Vasculogenesis의 운동 분석 역학 Vasculogenesis 및 신생에서 생체 외에서 의 단정

이 실험 방법의 전반적인 목표는 시간이 지남에 따라 혈관 형성의 역동적인 과정을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 혈관 형성 속도와 형성된 네트워크 구조 패턴 간의 차이에 대한 혈관 형성 및 혈관 형성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 혈관 형성 시점을 정량화할 수 있어 혈관 형성 과정의 동역학을 평가할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다.

이 방법은 개별 세포 집단 또는 공동 배양 시스템 연구를 위해 혈관 형성 또는 혈관 형성 과정에 영향을 미치는 모든 세포 집단 또는 병리학적 상태에 적용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 약 1-2시간 전에 Microscope Stage Top Incubator를 섭씨 37도로 예열하고 이산화탄소를 5%로, 습도를 85%로 설정합니다.인큐베이터의 습도 저장소가 비어 있는 경우 물을 채웁니다. 살아있는 세포 챔버를 현미경에 놓은 다음 라이브 셀 챔버 내의 두 개의 열린 위치 중 하나에 빈 챔버 슬라이드를 놓습니다.

슬라이드에 증류수를 채우고 보조 송풍기를 섭씨 39-42도로 설정하여 슬라이드를 아래에서 가열하고 결로를 최소화합니다. 라이브 셀 이미징 챔버 내에서 적절한 온도와 습도를 유지하는 것은 실험의 성공에 매우 중요합니다. 실험 슬라이드를 추가할 수 있을 때까지 두 번째 슬라이드를 공백으로 추가합니다.

그런 다음 두 번째 슬라이드의 우물을 둘러싼 저수지에 물을 추가하여 이미징 실험 중 조건을 모방합니다. 실험 챔버 슬라이드에 기저막 매트릭스를 로드하려면 먼저 20마이크로리터 피펫에 차가운 20마이크로리터 피펫 팁을 로드하고 가위를 사용하여 팁 끝에서 약 1cm를 자릅니다. 피펫 부피를 10마이크로리터보다 약간 크게 설정하고 매트릭스를 변형된 피펫 팁으로 천천히 흡입합니다.

즉시 피펫 팁을 하나의 슬라이드 웰 중앙에 놓고 팁을 웰 바닥에 부드럽게 터치하고 플런저를 천천히 눌러 매트릭스를 밀어냅니다. 15개의 웰 모두에 매트릭스를 추가한 후 뚜껑을 슬라이드 위로 끝까지 밀어 넣습니다. Matrigel 부피를 각 웰에 정확하고 일관되게 피펫팅하는 것은 고품질 위상차 이미지를 얻는 데 매우 중요합니다.

그런 다음 매트릭스 탈수를 줄이기 위해 2-3ml의 PBS로 채워진 50ml 원추형 튜브 캡 옆에 슬라이드를 섭씨 37도에서 30-60분 동안 놓습니다. 매트릭스가 응고되면 하룻밤 배양된 내피 집락 형성 세포 배양에서 상층액을 제거하고 7ml의 PBS로 세포를 세척합니다. PBS 세척을 흡인하고 섭씨 37도에서 2-5분 동안 섭씨 3-3밀리리터의 트립신으로 세포를 분리합니다.

그런 다음 해리된 세포를 3ml의 Endothelial Growth Medium-2에 재현탁시켜 세포 덩어리를 분해하고 생성된 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 전달합니다. 모든 내피 집락 형성 세포 샘플이 재현탁된 후, 원심분리로 세포를 펠렛화하고 펠릿을 1-2ml의 새로운 내피 성장 배지에 재현탁합니다. 각 샘플에서 생존 가능한 세포의 수를 세고 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 충분한 내피 집락 형성 세포를 추가하여 세포를 175 마이크로 리터의 중간 농도 당 1.4 곱하기 10에서 네 번째 세포로 희석할 수 있도록 합니다.

그런 다음 각 마스터 믹스를 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다. 슬라이드 뚜껑을 제거하고 웰당 각 마스터 믹스 50마이크로리터를 슬라이드에 세 번 양보합니다. 세포를 이미지화하려면 빈 슬라이드를 하나의 실험용 슬라이드로 교체하고 슬라이드의 세포를 둘러싼 저장소에 물을 추가합니다.

각 스테이지 위치를 순환하고 첫 번째 웰의 중심이 선택되었는지 확인합니다. 웰에 도금된 셀에 초점을 맞추고 스테이지의 Z 위치를 설정합니다. 설정이 정확하면 조명을 끄고 이미징 실험을 시작합니다.

이미징이 완료되면 이미지 캡처 소프트웨어 내에서 이미지 스택 파일의 크기를 조정하고 내보내 분석을 위해 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 이미지를 분석하려면 폴더에서 Kinetic Analysis of Vasculogenesis 파일을 소프트웨어 창 하단의 회색 막대로 끌어다 놓아 소프트웨어를 열고 저장을 클릭하여 소프트웨어를 목록에 추가합니다. 파일 및 열기를 클릭하여 열려는 이미지 파일을 선택하거나 이미지 파일을 소프트웨어 내의 회색 막대로 드래그합니다.

이미지(Image), 조정(Adjust) 및 밝기/대비(Brightness/Contrast)를 클릭하여 밝기/대비(Brightness/Contrast) 창을 엽니다. Brightness/Contrast 창에서 Reset을 클릭하여 이미지를 시각화합니다. 그런 다음 이미지, 유형 및 8비트를 클릭하여 이미지를 8비트로 변환합니다.

도구 및 관심 영역 관리자를 선택하고 적절한 모양의 선택 도구를 사용하여 새 관심 영역을 만듭니다. 추가를 클릭하여 관심 영역 셰이프를 관심 영역 관리자 창에 추가하고 관심 영역 관리자에서 관심 영역 레이블을 클릭하여 이미지에서 영역을 봅니다. 필요에 따라 관심 영역을 조정합니다.

영역이 배치되면 Image(이미지)를 클릭한 다음 Crop(자르기)을 클릭하여 이미지를 자릅니다. 그런 다음 편집 메뉴를 열고 외부 지우기를 선택하여 스택의 모든 이미지에 대한 관심 영역 외부의 이미지 데이터를 삭제합니다. 그런 다음 플러그인 메뉴를 열고 네트워크 분석 플러그인을 선택합니다.

팝업 창의 드롭다운 화살표를 사용하여 임계값 설정 방법을 변경하고 확인을 클릭하여 소프트웨어 처리를 시작합니다. 분석이 끝나면 데이터 테이블과 스켈레톤 및 마스크 표현물을 묘사하는 융합 이미지 스택이 열립니다. File and Save As(다른 이름으로 저장)를 클릭하여 숫자 값을 스프레드시트로 전송하고 원시 데이터 값이 포함된 스프레드시트를 저장합니다.

융합된 스켈레톤과 마스크 이미지를 클릭하고 융합된 스켈레톤 마스크 이미지 스택과 잘린 위상차 이미지 스택을 TIFF 파일로 저장합니다. 그런 다음 Region Of Interest Manager(관심 영역 관리자) 창을 클릭하고 이미지를 자르는 데 사용되는 관심 영역을 선택한 다음 More(추가) 및 Save(저장)를 클릭하여 나중에 사용할 수 있도록 관심 영역을 저장합니다. Kinetic Analysis of Vasculogenesis에 의해 식별된 내피 집락 형성 세포 네트워크는 정량화를 위해 소프트웨어에서 사용하는 구조를 설명하기 위해 Skeleton 및 Mask renditions로 그림으로 표시됩니다.

위상차 이미지의 품질이 높고 충분한 contrast가 달성되면 Kinetic Analysis of Vasculogenesis는 위상차 이미지와 Kinetic Analysis of Vasculogenesis에서 생성된 Skeleton and Mask 렌디션 사이에서 관찰된 유사성에서 알 수 있듯이 내피 집락 형성 세포 네트워크를 정확하게 식별합니다. 위상차 이미지의 콘트라스트가 높지 않거나 그리드와 같은 이미징 아티팩트가 발생하면 네트워크 감지 정확도가 떨어지고 결과가 모호해집니다. 그러나 여기에 표시된 Mean 및 Otsu와 같은 다른 임계값 방법은 이미지 품질의 차이를 수용하기 위해 소프트웨어 드롭다운 메뉴에서 분석하기 전에 선택할 수 있습니다.

혈관 형성의 동역학 분석을 사용하여 임신성 당뇨병에 노출된 내피 집락 형성 세포가 네트워크 형성의 변경된 동역학을 나타내는지 확인하면 합병증이 없는 임신으로 인한 내피 집락 형성 세포 배양과 비교하여 임신성 당뇨병 배양에서 이질적으로 변경된 네트워크 구조 형성을 보여줍니다. 실제로, 복잡하지 않은 임신 샘플은 일반적으로 임신성 당뇨병 샘플에 비해 더 많은 수의 폐쇄 네트워크를 형성합니다. 그러나 모든 내피 집락 형성 세포 샘플은 형성 속도와 달성된 네트워크의 최대 수가 샘플에 따라 다르지만 전반적으로 네트워크 형성의 이위상 패턴을 나타냅니다.

이 절차에 따라 Kinetic Analysis of Vasculogenesis에 의해 생성된 데이터 값을 그래프로 작성하고 분석하여 서로 다른 샘플에 의해 형성된 네트워크 구조가 통계적으로 다른지, 그렇다면 어느 시점에 다른지 확인할 수 있습니다. 혈관 형성의 역학 분석을 통해 많은 수의 이미지가 포함된 타임 랩스 실험을 효율적으로 처리할 수 있습니다. 일단 마스터하면 모든 시스템이 제대로 작동하는 경우 이미지 획득, 후처리 및 분석을 이틀 안에 완료할 수 있습니다.