 계산 처리. Calcein-얼룩진 가능한 조직 (A-G, 나)의 표면 렌더링 및 브로민 homodimer 스테인드 세포 핵 (H, 의 자리 검출을 위한 업로드 LSM 이미지의 이미지 분석을 위한 단계별 절차 J-M). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig2.jpg"> 보충 그림 2: 인간의 폐 조직의 얼룩이 지기 현미경 생존의 전산 이미지 분석의 개요. 실행 가능한 조직 (노란색) 표면 렌더링 (B-I)에 의해 분석 하 고 죽은 세포 핵 (적색) 자리 탐지 (J-P)에 의해 감지 되었다. 스냅숏 모드 이미지 (Q)을 내보내는 데 사용 되었다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

3Rs 원리에 비추어 호흡기 모델 동물 연구 대안으로 진화 됩니다. 특히 호흡 물질의 위험 평가 대 한 적절 한 분석의 부족이 이다. 여기, 우리는 공 수 물질의 평가 대 한 인간의 정밀 컷 폐 슬라이스를 사용 하 여를 설명합니다.

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

이 인체 정밀 절단 폐 절편의 3차원 모델의 전반적인 목표는 인간 조직을 사용하여 생체 외 모델에서 세포 독성 및 면역 조절 효과를 평가하는 것입니다. 이러한 방법은 안전성을 평가하고 토착 인간 환경의 물질에 대한 생리학적 반응을 평가하는 데 도움이 되도록 약리학 및 독성학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신선하고 생존 가능한 인간 조직을 사용하여 세포 독성 또는 면역 조절 효과와 관련하여 인간 호흡기 질환을 모방할 수 있다는 것입니다.이 방법은 인간의 세포-세포 상호 작용, 생리학 및 병리 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 호흡기 질환에서는 다른 응용 분야뿐만 아니라 다른 종에도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 인체 조직을 평가하고 신뢰할 수 있는 인프라를 구축하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 더욱이, 충전 과정은 폐의 이질성으로 인해 많은 훈련과 경험이 필요합니다.이 절차를 시작하려면 실리콘 튜브를 삽입하고 튜브와 평행한 클램프로 고정하여 클램프가 조직을 끼이지 않고 실리콘 튜브와 함께 함께 짜내도록 하여 기관을 캐뉼레이트합니다.다른 모든 기관지, 혈관 및 부상을 클램프로 닫아 충전 절차 중에 아가로스가 누출되지 않도록 합니다. 주요 기관지를 캐뉼러화하기 위해서는 좋은 해부학적 기술이 필요합니다.폐가 너무 많이 확장되어서는 안 되며, 그렇지 않으면 조직이 산만해지며, 조직이 충분히 채워지지 않으면 조직이 너무 부드럽기 때문에 PCLS를 만들 수 없습니다. 그런 다음 비이커에서 등가량의 3% 저겔화 아가로스와 배양 배지를 혼합합니다. 15ml 주사기를 사용하여 혼합물을 폐에 주입합니다.주사기에 매체를 다시 채우기 전에 손가락이나 클램프로 카테터를 클램프로 닫아 기포와 아가로스 역류를 방지합니다. 폐 조직을 3-5cm 조각으로 자릅니다. 티슈 슬라이서에 얼음처럼 차가운 EBSS 400ml를 채웁니다.즉시 코어링 도구와 함께 반자동 드라이버를 사용하여 폐 슬래브에서 원통형 조직 코어를 잘라냅니다. 그런 다음 조직 코어를 조직 슬라이서의 조직 홀더로 옮깁니다. 조직 코어 위에 추를 놓고 조직 코어를 PCLS로 자르기 시작합니다.매체는 유리 실린더의 클램프를 열어 조직 슬라이서에서 비커로 배출해야 합니다. 다음으로, 비커에서 배양 배지를 사용하여 페트리 접시로 슬라이스를 옮깁니다. 그런 다음 페트리 접시를 인큐베이터에 넣고 세척 단계 전에 배지를 예열하십시오.그런 다음 폐 슬라이스를 웰당 두 조각에 대해 최소 500마이크로리터의 배양 배지가 있는 24웰 배양 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 작업 용액의 마스터 믹스를 준비하려면 각 웰에 대해 25마이크로리터의 WST-1 시약과 225마이크로리터의 배지를 희석합니다. 다음으로, WST-1의 마스터 믹스 작업 용액을 각 웰에 대해 250 마이크로 리터의 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다.배양 중에 PCLS가 WST-1 시약으로 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 그런 다음 플레이트를 200RPM의 궤도 셰이커에 놓고 WST-1 시약이 완전히 혼합되도록 30초 동안 조심스럽게 흔듭니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 각 웰에서 100마이크로리터의 상층액을 바닥이 평평한 새 96웰 플레이트로 복제하여 피펫팅합니다.마이크로플레이트 리더를 사용하여 450나노미터에서 각 웰의 흡수를 측정하고 450나노미터에서의 흡수율에서 630나노미터 기준에서의 흡수를 뺍니다. 테스트 에이전트의 유무에 관계없이 PCLS를 배양한 후 50마이크로리터의 상등액을 복제하여 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. 이것은 24웰 플레이트의 처리된 각 웰에서 복제본을 생성합니다.분석 직전에 96웰 플레이트에 대해 125마이크로리터의 촉매 용액과 6.25밀리리터의 염료 용액을 철저히 혼합하여 LDH-free 제제의 작업 용액의 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음, 50 마이크로 리터의 마스터 믹스 작업 용액을 이미 50 마이크로 리터의 상등액을 함유 한 각 웰에 피펫팅합니다. 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.그런 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 492나노미터에서 각 웰의 흡수를 측정하고 492나노미터에서의 흡수에서 630나노미터 기준에서의 흡수를 뺍니다. 미시적 평가를 위해 cLSM을 사용하여 무작위로 분포된 Z 스택을 두 개 이상 수행합니다. Ocular 탭을 클릭하여 10폴드 대물렌즈를 선택합니다.온라인을 클릭하여 cLSM을 표준 광학 현미경으로 사용하여 PCLS의 표면을 찾습니다. 그런 다음 오프라인을 클릭하여 안구 설정을 종료합니다. 그런 다음 Acquisition 탭을 클릭하고 형광단에 적합한 레이저를 켭니다.Acquisition 탭에서 Light Path를 클릭하고 실험에 필요한 필터와 미러를 설정합니다. 라이브 버튼을 눌러 화면에서 해당 레이어의 라이브 뷰를 봅니다. 초점을 위 또는 아래로 움직여 날카로운 신호가 있는 PCLS 표면을 찾습니다.그런 다음, 적색 에티듐 호모디머-1 채널의 핀홀을 하나의 공기 단위로 설정하여 집광 효율과 광학 절편의 효율성을 최대한 유지하고 그에 따라 칼세인 채널을 조정합니다. 게인의 감지된 신호를 높입니다. 디지털 오프셋을 늘리거나 줄여 활성화된 채널 색상 잠금 테이블이 있는 라이브 이미지에서 파란색으로 나타나도록 배경을 조정합니다.Z-stacks 상자를 선택하여 미시적 부피의 상한 및 하한을 설정합니다. 30마이크로미터 범위에 도달할 때까지 초점을 천천히 위 또는 아래로 이동하고 마지막으로 설정을 눌러 저장합니다. 그런 다음 Live를 다시 한 번 클릭하여 라이브 이미지를 비활성화하고 Start Experiment를 눌러 이미징을 시작합니다.여기에 표시된 것은 PCLS의 미세한 생존 가능성 이미지로, 효과적인 독성 물질인 세제에 대한 인체 조직의 반응성을 보여줍니다. 독성 영향은 ethdium homodimer-1 양성 세포핵과 비교하여 calcein 양성 조직을 평가하여 시각적으로 평가합니다. 인간 폐 조직의 생존 가능성은 기증자에 따라 다르지만, 생존 가능한 조직과 비교한 사멸 세포 핵의 수는 조직 대조군의 15%를 초과해서는 안 됩니다.이 그림은 인간 폐 조직에 대한 SLS인 암모늄 헥사클로로플라티네이트의 면역 조절 효과에 대한 대표적인 데이터를 보여줍니다. 세포외 및 세포내 IL-1 알파 및 TNF-알파는 ELISA에 의해 결정되고 총 단백질 함량으로 정규화되었습니다. 개발 후 이 기술은 약리학 및 기초 과학 분야의 연구자들이 생존 가능한 인간 폐 조직 내의 생리학적 반응을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 절차에 따라 기관지 확장 약물 효능과 같은 추가 질문에 답하기 위해 기도 수축과 같은 다른 종점을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간의 정밀하게 절단된 폐 절편을 생성하고 처리하는 방법에 대한 일반적인 이해를 하게 될 것입니다. 이 기술은 일단 숙달되면 6-8시간 이내에 완료할 수 있으며 적절하게 수행되면 처음 24시간 이내에 첫 번째 결과를 얻을 수 있습니다.그러나 사람이 고정되지 않은 물질로 작업하는 것은 전염성이 있을 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호복과 같은 예방 조치를 착용해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 또한 가능한 한 멸균 상태에서 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 고립된 인간의 폐를 아가로스로 팽창시키고 인간의 정밀하게 절단된 폐 절편을 준비하는 절차를 설명합니다. 준비된 체외 폐 절편은 추가 면역학 실험에 사용할 수 있습니다.

아가로스 기반 인체 정밀 절단 폐 절편 준비

이 비디오는 WST-1 분석을 통해 인간의 정밀 절단 폐 절편에서 세포 독성을 평가하는 기술을 보여줍니다. 인간의 정밀하게 절단된 폐 절편은 세포 독성을 정량화하기 위해 세포 독성 화학 물질의 증분 농도에 노출됩니다. 색상 강도의 감소는 화학 물질이 폐 세포에 미치는 해로운 영향을 확인하는 역할을 합니다.

인간의 정밀 절단 폐 절편에서 화학적으로 유도된 세포 독성을 측정하기 위한 분석

이 비디오는 테스트 물질의 세포 독성 효과와 인체 정밀 절단 폐 절편에서 막 무결성에 미치는 영향을 측정하기 위한 젖산 탈수소 효소, LDH 분석을 보여줍니다. 이 분석은 샘플의 세포 사멸 또는 손상에 대한 정량적 측정을 제공합니다.

Lactate Dehydrogenase Assay를 통한 폐 절편의 세포 독성 및 막 무결성 평가

최적화된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 생체 외 분석을 사용하여 가연성 담배 제품 제제가 수용체 매개 세포 내 분비 사이토카인과 효과기 PBMC의 세포 용해 능력을 현저하게 억제하는 것으로 나타났습니다. 이러한 신속한 분석은 제품 평가 및 담배 노출의 잠재적인 장기 영향을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기

우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

이 프로토콜에서는 이미지 거주 종양 침투 CD8 T 세포 인간 폐 종양 조각 내 붙일 결합 된 항 체와 함께 표시 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 CD8 T 세포 이동의 실시간 분석을 허용 한다.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

여기, 우리는 생물 학적 및 생물 의학 연구에 모델 인간의 폐 질병에 3D 폐 조직 문화를 생성 하는 데 적합 한 절제 환자 조직에서 인간의 정밀 컷 폐 agarose 가득 조각의 준비에 대 한 프로토콜 제시.

질병 모델링에 대 한 인간의 3D 폐 조직 문화 (3D-Ltc)의 생성

이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.

폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화

여기에 제시된 PCLS 뮤린 폐 조직의 혈관 수축을 보존하기 위한 프로토콜이 있으며, 그 결과 수많은 절차에 취약한 최대 10일 동안 보존될 수 있는 폐 혈관 및 기도의 정교한 입체 이미지가 생성된다.

정밀 절단 폐 슬라이스는 전 생체 폐 혈관 구조 및 수축 연구를위한 효율적인 도구로

본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.

정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구

마우스 간 연구를 위한 PCLS(Precision-cut Liver Slices)의 생산 및 배양을 위한 프로토콜입니다. 이 기사는 비브라톰에 액세스할 수 있는 표준 실험실 장비만 필요하고 최소 4일 동안 PCLS의 생존을 허용하는 프로토콜의 주요 측면에 중점을 둡니다.

정밀하게 절단된 간 절편의 생산 및 배양을 위한 최적화되고 단순화된 기술

배우세요 인간 정밀 절단 폐 조각(PCLS)을 이용한 세포 독성 및 면역 조절 효과 평가 방법을. 이 기술은 호흡기 질환 모델링 및 공기 중 물질의 안전성 평가에 활용됩니다.

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과

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