Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

이 기술의 전반적인 목표는 테트로도톡신 저항성 나트륨 채널을 사용하여 초파리에서 전기생리학적으로 단일 시냅스 연결을 식별하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 시냅스의 화학적 성질을 드러낼 수 있다는 것입니다. 또한 부피 또는 벌크 전송 연구에 적합합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 비디오에서는 해부의 어려움 때문에 어려움을 겪습니다. 그러나 단순히 방법을 이해하면 logic 를 마우스와 같은 다른 모델 시스템으로 쉽게 전송할 수 있습니다. 녹음을 위해 7메가옴 근처의 저항에 대한 패치 피펫을 준비하십시오.

또한 pH 7.3 이하의 외부 기록 식염수를 95%의 산소와 5%의 이산화탄소를 함유한 탄수화물로 지속적으로 폭기해야 합니다. 피험자의 경우, 0.2 밀리몰의 모든 트랜스 레티날을 포함하는 음식에서 증식하는 csChrimson을 발현하는 플라이 스톡을 가지고 있습니다. 녹음의 경우 생후 1일에서 3일 된 성인을 선택합니다.

유리 섬광 바이알에 넣고 얼음처럼 차가운 조건에 1분 동안 노출시켜 고정시킵니다. 그런 다음 해부 스코프와 거친 집게의 광 수준을 낮추어 마취된 파리를 맞춤형 녹음 챔버에 로드합니다. 왁스 또는 UV 경화 에폭시로 둘러싸서 플라이를 챔버에 고정합니다.

호일이 흉부의 대략 절반 위로 올라가도록 등 쪽이 위로 향하게 놓습니다. 훌륭한 준비를 하는 열쇠는 호일의 구멍을 딱 맞는 크기로 잘라서 파리가 쥐어짜지거나 빠지지 않도록 하는 것입니다. 양쪽에서 광섬유 조명으로 준비물을 비추고 가능한 한 어둡게 유지하십시오.

다음으로, 4-6방울의 식염수로 준비물을 덮습니다. 다음으로, 해부를 위해 텅스텐 와이어 또는 필라멘트를 날카롭게합니다. 질산칼륨 포화 용액에 약 20볼트의 AC 전류를 가하고 와이어 끝을 용액에 매우 빠르게 반복적으로 담그십시오.

20회 담그면 팁이 날카로워집니다. 이제 큐티클을 제거한 다음 기관과 뚱뚱한 몸을 제거하여 뇌를 노출시키기 위해 날카로운 와이어를 사용할 수 있을 만큼 충분한 가시성을 제공하도록 조명을 조정합니다. 안테나 엽에 접근하려면 구부러진 텅스텐 와이어를 사용하여 안테나를 호일 차폐 아래에 부드럽게 밀어 넣습니다.

그런 다음 날카로운 집게를 사용하여 관심 영역을 덮고 있는 신경교 외피를 부드럽게 뜯어냅니다. 이제 준비물을 전기 생리학 리그로 옮겨 녹음합니다. 리그에서 즉시 발탄제로 거품을 일으킨 식염수를 기록하여 제제를 관류하기 시작합니다.

현미경 스테이지 위에 배치된 중력 공급 식염수 저장소를 사용합니다. 배설물을 수집하려면 진공 라인과 2리터 플라스크를 사용하십시오. 다음으로, 패치 피펫에 4마이크로리터의 내부 기록 용액을 넣고 피펫을 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다.

그런 다음 증폭기의 오프셋을 0으로 설정하고 테스트 펄스를 전달하도록 증폭기를 설정합니다. 그런 다음 뇌를 명확하게 볼 수 있도록 IR 경사 조명을 조정합니다. 이제 피펫에 양압을 가하면서 피펫으로 세포에 접근합니다.

세포와 접촉이 이루어지면 양압을 해제하여 피펫을 멤브레인에 밀봉합니다. 그런 다음 멤브레인의 유지 전위를 -60 밀리 볼트로 설정하십시오. 그리고 피펫은 세포막과 함께 기가옴 밀봉을 형성해야 합니다.

유지 전류는 낮은 서브 피코암페어 수준으로 떨어져야 합니다. 일정한 기가옴 밀봉을 얻으려면 양압을 유지하여 피펫을 깨끗하게 유지하고 조직에 부딪히거나 세포에 접근하지 않도록 하십시오. 계속하려면 테스트 펄스를 영하 50에서 영하 60밀리볼트까지 전달하도록 증폭기를 설정하십시오.

테스트 펄스는 패치 파이펫을 충전하는 데 필요한 전류를 나타내는 큰 용량성 과도 현상을 나타냅니다. 용량성 과도 현상을 제거하려면 증폭기의 용량 보상 손잡이를 조정하십시오. 이제 짧은 음압 펄스를 가하여 세포막을 파열하고 전체 세포 구성을 얻습니다.

용량성 과도 현상이 크게 증가하면 성공을 나타냅니다. 유지 전류의 약간의 증가도 관찰해야 합니다. 그런 다음 증폭기를 현재 cl로 설정합니다.amp 모드.

그리고 전지의 전위를 영하 50에서 영하 60밀리볼트 사이로 조정하십시오. 준비 과정에서 기술 프로토콜에 표시된 대로 데이터 수집 시스템을 구성합니다. 이 시스템에는 준비물 아래에 고출력 적색 LED가 필요하며, 제곱밀리미터당 0.238밀리와트로 플라이를 비출 수 있는 위치에 있어야 합니다.

이제 csChrimson 발현에서 펄스 적색광을 사용하여 시냅스전 뉴런을 광유전학적으로 활성화합니다. 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 테트로도톡신을 적용하기 전에 40밀리초의 광 펄스에 대한 반응으로 시냅스 연결을 볼 수 있어야 합니다.

응답이 없다는 것은 연결 가능성이 없음을 의미합니다. 그에 따라 홀딩 포텐셜은 흥분성 또는 억제성 연결을 강조하기 위해 조정될 수 있습니다. 연결이 확인되면 식염수에서 재순환을 위해 식염수 풍부를 설정합니다.

수조의 식염수 수치가 안정적으로 유지되도록 펌프를 설정하십시오. 그런 다음 1마이크로몰의 최종 농도를 위해 시스템에 충분한 테트로도톡신을 추가합니다. 이렇게 하면 패치된 뉴런의 스파이크 활동이 중지됩니다.

그렇지 않은 경우 시스템에 더 많은 테트로도톡신을 추가하십시오. 이제 짧은 적색 광 펄스를 적용하여 단일 시냅스 연결일 가능성이 있는 것을 활성화합니다. 그런 다음 순환 식염수에 약리학적 길항제를 추가하여 시냅스 연결의 화학적 성질을 테스트합니다.

민감한 나트륨 채널 노치백에서 테트로도톡신의 형질전환 발현은 뉴런의 흥분성을 구하고 큰 고원 전위를 초래합니다. 더듬이 엽의 중간뉴런은 냄새에 반응합니다. 그러나 흥분성 시냅스 후 전류는 소마에서 쉽게 해결되지 않습니다.

그렇다면, 반응은 후각 수용체 뉴런 입력에서 직접 발생합니까? tERP를 사용하면 후각 수용체 뉴런이 국소 인터뉴런과 직접 연결되어 있음을 알 수 있습니다. 더듬이 엽(antennal lobe)에 있는 세로토닌성 뉴런(serotonergic neuron)의 자극은 국소 중간뉴런(interneuron)에서 흥분(excitation)과 억제(inhibition)의 혼합을 초래합니다.

광범위한 5HT 수용체 길항제인 메티서지드(methysergide)의 적용은 느린 과분극을 차단했지만 탈분극에는 영향을 미치지 않은 반면, 메카밀아민은 빠른 탈분극을 차단합니다. 이것은 자극이 콜린성임을 암시합니다. tERP는 GABA 또는 신경조절제에서 발생하는 시냅스외 부피 전달을 해결하는 데 사용되었습니다.

한 가지 예에서, 테트로도톡신의 적용은 국소 중간뉴런에서 억제 신호를 억제하지 않았습니다. 이 억제는 세로토닌 길항제인 메티세르지드(methysergide)를 사용하여 차단되었으며, 이는 특정 세로토닌 뉴런의 직접 신호를 암시합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 초파리 뉴런에서 전체 세포 기록을 얻고 tERP를 사용하여 전도도를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 인내심을 갖고 어려운 해부를 반복해서 연습하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 화학적 시냅스의 특성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 약리학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

테트로도톡신으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이러한 절차를 수행하는 동안 항상 장갑을 착용하고 소량으로 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.