Name: 마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 학습하세요 마우스 췌도 격리를 위한 간단한 프로토콜로 콜라게나제 주입을 통해 조직 소화를 향상시키고 마우스당 250-350개의 고품질 췌도를 얻는 방법입니다. 이 비용 효율적인 기술은 당뇨병 연구에 필수적입니다.

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우리는 회로도의 그녀의 예술적 그림에 대한 제니퍼 Munguia 씨에게 매우 감사드립니다. 휴스턴의 지역 공영 라디오 방송국 KPFT의 마이클 R. 호니그(Michael R. Honig) 씨에게 편집 지원을 부탁드립니다. 이 연구는 미국 당뇨병 협회 #1-15-BS-177 (YS) 및 NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS)에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 또한 USDA 국립 식량 농업 연구소, 해치 프로젝트 1010840 (YS) 및 R01 DK095118 (SG)에 의해 지원되었다.

여기에 설명된 모든 방법은 텍사스 A&M 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)에 의해 승인되었습니다. 수술 도구 의 필요성은 도 1에 나타내고 절차의 회로도 도면은 그림2에 도시되어 있습니다.
1. 솔루션
<ol><li>1L HBSS(1X)를 만들기 위해 증류수 900mL에 100mL(재고)의 100mL를 추가하여 행크의 균형 잡힌 염분 용액(HBSS)을 준비합니다.</li>
	<li>얼음 차가운 1X HBSS의 450 mL에 100X 태아 소 혈청 (FBS)의 50 mL을 추가하여 STOP 용액을 준비하십시오 (신선하게 만들어야하며 1 시간 이내에 사용해야합니다); 이것은 500 mL STOP 솔루션을 만듭니다. STOP 용액을 4°C로 유지합니다.</li>
	<li>콜라게나제 P 용액을 얼음 차가운 1X HBSS에 1 mg/mL의 콜라게나아제 P를 첨가하여 (사용 후 1시간 이내에 신선하게 만들어야 함)을 준비하십시오. 6 mL/ 마우스를 사용합니다.<ol>
<li>콜라주나제 P 용액에 0.05%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가합니다(이것은 고립된 섬에 영양분을 제공합니다). 예를 들어, 6 mL 콜라게나제 P 용액에 3 mg의 BSA를 사용하십시오. 얼음에보관하십시오.</li>
		<li>하나의 50 mL 튜브에 있는 모든 마우스에 필요한 콜라게나아제 P의 양을 계산하고 준비한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10% FBS를 추가하여 완전한 RPMI 1640 매체를 준비하십시오. 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, INS-1 세포 보충제(10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루바테, 0.05 mM 2-메르카포에탄올) ~ 500 mL RPMI 1640 m를 함유하는 500 mL RPMI 1640 하룻밤 문화와 배양.</li>
</ol>2. 준비
<ol><li>25 mL RNase 억제 용액, 70 % 에탄올 또는 증류 H2O의 3 개의 50 mL 튜브를 채웁니다. 이 해결책은 수술 전과 절차 도중 수술 도구를 청소하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>프로토콜을 시작하기 전에 RNase 억제 용액에서 도구의 팁을 30 분 동안 담그십시오. 이렇게 하면 도구의 잠재적인 RNase가 제거됩니다.</li>
	<li>수술 중 사용하기 위해 흡수 패드를 6 in x 6 크기로 미리 자르면 됩니다.</li>
	<li>1X HBSS 솔루션을 미리 준비하고 4°C에 보관하십시오. 수술 전에 STOP 솔루션을 준비하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>수술 직전에 콜라게나아제 P 용액을 준비하고 얼음에 보관하십시오. 참고 : 이것은 준비 2 시간 이내에 사용해야합니다.</li>
	<li>소화 및 정화를 위한 50 mL 관을 라벨; 각 마우스에 대해 2 개의 튜브를 준비하고, 하나는 소화를 위해, 다른 하나는 아일렛 정화를 위해 준비하십시오. 동물 ID가 두 튜브에 있는지 확인합니다.</li>
	<li>처음 50 mL 튜브에 콜라게나아제 P 용액 3 mL을 넣습니다. 나머지 3 mL의 콜라게나아제 P가 주입됩니다.</li>
	<li>나머지 3 mL의 콜라게나아제 용액을 바늘에 30G 1/2로 장착된 3 mL 주사기에 넣습니다. 주사기를 얼음 위에 놓습니다.</li>
</ol>3. 수속
<ol><li>RNase 억제 용액에서 모든 도구를 제거 한 다음 70 % 에탄올로 튜브에 먼저 담근 다음 증류된 H2O를 함유 한 튜브에 담근 다음 깨끗한 종이 타월에 공기 건조하십시오.</li>
	<li>마우스가 깊이 마취 될 때까지 이소플루란 0.5 mL를 포함하는 챔버에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>챔버에서 마우스를 제거하고 집게로 발 패드를 꼬집어 마취 상태를 확인합니다. 깊은 마취는 호흡이 꾸준히 느려지고 마우스가 발 꼬집기에 반응하지 않는다는 관찰에 근거를 두습니다. 마우스가 깊이 마취되어 있는지 확인한 후 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킨 다음 마우스를 흡수 패드에 놓습니다.<ol>
<li>마취 된 마우스를 위장에 놓고 목에 압력을 가하고 꼬리를 당겨 뇌에서 척추를 분리하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스의 팔다리를 흡수 패드에 테이프로 테이프로 채우고, 70% 에탄올로 몸에 스프레이하고, 여분의 에탄올을 닦아냅니다.</li>
	<li>커버 유리 집게와 곡면 수술 가위를 사용하여 절개를 합니다. 먼저 복부 영역 (~3cm)의 피부에 수평 절개를하고, 피부를 넓게 당겨 복벽을 노출시다. 그런 다음 복부 복막에 수직 절개 (~ 3-4cm)를 만들어 복강에 췌장을완전히 노출시십시오 (그림 3).</li>
	<li>간엽을 우월하게 밀어 담관을 노출시켜, 옅은 분홍색 관으로 나타날것이다(도 3).</li>
	<li>복강의 오른쪽 요추 /장골 부위에서 오른쪽으로 조심스럽게 내장을 이동하여 담관과 간 동맥을 노출시다(그림 3).</li>
	<li>슈워츠 마이크로 세정제 (그림 1)를사용하여 일반적인 담관을 가능한 한 간가까이 조심스럽게 고정시다.</li>
	<li>췌장 덕트와 일반적인 담관의 결합에 의해 형성 된 십이지장 유두에위치한 Vater의 맥풀라를 식별하십시오. 바터의 암풀라는 일반적인 담관에 진입점인 해부 현미경의 밑에 볼 때 부어나타납니다 (그림 4). 참고: 해부 현미경의 빛의 강도/각도를 조정하면 쉽게 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>콜라게나제 P 용액 3 mL로 주사기를 바터의 암풀라에 넣습니다. 그림5와 같이 일반적인 담관 (암풀라 리드 덕트)의 길이의 약 1/4 동안 덕트에 바늘을 밀어 넣습니다.</li>
	<li>바늘이 암풀라에 있으면 바늘의 방향이 덕트와 평행하도록하십시오.</li>
	<li>마이크로 Adson 집게로 고정하여 바늘을 안정화하여 덕트에구멍을 뚫지 못하게합니다 (그림 5).</li>
	<li>도6에 나타낸 바와 같이 주사기로부터 콜라게나아제 P 용액의 3 mL을 서서히 주입하여 일반적인 담관(저항을 충분히 느낄 수 있음)을 주입한다. 목표는 콜라게나제를 강제로 췌장 덕트에 진입하도록 역류 압력을 만드는 것입니다. 췌장의 머리, 목, 신체 및 꼬리 부위가 모두 완전히 팽창되면 주사가 성공한 것으로 간주됩니다. 참고: 췌장이 완전히 팽창되지 않았거나 비장 영역이 완전히 팽창되지 않으면 저수분 수율이 낮아집니다. 비장 영역은 작은 섬 6의가장 높은 수를 포함. 인플레이션은 용액으로 채워진 췌장 조직 사이의 열린 공간의 출현에 의해 확인 될 수있다.</li>
	<li>팽창된 췌장을 조심스럽게 해부하고 얼음처럼 차가운 콜라게나아제 P 용액 3 mL을 함유한 50 mL 소화 튜브에 넣습니다.<ol>
<li>2 집게를 사용하여 췌장을 제거 (곡선 및 마이크로 Adson; 그림 1참조): (비장에서 시작하여 췌장을 비장에서 멀리 당기고 위장과 십이지장을 따라 계속 제거하십시오. 참고: 절개가 필요하지 않습니다.</li>
		<li>미세 한 수술 가위를 사용 하 여 얼음 차가운 콜라게 나 아 제 P 용액의 3 mL소화튜브에 3-5 s에 대 한 췌 장을 잘라 (그림 7A).</li>
	</ol></li>
	<li>튜브를 37°C 수조랙에 고정하고 100-120rpm에서 약 12-13분 동안 흔들어 줍니다.</li>
	<li>배양 후, 콜라게나제 P 소화액이 균질해질 때까지 튜브를 손으로 흔들어 조직을 교란시다(도7B). 균질성은 췌장의 미세 입자의 모래 모양에 의해 확인된다. 약 30 s의 부드러운 손 떨기는 대개 충분 합니다. 튜브를 빛까지 잡고 조직이 잘 균질화되었는지 검사합니다. 필요한 경우 다른 ~ 15 s를 위해 흔들어주세요.</li>
	<li>일단 소화되면, 즉시 얼음에 튜브를 놓고 효소 소화를 종료얼음 차가운 STOP 용액의 40mL를 추가합니다. 참고 : 이 시점에서 소화 튜브는 여러 마우스에서 작업하는 경우, 2 시간까지 얼음에 남아있을 수 있습니다.</li>
	<li>30s에 대한 300 x g의 스윙 버킷 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리기 (원심 분리기의 온도는 유연합니다). 참고 : 조직 펠릿이 튜브의 벽이 아닌 50 mL 튜브의 바닥에 형성되도록 스윙 버킷 원심 분리기를 사용하십시오. 이것은 더 나은 아일렛 수율에 매우 중요합니다.</li>
	<li>STOP 용액으로 원심분리를 2회 더 반복하고 각 스핀 후 용액을 디캔팅합니다. 이후세척시 20mL의 STOP 용액을 사용하십시오.<ol>
<li>각 스핀 전에, 20 mL STOP 용액에서 50 mL 튜브에서 조직 펠릿을 부드럽게 흔들어 펠릿을 중단시다.</li>
	</ol></li>
	<li>40 mL의 얼음 차가운 HBSS 및 원심 분리기를 30 초 동안 300 x g에서 조직 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>HBSS 용액을 사용하여 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 원심분리를 두 번 더 반복하고 각 스핀 후에 용액을 디캔팅합니다. 각 세척시 20 mL의 HBSS를 사용하십시오.<ol>
<li>각 스핀 전에 펠릿을 분리하여 20 mL HBSS 용액을 함유 한 튜브를 부드럽게 흔들어 튜브 바닥에서 분리하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>마지막 원심분리 후 모든 HBSS를 제거합니다.</li>
	<li>그런 다음 펠렛을 함유하는 50 mL 튜브에 실온 밀도 구배 5 mL을 추가합니다. 소용돌이가 균질화 될 때까지 저속으로 잠시.</li>
	<li>50 mL 튜브에 실온 밀도 그라데이션의 또 다른 5 mL을 추가합니다. 소용돌이/혼합하지 마십시오. 참고: 더 나은 그라데이션이 중단 없이 형성될 수 있도록 안정적이고 여전히 유지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>피펫 10 mL의 실온 HBSS 버퍼튜브(밀도 그라데이션 포함)는 그라데이션이 형성될 수 있도록 부드럽고 천천히 투하한다. 10mL 파이펫이 있는 파이펫 건을 사용하여 HBSS 를 드롭와이즈로 추가합니다.</li>
	<li>스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 15분 동안 1700 x g의 스핀 튜브를 사용하십시오.</li>
	<li>스핀 후 그라데이션을 방해하지 않고 튜브를 조심스럽게 제거하십시오. 차가운 HBSS(파이펫 HBSS)로 미리 적은 파이펫 건을 사용하여 밀도 그라데이션과 HBSS 사이에 형성된 아일렛 층(5-10mL)을 새로운 50mL 아일렛 수집 튜브로 피펫을 꺼냅니다. 참고: 작은 섬이 파이펫의 내부 벽에 달라붙지 않도록 섬을 파이펫팅하기 전에 차가운 HBSS로 파이펫을 적시면 도움이 됩니다.<ol>
<li>분리가 불완전한 경우, 섬은 밀도 그라데이션 층에서 볼 수 있을 것이고, 피펫은 인터페이스에 형성된 섬 층과 함께 밀도 그라데이션(bottom layer)의 전체 10 mL을 밖으로 내보피낼 것이다(HBSS 최상위 층의 약 8-10 mL만 뒤에 남을 뿐). 참고: 아일렛 레이어와 밀도 그라데이션 레이어(하단 레이어)를 모두 수집하면 이물질이 수집되어 아일렛 피킹 시간이 길어질 수 있지만 다른 단계는 변경되지 않습니다. 아일렛 층이 잘 형성될 때 이러한 레이어를 모두 수집할 필요는 없습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>20 mL의 얼음 차가운 HBSS를 작은 섬이 들어있는 새로운 50 mL 튜브에 추가 한 다음 스윙 버킷 원심 분리기에서 3 분 동안 350 x g의 원심 분리기를 넣습니다.</li>
	<li>스핀 후, 조심스럽게 피펫(decant하지않음) 상급 (하단에 ~ 3 mL을 두고) 하단에 있는 섬을 포함하는 펠릿을 방해하지 않고. 상급제는 버리십시오.</li>
	<li>세탁과 원심분리를 3회 이상 반복합니다. 매번 20 mL의 HBSS를 추가하고 각 스핀 전에 펠릿을 일시 중단해야합니다.</li>
	<li>사용 전에 RPMI-1640 완전 미디어 병을 수조에서 37°C로 데우면 됩니다. 마지막 원심분리 후, HBSS를 모두 제거하고 이전에 준비된 완전한 RPMI-1640 매질(FBS, INS-1 세포 보충제 및 페니실린/스트렙토마이신 포함)의 4 mL를 펠릿에 추가합니다.</li>
	<li>튜브를 부드럽게 소용돌이치면서 펠릿을 빼내고 즉시 RPMI-1640 용지를 100mm 페트리 접시에 붓습니다. 튜브에 RPMI-1640 용지 5mL를 추가하고 부드럽게 소용돌이쳐 남은 섬을 씻어낸 다음 동일한 페트리 접시에 미디어를 붓습니다.<ol>
<li>해부 현미경으로, 20 μL 파이펫을 사용하여 페트리 접시에서 건강한 섬을 선택하고 완전한 RPMI 1640 용지 10 mL을 포함하는 새로운 페트리 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 볼 때, 섬은 상대적으로 투명한, 간결한 외분비 조직에 비해 매끄러운 표면과 구형 / 직사각형 과 황금 갈색 색상을 표시해야합니다. 참고 : 해부 현미경의 배율은 일반적으로 12.5-16x로 설정됩니다. 아일렛 수율은 마우스의 균주, 연령 및 성별을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜은 일반적으로 건강한 C57BL/6J 마우스 나이 4-10 개월에서 250-350 건강한 섬을 산출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다음날 실험을 위해 37°C에서 멸균 인큐베이터에 5% CO2 주입 및 95% 가습 공기를 밤새 인큐베이션하거나, 나중에 원하는 분석을 위해 섬을 동결한다.<ol>
<li>일단 섬이 동결되면, 분비 성 어세이, RNA 또는 단백질 정량화에만 사용할 수 없습니다. 동결 세포를 수집하려면, HBSS 버퍼에 배치, 버퍼의 200-500 μL에 있는 모든 섬을 수집, 1.5 mL 튜브로 전송, 원심 분리기 350 x g 1-2 분, 이상 을 떠나 상층체를 제거 30-40 μL 용액을 떠나, 단기 저장을위한 -20 °C에 배치 ( 장기간 보관할 수 있도록 며칠) 또는 -80°C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li>
<li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632(2015).</li>
<li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374(2014).</li>
<li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374(1987).</li>
<li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+filtration%3A+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li>
<li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li>
<li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜에는 콜라게나아제 관류와 소화가 포함되며, 그 다음에는 섬의 정화가 뒤따릅니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 췌장 1,4,7의효과적인 주입 및 완전한 관류입니다. 이 프로토콜의 전달 방법은 효소가 아일렛 1을 둘러싼 외분비 조직을 더잘 소화하기 위해 해부학 적 경로를 통과하는 것을 허용합니다. 또한,이 기술은 섬4,6의가장 높은 농도를 가지는 비장 영역의 완전한 소화에 적합합니다. 이 프로토콜은 잘 제어 된 소화 시간과 신중하게 실행 된 정화 단계로 250-350 개의 건강한 섬을 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜로부터 분리된 섬은 포도당 자극된 인슐린 분비 ex vivo<sup class="xref...

췌도 격리에 대한 문헌에는 두 가지 일반적인 방법이 있습니다. 하나는 췌장을 절제하고 수술 가위를 사용하여 작은 조각으로 다이싱 한 다음 콜라게 나아제 용액1,2,3으로소화해야합니다. 또 다른 더 정확한 방법은 소화 효소를 소개하기 위하여 췌장에 존재하는 덕트의 네트워크를 이용하는 것입니다. 다음 사이트는 소화 효소 주입에 사용되었습니다 : 담즙 과 낭포 덕트의 접합, 일반적인 담관으로 담낭,또는 일반적인 담관 자체 1,4,5. 작은 섬이 췌장에 고르게 분포되지 않은 것으로 알려져 있습니다. 비장 영역은 가장 작은섬 6을 포함합니다. 소화 효소를 전달하기 위해 해부학 경로를 사용하는 두 번째 방법은 비장 영역을 포함하여 췌장의 보다 완전한 관류를 허용하지만,이 절차는 종종 기술적으로 Vater의 암풀라의 클램핑 또는 봉합이 필요합니다. 도전. 섬 정화의 관점에서, 다중 밀도 그라데이션뿐만 아니라 세포 스트레이너 및 자기 후퇴는 섬을정화하기 위해 사용되어 왔다 3,7. 이러한 그라데이션의 활용은 시간이 많이 소요될 수 있으며 Ficoll 그라데이션은 섬8의독성 손상을 초래할 수 있습니다.
현재 프로토콜은 Li et al. 7에의해 설명된 방법에 기초하여 구축되며, 우리 자신과 다른 사람의 경험을 기반으로 추가 된 수정사항1,4. 우리의 프로토콜의 가장 중요한 단계는 간 끝 의 가까이에 일반적인 담관의 클램핑, 외분비 조직을 소화하기 위하여 Vater의 ampulla를 통해 콜라게나제 P를 주입하고, 그 때 기계적으로 소화를 가속화하기 위하여 동요하는 근해를 사용하여1, 4,7. 이어서, 'STOP' 용액이 인가되어 작은 섬들의 추가 소화를 억제한다; HBSS는 나머지 콜라게나제 P 및 STOP 용액을 세척하는 데 사용됩니다. 피콜 방법이 인간 섬을 정화하는 데 사용되었을 때, 수율은 Percoll 그라데이션 9의 사용에 비해 더 큰 기능적 능력(예를 들어,인슐린 분비)을 가진 섬보다 두 배 인 것으로 보고되었다. 그러나, 연구는섬1,10에그것의 독성 효과 때문에 Ficoll 그라데이션의 사용에 의문을 제기 했다 . 히스타크 그라데이션은 마우스 섬 격리를 위한 최적의 정제 역학을 제공하는 것으로 보고되었으며, 이는 더 간단한 단계와 낮은비용으로 고품질 의 섬들의 좋은 수율을 생성한다 1. 우리의 프로토콜에서, Histopaque-1077다른 잔류 조직에서 섬을 정화하는 데사용된다 8,11. 수확된 섬은 완전한 RPMI-1640 배지에서 배양되거나 RNA/단백질 정량에 직접 활용될 수 있다.
콜라게나아제 P 소화와 단일 그라데이션 정제 단계의 조합을 사용하는 당사의 프로토콜은 다른 출판된 프로토콜보다 간단합니다. 우리의 방법은 까다로운 외과 적 수술을 필요로하지 않으며 몇 가지 간단한 단계가 있습니다. 더 중요한 것은, 이 프로토콜은 지속적으로 우리가보고 한바와 같이 고품질 기능 섬 (250-350 / 마우스)의 좋은 수율을 생산하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Hoding 콜라겐 분해 효소 P</td></tr><tr><td>커버 유리 집게</td><td>VWR</td><td>82027-396</td><td>절개 절차를 돕기 위해 마우스의 피부를 잡고</td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168696</td><td>췌장 제거 중 조직 잡기</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>B13B16A</td><td>수술 전 마우스를 마취하기 위해</td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>30-2041</td><td>섬 문화에 사용</td></tr><tr><td>30 G. &frac12; 인치 바늘</td><td>BD</td><td>305106</td><td>콜라겐 분해 효소 P를 전달하기 위해 vater의 Ampulla의 침투 -이 게이지는 대부분의 CBD에 잘 맞기 때문에 사용됩니다</td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>소화 된 췌장 조직, 콜라겐 분해 효소 P 및 정제 된 섬을 보유</td></tr><tr><td>방수 수분 장벽이있는 흡수 패드</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 및 감속 기능이 있는 원심분리기 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811FJ478114</td><td>조직 펠릿화에 사용, 펠릿은 원뿔형 튜브의 바닥에 형성됩니다 - 스윙 버킷 원심분리기가 필요합니다. 또한 decelaration 기능은 그라디언트 레이어를 형성하는 데 중요합니다.</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 P- 1g</td><td>Roche 진단</td><td>11249002001</td><td>외분비 췌장 소화용</td></tr><tr><td>곡선형 수술용 가위</td><td>Fisher-Scientific</td><td>13-804-21</td><td>개방형 마우스 복부</td></tr><tr><td>절단 해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>췌장에 콜라겐 분해 효소를 정확하게 전달하기 위한 주요 해부학적 구조 식별에 사용</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 10x</td><td>Corning</td><td>20-023-CV</td><td>세척 셀</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>RNBF5100</td><td>그라디언트 형성용</td></tr><tr><td>광원</td><td>Leeds</td><td>LR92240</td><td>현미경의 가시성 향상</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM9780</td><td>RNase</td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체 제거용 L-글루타민</td><td>없음 Corning</td><td>15-040-CV</td><td>배양 섬</td></tr><tr><td>Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-01</td><td>Clamping common bile duct and hepatic artery</td></tr><tr><td>Shaking waterbath</td><td>Boekel/Grant</td><td>8R0534008</td><td>Important for mechanical digesting of exocrine tissue</td></tr><tr><td>작은 수술용 가위</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>췌장에 닿은 Cuttitng tissue</td></tr></tbody></table>

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Langerhans의 섬이라고도 하는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능에 대한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 섬은 주로 5가지 유형의 호르몬 분비 세포로 구성됩니다: α 세포는 글루카곤을 분비하고, β 세포는 인슐린을 분비하고, δ 세포는 소마토스타틴을 분비하며, δ 세포는 그렐린을 분비하고, PP 세포는 췌장 폴리펩티드를 분비합니다. 작은 섬에 있는 세포의 60-80%는 인슐린 분비를 공부하는 가장 중요한 세포 인구인 β 세포입니다. 췌도는 생체 내 인슐린 분비를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 고품질 섬을 확보하는 것은 당뇨병 연구에 매우 중요합니다. 대부분의 아일렛 격리 절차는 콜라게나아제 주입, 가혹하고 복잡한 소화 절차 및 다중 밀도 구배 정제 단계의 부위에 기술적으로 접근하기 어렵습니다. 이 논문은 상세한 설명과 현실적인 데모와 간단한 고수율 마우스 섬 격리 방법을 갖추고 있습니다, 다음과 같은 특정 단계를 보여주는: 1) Vater의 암풀라에서 콜라게나제 P의 주입, 췌장 덕트를 결합하는 작은 영역과 일반적인 담관, 2) 효소 소화 및 외분비 췌장의 기계적 분리, 및 3) 단일 그라데이션 정제 단계. 이 방법의 장점은 Vater의 접근성이 좋은 암풀라를 사용하여 소화 효소를 주입하고 효소 및 기계적 접근법을 사용하여 보다 완전한 소화를 하고, 더 간단한 단일 그라데이션 정제 단계입니다. 이 프로토콜은 마우스당 약 250-350개의 섬을 생성합니다. 및 섬은 다양한 생체 내 연구에 적합하다. 이 절차의 가능한 주의 사항은 효소 소화 및 / 또는 장기간 그라데이션 배양으로 인해 잠재적으로 손상된 섬이며, 이 모든 것은 인큐베이션 시간의 신중한 광고 정당화에 의해 크게 피할 수 있습니다.

이 절차의 적절한 완료는 복강에서 마우스 해부학의 일부 이해가 필요합니다. 이것은 Vater의 암풀라의 적절한 식별과 일반적인 담관의 클램핑을 허용합니다. 전체 절차는 일반적으로 1-2 시간이 걸립니다. 4-6 마우스에서 동시에 작은 섬을 분리하는 것이 더 효율적이므로 여러 샘플을 함께 원심 분리 할 수 있습니다. 섬 따기의 시간은 작은 섬의 수와 소화의 효율성에 따라 다릅니다. 1개의 마우스에서 250-350개의 섬을 선택하는 데 약 1시간이 걸릴 수 있습니다.
이 백서에는 매우 사실적인 이미지가 다수 포함되어 있습니다: 그림 3은 일반적인 담관 및 간 동맥을 노출하는 마우스의 복강을 보여줍니다. 그림 4는 더 밝은 색상으로 보이는 일반적인 담관의 전체 길이뿐만 아니라 췌장과 십이지장 사이의 (바늘이 삽입 될 곳) 근처 더 크고 빛나는 Vater의 암풀을 보여줍니다. 클램...

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

이 프로토콜은 단일 밀도 그라데이션을 사용해야 하므로 보다 복잡한 기존 islet 격리 방법에 비해 노동 집약적이고 비용 효율이 훨씬 낮습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 효소가 췌장에 직접 전달되어 조직 소화가 향상되고 배회 수율이 증가한다는 것입니다. 먼저 마우스의 팔다리를 supine 위치에 테이핑하고 70%에탄올로 바디를 분사합니다.커버글래스 집게와 구부러진 수술 용 가위를 사용하여 약 3센티미터의 수평 복부 피부 절개를 하고 피부를 열어 복부 벽을 노출시합니다. 췌장을 완전히 노출시키고 해부 현미경 아래에 마우스를 배치하기 위해 복부 복막에 3 ~ 4 센티미터 수직 절개를합니다. 간 엽을 우월하게 밀어 창백한 분홍색 튜브로 나타나는 담관을 노출시키고 내장을 오른쪽 요추와 장강 부위에서 복강 오른쪽으로 부드럽게 이동하여 담관과 간 동맥을 노출시합니다.Schwartz 마이크로 세정제를 사용하여 가능한 한 간과 가까운 일반적인 담관을 조심스럽게 고정하고 십이지장 유두에 위치하고 췌장 덕트와 일반적인 담관의 조합에 의해 형성된 바터의 암풀라를 식별합니다. 마이크로 Adson 집게를 사용하여 일반적인 담관을 당기려면, 갓 준비된 콜라게나아제 P 용액 3밀리리터를 포함하는 3밀리리터 주사기에 부착된 30 게이지 반인치 바늘을 배의 길이의 약 1/4동안 용기에 평행하게 밀어넣는 바터의 암풀라에 삽입한다. 바늘이 제자리에 있으면 마이크로 Adson 집게로 바늘을 안정시키고 천천히 꾸준히 콜라게나아제 P 용액 3 밀리리터를 덕트에 주입하십시오.주사는 췌장의 머리, 목, 바디 및 꼬리 영역이 완전히 팽창되는 경우에 성공한 것으로 간주됩니다. 암풀라에 적절한 입력과 일반적인 담관의 캐누레이션은 성공적인 소화 수확에 매우 중요합니다. 덕트 벽을 관통하면 격리의 효능이 줄어듭니다.곡선 및 마이크로 Adson 집게를 사용하여 비장에서 시작하여 위장과 십이지장을 따라 계속 팽창 된 췌장을 조심스럽게 꺼냅니다. 그런 다음 3 밀리리터의 얼음 차가운 콜라게나아제 P 용액을 포함하는 50 밀리리터 소화 튜브에 췌장을 놓습니다. 섬을 수확하려면 먼저 미세 수술 가위를 사용하여 췌장을 3~5초 간 자른 후 12~13분 동안 분당 100~120회전에서 37도의 수수욕조에 튜브를 배치합니다.인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 미세 모래 와 같은 췌장 조직 입자에 의해 확인된 바와 같이 용액이 균질 될 때까지 조직을 중단하기 위해 약 30 초 동안 튜브를 흔들어. 조직이 소화되는 즉시 튜브를 얼음 위에 놓고 40 밀리리터의 얼음 콜드 스톱 용액을 추가하여 효소 반응을 종료합니다. 펠릿을 부드럽게 방해한 후, 스윙 버킷 원심분리기에서 소화된 조직을 스핀다운한 다음, 세척당 20밀리리터의 신선한 스톱 용액을 가진 2개의 원심분리기가 있습니다.마지막 세척 후, 마지막 세척 후, 3 개의 추가 세척에 대 한 얼음 차가운 HBSS의 40 밀리 리터에 펠 릿을 다시 중단, 마지막 세척 후 실온 밀도 그라데이션 솔루션의 5 밀리 리터에 펠 릿을 다시. 용액이 균질화 될 때까지 튜브를 저속으로 잠시 소용돌이로 간결하게 한 후 실내 온도 밀도 그라데이션의 5 밀리리터를 튜브에 추가합니다. 이제 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 10 밀리리터의 실온 HBSS를 드롭 와이즈 방식으로 튜브에 부드럽게 천천히 추가하여 그라데이션의 형성을 허용하고 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 밀도 그라데이션 분리에 의해 세포 집단을 격리시킵니다.원심분리의 끝에서, 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 차가운 HBSS를 사용하여 밀도 그라데이션과 HBSS 사이의 섬 층의 5~10 밀리리터를 수집합니다. 섬들을 신선한 얼음 차가운 HBSS 20 밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 스윙 버킷 원심분리기에서 원심분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄의 마지막 3밀리리터를 제외한 모든 것을 조심스럽게 흡인시키고 세척당 20 밀리리터의 신선한 HBSS로 적어도 세 번 이상 섬을 씻으십시오.마지막 세척 후, 37섭씨 RMPI 1640 배지의 4밀리리터로 상퍼를 교체하고 튜브를 부드럽게 소용돌이어 펠릿을 빼냅니다. 즉시 100mm 페트리 접시에 섬을 붓고 다른 섬과 함께 세척을 풀링 남아있는 섬을 수집하기 위해 신선한 RPMI 1640 매체의 다섯 밀리리터로 튜브를 씻어. 그런 다음 해부 현미경과 20 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 페트리 접시의 매끄러운 표면이있는 건강한 구형 또는 직사각형 황금 갈색 섬을 선택하여 완전한 RPMI 1640 배지 10 밀리리터를 포함하는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다.모든 섬이 수집되면 섬섬을 멸균 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소5%를 밤새 가습공기에 넣습니다. 좋은 건강한 섬은 매끄러운 둥근 모양을 가지고 있는 것처럼 보이며 손상된 섬은 거친 가장자리를 나타낸다. 소화되지 않은 외분 조직은 외관에 반투명하고 불규칙한 모양을 보여줍니다.콜라게나아제 P 효소의 적절한 수분 및 분포는 췌장의 비장 부분의 인플레이션에 의해 확인될 수 있다. 낮은 포도당 매체에서 하룻밤 잠복은 섬의 인슐린 분비 용량에 대한 통찰력을 허용하는 다음 날에 포도당 자극 인슐린 분비 분석섬을 프라임 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

마우스 작은 섬 격리에 대한 자세한 설명은 collagenase와 중성 단백 분해 효소를 정제의 조합의 현장 췌장 ductal cannulation 및 재관류에의 기술을 사용하여 설명되어 있습니다.

Langerhans 절연의 마우스 작은 섬은 정화의 Collagenase와 중성 단백 분해 효소의 조합을 사용하여

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

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췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

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여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

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마우스 췌장 내피 세포의 분리

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

학습하세요 마우스 췌도 격리를 위한 간단한 프로토콜로 콜라게나제 주입을 통해 조직 소화를 향상시키고 마우스당 250-350개의 고품질 췌도를 얻는 방법입니다. 이 비용 효율적인 기술은 당뇨병 연구에 필수적입니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

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