멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

이 절차의 전반적인 목표는 광범위한 시료 전처리 및 값비싼 기기가 필요하지 않고 다양한 생물학적 시료에 사용되는 멀티플렉스 현장 진단 플랫폼의 사용을 입증하는 것입니다. 이 방법은 단일 반응 튜브에서 다양한 표적 검출과 같은 현장 진단 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표적별 스트랜드 치환 프로브와 결합된 루프 매개 등온 증폭을 사용하면 세 가지 다른 바이러스를 효율적으로 검출할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 PCR 대신 등온 증폭을 사용하고 최소한의 샘플 준비가 필요하며 다양한 임상 샘플에 적용할 수 있다는 것입니다. 종이 펀치를 사용하여 Q-paper 시트를 3mm x 4mm의 작은 직사각형으로 자르는 것으로 시작합니다. 그런 다음 마이크로 유봉을 사용하여 지카 바이러스에 감염되었을 가능성이 있는 이집트숲모기 암컷 모기를 각 종이에 으깨십시오.

피펫 : 20 마이크로 리터의 1 몰, 수성 암모니아 용액을 각 종이 조각에 넣습니다. 5분 후 각 종이를 20마이크로리터의 50% 에탄올로 씻은 다음 20마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 씻습니다. BSL-2 생물 안전 캐비닛에서 종이를 약 1시간 동안 자연 건조합니다.

건조 후 핀셋을 사용하여 각 종이를 100마이크로리터의 RT-LAMP 반응 혼합물에 완전히 담그고 섭씨 65도에서 68도에서 45분 동안 배양합니다. LED 광원과 주황색 또는 노란색 필터가 있는 3D 프린팅 관찰 상자를 사용하여 지카 바이러스에서 발생하는 형광을 읽고 기록합니다. 먼저 동결건조된 RT-LAMP 시약이 들어 있는 각 반응 튜브에 90마이크로리터의 1.1배 수화 완충액을 추가하고 진탕하여 용해합니다.

그런 다음 1, 000 배 중력으로 잠시 회전합니다. 원심분리 후 바이러스 RNA가 첨가된 소변 샘플 10마이크로리터를 반응 튜브에 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 모기를 테스트하는 경우 소변 대신 10마이크로리터의 정제수와 함께 모기 사체가 들어 있는 직사각형의 Q-paper를 추가합니다.

닫힌 튜브를 섭씨 65-68도로 사전 설정된 열 블록에 넣고 30-45분 동안 배양합니다. 배양 후에는 향후 분석법의 오염을 방지하기 위해 튜브를 닫아 두고 관찰 상자에 넣습니다. 관측 상자 뒷면에 있는 스위치를 켭니다.

주황색 필터를 통해 샘플을 관찰하고 이미지가 시야의 80%를 채우는 거리에서 휴대폰 카메라로 이미지를 캡처합니다. 시각화가 완료되면 스위치를 끕니다. 밀봉된 튜브는 어두운 곳에 보관하고, 나중에 시각화가 필요한 경우 냉장 보관하는 것이 좋습니다.

싱글플렉스 및 멀티플렉스 사례 모두에서 RT-LAMP 제품은 아가로스 겔에서 실행될 때 연결체의 문자로 나타납니다. 물을 샘플로 포함하는 음성 대조군 샘플은 감염되지 않은 암컷 모기에서 추출한 총 핵산을 주형으로 사용하는 비특이적 표적 대조군을 포함하여 프라이머 자체에 대한 밴드만 제공했습니다. 녹색 형광은 FAM으로 표지된 5개의 프라임 NT로 프로브를 사용하여 Zika에 대해 관찰됩니다.

연한 녹색 노란색 형광은 프로브가 HEX로 표지된 5개의 프라임 NT인 Chikungunya에 할당됩니다. 뎅기열-1에는 주황색 적색 형광이 사용되며, 뎅기열-1의 프로브는 TAMRA로 표지된 5개의 프라임 NT입니다. 모기를 함유한 두 개의 논문을 RT-LAMP 혼합물에 직접 담그고 섭씨 65도에서 30분 동안 배양한 후 지카 바이러스의 존재 하에서 밝은 녹색 형광이 관찰되었습니다.

9가지 부피의 재수화 완충액과 1가지 부피의 소변 샘플을 사용하여 30분 이내에 가시적인 녹색 형광을 생성할 수 있으며 모든 휴대폰 카메라로 이미지를 캡처할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 임상 진단 분야의 연구자들이 소변, 혈액, 타액 또는 모기 사체에서 모기 매개 바이러스를 검출하기 위한 현장 진료 플랫폼을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 등온 증폭 시스템(이 경우 램프)을 사용하여 다양한 생물학적 샘플에서 멀티플렉스 방식으로 지카 및 기타 아르보바이러스를 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.