마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜
2019년 8월 30일
이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.
이 프로토콜은 단일 밀도 그라데이션을 사용해야 하므로 보다 복잡한 기존 islet 격리 방법에 비해 노동 집약적이고 비용 효율이 훨씬 낮습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 효소가 췌장에 직접 전달되어 조직 소화가 향상되고 배회 수율이 증가한다는 것입니다. 먼저 마우스의 팔다리를 supine 위치에 테이핑하고 70%에탄올로 바디를 분사합니다.
커버글래스 집게와 구부러진 수술 용 가위를 사용하여 약 3센티미터의 수평 복부 피부 절개를 하고 피부를 열어 복부 벽을 노출시합니다. 췌장을 완전히 노출시키고 해부 현미경 아래에 마우스를 배치하기 위해 복부 복막에 3 ~ 4 센티미터 수직 절개를합니다. 간 엽을 우월하게 밀어 창백한 분홍색 튜브로 나타나는 담관을 노출시키고 내장을 오른쪽 요추와 장강 부위에서 복강 오른쪽으로 부드럽게 이동하여 담관과 간 동맥을 노출시합니다.
Schwartz 마이크로 세정제를 사용하여 가능한 한 간과 가까운 일반적인 담관을 조심스럽게 고정하고 십이지장 유두에 위치하고 췌장 덕트와 일반적인 담관의 조합에 의해 형성된 바터의 암풀라를 식별합니다. 마이크로 Adson 집게를 사용하여 일반적인 담관을 당기려면, 갓 준비된 콜라게나아제 P 용액 3밀리리터를 포함하는 3밀리리터 주사기에 부착된 30 게이지 반인치 바늘을 배의 길이의 약 1/4동안 용기에 평행하게 밀어넣는 바터의 암풀라에 삽입한다. 바늘이 제자리에 있으면 마이크로 Adson 집게로 바늘을 안정시키고 천천히 꾸준히 콜라게나아제 P 용액 3 밀리리터를 덕트에 주입하십시오.
주사는 췌장의 머리, 목, 바디 및 꼬리 영역이 완전히 팽창되는 경우에 성공한 것으로 간주됩니다. 암풀라에 적절한 입력과 일반적인 담관의 캐누레이션은 성공적인 소화 수확에 매우 중요합니다. 덕트 벽을 관통하면 격리의 효능이 줄어듭니다.
곡선 및 마이크로 Adson 집게를 사용하여 비장에서 시작하여 위장과 십이지장을 따라 계속 팽창 된 췌장을 조심스럽게 꺼냅니다. 그런 다음 3 밀리리터의 얼음 차가운 콜라게나아제 P 용액을 포함하는 50 밀리리터 소화 튜브에 췌장을 놓습니다. 섬을 수확하려면 먼저 미세 수술 가위를 사용하여 췌장을 3~5초 간 자른 후 12~13분 동안 분당 100~120회전에서 37도의 수수욕조에 튜브를 배치합니다.
인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 미세 모래 와 같은 췌장 조직 입자에 의해 확인된 바와 같이 용액이 균질 될 때까지 조직을 중단하기 위해 약 30 초 동안 튜브를 흔들어. 조직이 소화되는 즉시 튜브를 얼음 위에 놓고 40 밀리리터의 얼음 콜드 스톱 용액을 추가하여 효소 반응을 종료합니다. 펠릿을 부드럽게 방해한 후, 스윙 버킷 원심분리기에서 소화된 조직을 스핀다운한 다음, 세척당 20밀리리터의 신선한 스톱 용액을 가진 2개의 원심분리기가 있습니다.
마지막 세척 후, 마지막 세척 후, 3 개의 추가 세척에 대 한 얼음 차가운 HBSS의 40 밀리 리터에 펠 릿을 다시 중단, 마지막 세척 후 실온 밀도 그라데이션 솔루션의 5 밀리 리터에 펠 릿을 다시. 용액이 균질화 될 때까지 튜브를 저속으로 잠시 소용돌이로 간결하게 한 후 실내 온도 밀도 그라데이션의 5 밀리리터를 튜브에 추가합니다. 이제 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 10 밀리리터의 실온 HBSS를 드롭 와이즈 방식으로 튜브에 부드럽게 천천히 추가하여 그라데이션의 형성을 허용하고 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 밀도 그라데이션 분리에 의해 세포 집단을 격리시킵니다.
원심분리의 끝에서, 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 차가운 HBSS를 사용하여 밀도 그라데이션과 HBSS 사이의 섬 층의 5~10 밀리리터를 수집합니다. 섬들을 신선한 얼음 차가운 HBSS 20 밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 스윙 버킷 원심분리기에서 원심분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄의 마지막 3밀리리터를 제외한 모든 것을 조심스럽게 흡인시키고 세척당 20 밀리리터의 신선한 HBSS로 적어도 세 번 이상 섬을 씻으십시오.
마지막 세척 후, 37섭씨 RMPI 1640 배지의 4밀리리터로 상퍼를 교체하고 튜브를 부드럽게 소용돌이어 펠릿을 빼냅니다. 즉시 100mm 페트리 접시에 섬을 붓고 다른 섬과 함께 세척을 풀링 남아있는 섬을 수집하기 위해 신선한 RPMI 1640 매체의 다섯 밀리리터로 튜브를 씻어. 그런 다음 해부 현미경과 20 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 페트리 접시의 매끄러운 표면이있는 건강한 구형 또는 직사각형 황금 갈색 섬을 선택하여 완전한 RPMI 1640 배지 10 밀리리터를 포함하는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다.
모든 섬이 수집되면 섬섬을 멸균 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소5%를 밤새 가습공기에 넣습니다. 좋은 건강한 섬은 매끄러운 둥근 모양을 가지고 있는 것처럼 보이며 손상된 섬은 거친 가장자리를 나타낸다. 소화되지 않은 외분 조직은 외관에 반투명하고 불규칙한 모양을 보여줍니다.
콜라게나아제 P 효소의 적절한 수분 및 분포는 췌장의 비장 부분의 인플레이션에 의해 확인될 수 있다. 낮은 포도당 매체에서 하룻밤 잠복은 섬의 인슐린 분비 용량에 대한 통찰력을 허용하는 다음 날에 포도당 자극 인슐린 분비 분석섬을 프라임 할 수 있습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
이 기사는 향상된 조직 소화 및 아일렛 수율을 위해 콜라게나제 주사를 활용한 새로운 아일렛 분리 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 기울기 분리 과정을 단순화하여 마우스 당 250–350개의 고품질 아일렛을 성공적으로 분리할 수 있게 합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 아일렛 분리 기술
배경
- 아일렛 분리는 당뇨병 연구에 매우 중요합니다.
- 기존 방법은 노동 집약적이고 비용이 많이 들 수 있습니다.
- 개선된 기술은 아일렛의 수율과 기능성을 향상시킬 수 있습니다.
- 콜라게나제 주사는 직접적으로 췌장을 타겟팅합니다.
연구 목적
- 노동 집약적이지 않은 아일렛 분리 프로토콜을 개발하기 위해.
- 마우스 췌장에서 기능적인 아일렛의 수율을 증가시키기 위해.
- 아일렛 품질을 유지하면서 절차를 단순화하기 위해.
사용된 방법
- 아일렛 정제를 위한 단일 밀도 기울기.
- 외분비 조직의 효소 소화.
- 분리된 아일렛의 손으로 따기.
- 췌장을 노출시키기 위한 수술 기술의 사용.
주요 결과
- 향상된 조직 소화는 더 높은 아일렛 수율로 이어집니다.
- 프로토콜은 마우스 당 250–350개의 고품질 아일렛을 생산합니다.
- 기존 방법에 비해 노동 집약적이지 않습니다.
- 아일렛 분리를 위한 비용 효율적인 접근법입니다.
결론
- 새로운 프로토콜은 아일렛 분리 효율성을 크게 개선합니다.
- 직접적인 효소 전달은 전반적인 수율과 품질을 향상시킵니다.
- 이 방법은 당뇨병에 대한 추가 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Pancreatic islet isolation is a critical bottleneck in diabetes research, where low yield and labor-intensive protocols limit throughput for target validation and mechanistic studies. This protocol enhances predictive confidence by delivering collagenase P directly to the ampulla of Vater, enabling more complete enzymatic and mechanical digestion of exocrine tissue. The resulting increase in islet yield and quality supports reliable ex vivo insulin secretion assays, directly informing lead identification and preclinical model selection for diabetes therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of β-cell function and insulin secretion pathways through high-yield islet recovery.
- Operational Value: Reduces technical barriers to islet access, supporting consistent target validation across multiple mouse strains or disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces islets suitable for glucose-stimulated insulin secretion assays, providing quantitative readouts for compound screening.
- Operational Value: Simplifies purification via a single density gradient, improving assay standardization and reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by providing primary islets that maintain endocrine function for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical work by delivering islets ready for functional validation in diabetic models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary islets for downstream applications in lead identification and preclinical validation, particularly for diabetes-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of insulin secretion mechanisms through access to functional islet populations.
- Screening: Delivers standardized islet preparations enabling reliable compound evaluation in secretion assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., insulin release) that help compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant islets for validation in diabetic models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability that reduces dependency on external suppliers and increases internal assay throughput.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in islet function.
- Operational Value: Standardization and scalability via simplified single-gradient purification and direct enzyme delivery.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in diabetes programs by improving success rates of islet-based assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on reliable insulin secretion data from high-yield islet preparations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for pancreatic duct cannulation and tissue handling.
- Depends on access to dissection microscopes, centrifuges, and temperature-controlled water baths for enzymatic digestion.
- Necessitates standardization of collagenase P concentration and incubation timing across operators to ensure consistent islet quality.
- Requires adaptation of gradient volumes and wash protocols when scaling to different mouse strains or ages.
- Practical limitations include potential islet damage from over-digestion, which can be mitigated by optimizing enzymatic exposure time as described in the protocol.
