Name: Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 학습하세요 Drosophila에서 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 이용한 단일시냅스 연결 전기생리학적 평가 방법을. 이 기법은 시냅스의 화학적 특성을 밝히고 신경 회로 연구에 활용됩니다.

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우리는 의견에 대 한 사려깊은 검토 뿐만 아니라 여호수아가 수, 조나단 Schenk, 원고에 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 벤 화이트와 해 롤 드 Zakon는 기술에 대 한 토론에 감사 하 고 싶습니다. 조나단 Schenk 그림 3A에 대 한 데이터를 제공합니다. 이 작품은 Whitehall 재단 보조금과 QG NIH R21에 의해 지원 되었다.

1. 파리와 식별 GAL4 발기인 라인 준비
<ol><li>GAL4 발기인 라인을 선택 하 고 파리 UAS-NaChBac transgene과 활성화를 위한 optogenetic transgene 크로스. 참고: UAS-CsChrimson11 는 그것의 높은 전도도 및 NaChBac 중재 활동 전위를 활성화는 쉽게 선택 됩니다. UAS-NaChBac 및 UAS-CsChrimson 블루밍턴 주식 저장소에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>에탄올 (35mm)에서 재고 솔루션으로 모든 trans 망막을 준비 하 고-20 ° c.에 냉장고에서 솔루션을 저장</li>
	<li>Rehydrated 감자의 약 5 mL에이 주식의 믹스 28 µ L 음식 찌 질 하 고 기존의 초파리 매체의 유리병의 상단에이 혼합물을 추가.</li>
	<li>1-3 일110.2 m m 모든-trans-망막을 포함 하는 음식에 csChrimson을 표현 하는 성인 파리를 올립니다.</li>
</ol>2. 준비 TTX 주식
<ol><li>증류수 또는 이온을 제거 된 물에서 1mm TTX의 재고 솔루션을 만듭니다. 몇 달 동안 실험실 냉장고에이 솔루션을 저장 합니다. 많은 기관 분류 유해 또는 제어 물질 TTX TTX의 저장에 관한 기관 정책 확인.</li>
</ol>3. 전기 생리학에 대 한 파리 준비
<ol><li>1-3 일 오래 된 성인 파리 발생 하는 모든-trans-망막에와 함께 음식에 수집 합니다. 참고: 패치 초파리 신경12,13클램핑에 대 한 자세한 설명에 대 한 2013 년에 목요일와 터너를 참조 하십시오.</li>
	<li>유리 섬광 유리병에 파리를 넣어. 파리를 무력화를 1 분 동안 얼음에 유리병을 놓습니다.</li>
	<li>굵은 집게를 사용 하 여 비행 주문 품 기록 챔버에 삽입. 3 ½"원형 레이저 1/16" 아크릴에서 잘라 챔버에 의하여 이루어져 있다. 사용자 지정 호 일 2 부분 에폭시를 장착 하는 센터에 컷 ¾"구멍 이다. 호 일 포함는 삼각형 모양의 비행에 삽입 되는 희망 합니다.</li>
	<li>왁 스 또는 UV 경화 에폭시 단단히 챔버 내에 기록 그것을 확보 하 여 동물의 주위에 적용 됩니다.</li>
	<li>시각화는 stereomicroscope 아래 목이 광섬유와 대비를 밝게. 간접 조명에 대 한 목이 섬유 그렇게 그들은 측면에서 직접 비행을 밝히는 그들을 조정 하 여 설정 합니다.</li>
	<li>가장 낮은 가능한 설정의 명확한 시각화 수 있습니다 가벼운 수준을 조정 합니다. 이 빛의 강도 개별 실험에 걸쳐 달라 집니다. 참고:이 프로토콜 적응 시킬 수 있다 방법14explant에서 원래의 뇌 를 사용 하 여.</li>
	<li>외부 기록 식 염 수를 검색 합니다. M m에는 염 분 포함: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-트리 스 (hydroxymethyl) 메 틸-2-aminoethane-sulfonic 산, 8 트 레 할 로스, 포도 당 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2포4, 1.5 CaCl2및 4 MgCl2 (270-275 m ω를 조정). 염 분 95% O2/5% CO2 (carbogen) 버블링 됩니다 하 고 pH 7.315조정 했다.</li>
	<li>장소 세포 외 기록 염 분의 4-6 방울 비행 준비. 이 시점에서, 더 나은 시정을 위한 해 부 현미경에서 가벼운 수준을 높입니다.</li>
	<li>전기 분해를 사용 하 여 텅스텐 와이어에 선명 하 게. 통신을 하려면 알 것3 의 포화 솔루션을 준비 하 고 끝은 날카롭게 때까지 20 번 각 100 ms 대 한 솔루션으로 와이어의 끝을 찍기 동안 약 20 V의 교류 전류를 적용 합니다. 날카롭게 텅스텐 와이어를 사용 하 여 비행 하 고 따라서 뇌를 노출의 머리에 표 피를 제거 하.</li>
	<li>더욱 기도 그것을 둘러싸고 있는 지방 시체를 제거 하 여 뇌를 노출 합니다. 더듬이 돌출부를 액세스 하는 경우 부드럽게 가시성을 높이기 위해 챔버를 기록 하는 호 일 아래 안테나 턱 구부러진된 텅스텐 와이어 또는 유사한 도구를 사용 합니다. 날카로운 집게를 사용 하 여 부드럽게 찢 어 떨어져 녹음 만들 수 관심의 영역을 다루는 glial 넣기.</li>
	<li>전기 생리학 장비에 기록 챔버를 전송 합니다. 즉시 외부 기록 식 염 수와 시작 관류 carbogen 두뇌를 보존 하와 버블링. 염 저수지 현미경 무대 위에 배치 되 고 중력-먹이로 준비. 진공 라인과 2 L 삼각 플라스 크를 사용 하 여 폐기물 염 분을 수집.</li>
</ol>4. 얻을 전체 세포 기록
<ol><li>상업적인 피펫은 끌어당기는 패치 펫을 당겨. 7 m ω 근처 팁 저항 적절 한 피 펫을 달성 하기 위해 설정에 대 한 설명서를 참조 하십시오.</li>
	<li>패치 피 펫에 내부 기록 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 내부 식 염 수로 구성 되어 140 칼륨 aspartate 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 나3GTP, 1 EGTA, 1 m m에서 KCl.</li>
	<li>전체 세포 기록에 대 한 패치 클램프 앰프를 설정 합니다. 앰프의 오프셋 0 고 테스트 펄스를 제공 하는 앰프를 설정 합니다. 여기, 오전 시스템 패치 클램프 증폭기 2400 사용 됩니다.</li>
	<li>피펫으로 통해 긍정적인 압력을 적용 하는 셀. 피펫으로와 셀 문의 micromanipulator를 사용 합니다. 긍정적인 압력을 릴리스 합니다. 설정-60 막의 지주 잠재력 mV. 피펫으로 낮은 하위 피코 현재 들고 알 수 있듯 셀의 막과 gigaohm 물개를 형성 한다. 참고: 경우 GFP를 사용 하 여 셀을 대상으로 안내, ChR2 활성화 및 잠재적인 시냅틱 우울증을 방지 하기 위해 epifluorescent 빛의 사용을 최소화 하십시오. 또한 5 단계를 적용 하기 전에 몇 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>-50에서 테스트 펄스를 제공 하는 앰프 설정 mV-60 ~ mV. 이 설정은 패치 클램프 앰프에 표준입니다. 테스트 펄스는 큰 capacitative 과도 대표 현재 필요한 패치 피펫으로 충전을 발표할 예정 이다. 2400 오전에 용량 보상 손잡이 조정 하 여 capacitative 과도 또는 유사한 앰프를 제거 합니다.</li>
	<li>세포 막 파열 하 고 전체 셀 구성에 부정적인 압력의 짧은 펄스를 적용 합니다. 참고: 모든 셀 구성 신경의 커패시턴스를 보여주는 capacitative 과도 있는 큰 증가 있을 때 관찰 됩니다. 현재 지주 (초기)에 작은 증가 또한 관찰 가능성이 됩니다. 전류 클램프 모드를 앰프를 설정 하 고 조정-60-50 하 셀의 잠재력 mV.</li>
</ol>5. 시 냅 스 연결 테스트
<ol><li>광 펄스를 생성 하는 LED 드라이버를 방 아 쇠를 데이터 수집 (DAQ) 시스템을 구성 합니다. 여기, 내쇼날인스트루먼트 DAQ 시스템 Matlab와 LED 드라이버는 아날로그 신호를 제공 하는 데 사용 됩니다. LED 휘도 아날로그 신호는 드라이버를 통해 조정 됩니다. LED는 620-630 nm 파장 LED입니다.</li>
	<li>고성능 적색 LED 직접 준비 아래 위치. 0.238 mW/m m2 에 도달 하면 즉시 빛의 강도 조정 합니다.</li>
	<li>연 접 신경 postsynaptic 세포의 관심에서 녹음 하는 동안 활성화 됩니다. 셀 활성화 optogenetically, pharmacogentically, 달성 또는 신경 자극을 통해. 여기, csChrimson 및 빨간 빛의 짧은 펄스 적용 됩니다. 참고: EPSPs로 전류 클램프 또는 EPSCs로 전압 클램프에 시 냅 스 연결을 모니터링할 수 있습니다. 시 냅 스 연결 40 ms 빛 펄스 응답에 TTX를 적용 하기 전에 표시 됩니다. 연결을 관찰 하는 경우에, 그것은 가능성이 그 뉴런 synaptically 연결 중 모노-또는 polysynaptically. 잠재적인 들고 따라 흥분 성의 또는 금지 연결을 강조 하 고 조정할 수 있다.</li>
	<li>연결 1의 최종 농도 달성 하기 위해 관류 시스템에 TTX를 추가 정상적인 염 분에서 관찰 되는 경우 µ M. 사용 recirculating 펌프를 캡처하고 TTX를 보존 하기 위해 염 분을 다시 사용 합니다. 연동 펌프는 목욕에서 염 분 해결책을 그릴 하 고 염 분이 저수지에 반환.</li>
	<li>상승 및 하강에 목욕에서 염 분 수준을 허용 하지 않는 강한 일정 한 진공을 제공 하는 펌프의 속도 조정 합니다. 참고: TTX의 응용 프로그램 전체 셀에서 모니터링 되 고 신경에 활동 급상승의 발생 한다. 이 충분 한 TTX는 식 염 수에 추가 된 확인 합니다.</li>
	<li>빨간 불 (40 ms 각 펄스에 대 한)의 짧은 펄스를 다시 적용 합니다. 이 시점에서 남아 있는 어떤 시 냅 스 연결 높습니다 monosynaptic. TTX에 남아 있는 시 냅 스 연결의 화학 본질을 테스트 하는 반복 식 염 수를 약리 길 항 제를 추가 합니다. 참고: optogenetics 및 형광 타겟팅 뉴런의 결합 때 수 있습니다 지속적으로 활성화 녹음을 얻기 위해 노력 하는 동안 신경의 연 접 인구 수는 없습니다. 이 시 냅 스 우울증으로 이어질 수 있다 고 어려운 연결을 볼 수 있습니다. 빨간색 fluorophore 신경 및 channel2rhodopsin 시각화를 사용할 수 있는 csChrimson 긴 여기 밴드 녹색 형광 단백질의 범위를 광범위 하 게 확장 하는, 때문에 (Ch2R) 세포 인구를 흥분 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 이렇게 특정 유전학 및 사용자 지정 필터 큐브 필요 합니다. 적당 한 파리를 생성 하려면 LexA 또는 Q 시스템 이진 식 시스템에서 빨간 fluorophore (RFP 또는 mCherry)를 표현 하는 파리를 확인 합니다. 이들은 파리 Gal4 발기인와 UAS-Ch2R 및 UAS-NaChBac 이펙터 유전자와 교차 해야 합니다. Epifluorescence에 대 한 최적의 필터 큐브 것입니다 빨간 fluorophore를 자극 하지만 하지 자극 Ch2R. 또한 좁은 여기 범위, 필터 세트 다량 방출된 빛을 수집 하는 긴 패스 방출 필터를 포함 해야 합니다. 우리 크로마 포함 부품 번호 et580/25 x와 (49306 세트)에서 t600lpxr에서에서 설정 사용자 지정 필터를 사용 하지만 et610lp 장벽/방출 필터.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

TERPS 분석 회로 확인 된 신경 세포 사이의 시 냅 스의 검출 함으로써 크래킹에 사용 되는 현재 기술을 칭찬. 특히, 접근 선택 인구 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac 신경의 흥분을 복원 하는 동안 TTX와 활동 전위를 광범위 하 게 입을 여 monosynaptic 연결을 보여준다. 시 냅 스 릴리스 postsynaptic 이벤트는 전체 셀 녹음과 모니터링 하는 동안 optogenetic 자극에 의해 elicited입니다. TERPS 대량 민감한 되 고 또는 더 긴 거리 및 약리 조작을 수행할 수 있는 능력에 elicited 볼륨 전송에 의해 파악 등 다른 접근 방식에서 자체를 구별. 기술은 고용 비교적 간단 하 고 시 냅 스의 사전 및 사후 시 냅 스 부분에 듀얼 전체 셀 녹음을 얻기 보다 더 가능 optogenetic 자극에 대 한 하나만 기록 전극과 광원을 요구 한다. TERPS의 기본적인 요구가 이다 활동 전위 되 고 시스템에 TTX에 의해 쉽게 차단 됩니다. 하지만, TTX 분류학 문의의 광범위 한 범위에 걸쳐...

신경 과학의 주요 목표는 정보 회로 통해 흐르는 하는 방법을 이해 하는 뉴런 사이의 연결을 매핑합니다. 수많은 접근 및 자원 모델 시스템1,2의 범위에서 신경 사이의 기능적 연결을 위한 테스트를 사용할 수 있게 있다. 전기 생리학을 사용 하 여 가장 정확한 배선 다이어그램을 생성 하기 위해 두 셀 사이의 관찰된 연결 인지 직접 및 간접 및 polysynaptic monosynaptic를 해결 하기 위해 중요 하다. 포유류 뉴런에이 구별을 만들기 위한 황금 표준 연 접 세포에서 단일 action potentials와 두 번째 뉴런 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs)의 발병 사이의 대기 시간을 측정 하는 것입니다. Monosynaptic 연결 몇 밀리초 및 낮은 다양성3의 짧은 대기 시간을 가져야 한다. 이 방법은 복잡할 수 있다 무척 추 동물 신경 세포에 시 냅 스 탐지 postsynaptic conductances와 녹음 사이 긴 electrotonic 거리 때문에 지연을 일으키는 체세포 녹음 사이트까지 그들의 dendrites에서 발생할 수 있기 때문에 전극입니다. 이러한 지연을 모호성에 관한 많은-monosynaptic 기여 대 발생할 수 있습니다. 또한, 작은 시 냅 스 이벤트 체세포 녹음 사이트에 도달 하기 전에 부패 수 있습니다 하 고 polysynaptic 이벤트를 모집 하는 강한 연 접 활동, 운전.
무척 추 동물에 monosynaptic 연결에 대 한 테스트를 다양 한 기법 개발 되었습니다. 한 가지 방법은 초과 ++ Mg 및 Ca+ +를 포함 하는 높은 divalent 양이온 솔루션 (안녕-디)를 사용 합니다. 이 솔루션 줄이는 릴리스 확률 및 monosynaptic 입력된4,5의 탐지를 증가 활동 전위 임계값에 의해 polysynaptic 연결을 차단 합니다. 하지만 필요한 ca ++ ++ Mg의 정확한 비율을 결정, 사소한 이며 polysynaptic 기부금도 겸손 자극6지속 될 수 있습니다. GFP 재구성에서 시 냅 스 파트너 (이해) 라는 다른 접근은 monosynaptic 연결 7을 유추 시 냅 스에서 발견 하는 사전 및 postsynaptic 막 간의 근접 합니다. 여기, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구성 요소는 하나의 신경에 표현 하 고 분자의 상호 보완적인 조각 putative postsynaptic 파트너에 표시 됩니다. 형광의 존재 두 개의 뉴런 충분히 가까이에 GFP 분자의 재구성을 허용 하는 한 시 냅 스의 존재를 의미 나타냅니다. 이해 수 보고 시 냅 스 거짓, 하지만, 두 세포 막, 신경 또는 잘라냅니다 apposed 밀접 하 게 해야 하는 경우. 이해의 변종 활성 시 냅 스8에 재구성 되므로 synaptobrevin 직접 GFP의 연 접 부분을 밧줄로 매 여 이러한 가양성을 제거 합니다. 이해 및 그 변종 초파리 CNS 기능 연결을 결정 하는 수단이 되어, 하는 동안 일부 연결 하지 만들 수 있습니다 보이는 파악 하 여 사전 및 postsynaptic 파트너 사이의 거리는 비교적 큰 경우. 이것은 neuromodulation9 또는 GABAergic 억제10와 관련 된 볼륨 전송의 평가에 특히 관련입니다.
여기, 보완 및 새로운 기술은 초파리 CNS에에서 직접 monosynaptic 연결 테스트에 대 한 시연입니다. 테트로도톡신 (TTX)의 공동 식으로 작동 하는이 메서드를 테트로도톡신 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS),-저항 나트륨 채널, NaChBac, 및 상 상속에서 녹음 하는 동안 연 접 세포에서 optogenetic 활성 postsynaptic 파트너9. TTX, 존재 모든 활동 전위 중재 활동 NaChBac 표현 된 셀에 표시 되지 않습니다. NaChBac 채널 선택적으로 허용 하는 시 냅 스 전송 빛 갖는 대상된 연 접 셀에 흥분을 복원 합니다. 이 메서드는 연결 postsynaptically polysynaptic 회로 채용의 가능성을 줄이면서 체세포 녹음 하 여 해결할 수 연 접 신경의 강한 활성화를 허용 합니다. 중요 한 것은,이 기술은 볼륨 전송의 연구를 허용 하 고 회로 통해 하나의 신경에서 발표 하는 송신기의 확산을 보여준다. 또한, TERPS 기존의 약리학 통해 연결의 화학 본질을 밝힐 수 있다. TERPS는 TTX 구분 나트륨 수로의 유전자 변형 식 수 있도록 어떤 모델 시스템에 사용 하기 위해 적합 이다.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>신경 활성제로 사용됨</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>TTX는 규제 물질이므로 TTX를 구입하려면 특별 허가가 필요할 수 있습니다.</td></tr> 모든 <tr><td>트랜스 망막</td><td>Sigma-Aldrichall 트랜스-레티널</td><td>R2500</td>은 <td>채널로돕신</td></tr><tr><td>용접 가능한 321 스테인리스 스틸에 대한 보조 요인이 필요합니다&nbsp; 시트,&nbsp; 0.002"&nbsp; 두꺼운&nbsp; 10인치&nbsp; Wide</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>맞춤형 플라이 홀더를 만드는 데 사용됩니다. 사용자 정의 호일은 제공된 PDF 파일에서 pololu.com 레이저 절단 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>준비 해부에 사용</td></tr><tr><td>왁</td>서 <td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>호일에서 플라이를 확보하기 위해 해부 중에 사용</td></tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>Joann</td><td>4917217</td> 왁서 <td></td></tr><tr><td>번호 5 집게</td><td>Fine Science Tools</td>와 함께 사용됩니다<td>#5CO</td><td>해부 및 해</td></tr>부에 사용 <tr><td>해부 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>해부 중 큐티클의 일부를 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>텅스텐 와이어</td><td>A-M 시스템</td><td>797500</td><td>해부를 위한 날카로운 바늘을 만들기 위해 전기분해와 함께 사용</td></tr><tr><td>왕복 연동 펌프</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>재순환용 TTX</td></tr><tr><td>속도 컨트롤러 연동 펌프</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM 디밍 컨트롤러 LED 라이트 또는 리본, 12 볼트 8 암프, 조절 가능한 밝기 라이트 스위치 디머 컨트롤러 DC12V 8A 96W LED 스트립 라이트 B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp; 정밀 압축 공기 레귤레이터</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>패치 중 양압 적용용</td></tr><tr><td>유리 캡슐</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>패치 피펫용</td></tr><tr><td>다목적 게이지</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>게이지 압력 레귤레이터용</td></tr><tr><td>전기생리학 카메라</td><td>Dage MTI&nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>IR 범위(850nm)에서 작동하는 모든 카메라가 작동합니다. 당신은 csChrimson IR LED Thorlabs를 활성화할 수 있으므로 빨간색 조명을 사용하고 싶지 않습니다</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>M850F2</td><td></td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>커플 IR LED</td></tr> 대물 렌즈용 경사 조명 광섬유<tr><td>&nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>이것은 대부분의 미시체에 사용할 수 있으며 파리 뉴런을 시각화하는 데 적합합니다.</td></tr><tr><td>호박색 LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>RFP 및 mCherry</td></tr><tr><td>Blue 시각화 LED</td><td>Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>GFP</td></tr><tr><td>시각화 GFP 필터 세트</td><td>Chroma</td><td>49011</td><td>GFP 시각화 또는 채널 자극2rhodopsin</td></tr><tr><td>사용자 정의 mCherry 필터 세트</td><td>크로마</td><td>&nbsp; et580/25x 및 t600lpxr(49306 세트부터)이지만 et610lp 배리어/방출 광학 장치</td><td>식별된 뉴런을 channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic으로 패치하여 Amber와 blue LED</td><td>Thorlabs</td>를 결합하려는 경우에만 사용 <td>DMLP550R</td><td>mCherry 아래의 패치만 사용하고 channel2rhodopsin을 청색광으로 여기합니다.</td></tr><tr><td>적색 LED</td><td>LED공급</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>cs를 구동하는 데 사용됨Chrimson</td></tr><tr><td>LED 드라이버</td><td>LED공급</td><td>3021-D-E-1000</td><td>광유전학적 자극을 위한 LED를 구동하는 데 사용</td></tr><tr><td>매니퓰레이터</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>기록 중 피펫 위치를 지정하는 데 사용</td></tr><tr><td>Patchclamp Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2400</td><td>등가 증폭기가 적합합니다.</td></tr><tr><td>베셀 필터</td><td>워너 인스트루먼트&nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>패치 적용 중에 오실로스코프에 대한 전류 트레이스를 필터링하는 데 사용되는 보조 필터입니다.</td></tr><tr><td>데이터 수집 시스템&nbsp;</td><td>내쇼날인스트루먼트</td><td>NI PCIe-6321&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 781044-01</td><td>앰프에서 컴퓨터로 데이터를 기록하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>커넥터 블록 - BNC 터미널 BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>앰프를 DAQ 카드에 연결하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>스틸 호일&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>맞춤형 녹음 챔버용 스틸 호일</td></tr><tr><td>자석</td><td>K& J Magnetics</td><td>D42</td><td>링 스탠드에 녹음 챔버를 고정하려면</td></tr><tr><td>1/16" 셀 캐스트 아크릴 투명</td><td>폴룰루</td><td></td><td>맞춤형 녹음 챔버를 만드는 데 사용됩니다. 아크릴은 제공된 PDF 파일에서 pololu.com 레이저 절단할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 monosynaptic 연결 검사

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

여기, 새로운 기술은 불린다 Tetrotoxin (TTX) 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS) 대상 뉴런 간의 monosynaptic 연결에 대 한 테스트에 적용 됩니다. 메서드는 특정 연 접 신경에서 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac, 유전자 변형 활성기의 공동 식에 의존합니다. 상 상속 후 시 냅 스 파트너와 연결 TTX, NaChBac을 표현 하지 않는 뉴런의 전기 활동을 차단 존재 전체 세포 기록에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 활성 또는 연결의 기자로 서 칼슘 이미징 작업을 수정할 수 있습니다. TERPS 성장 네트워크에서 연결을 결정 하는 데 사용할 수 있는 도구 집합을 추가 합니다. 그러나, TERPS는 독특한에 또한 안정적으로 대량 또는 볼륨 전송 및 전송 일 좀 보고.

TERPS는 모노-및 뉴런 간의 시 냅 스 연결에 polysynaptic 기여 사이 구별 하는 데 사용 됩니다. 셀의 약한 자극 직접 연결을 테스트 하는 데 사용 될 수 있습니다, polysynaptic 연결 (그림 1A) 보충 자주 큰 연 접 활동을 운전 한다. TERPS 공동 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac와 optogenetic 활성기를 표현 하 고 polysynaptic 연결 (그림 1B)를 제거 하는 TTX의 연결을 테스트 하 여 작동 합니다. TTX는 TERPS (그림 2A)에 대 한 적절 한 준비 하기가 초파리 뇌의 활동 전위를 효과적으로 차단 합니다. NaChBac 나트륨 채널의 유전자 변형 식 구출 뉴런에 흥분 하며 큰 고원 잠재력 (그...

이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.

Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

이 기술의 전반적인 목표는 테트로도톡신 저항성 나트륨 채널을 사용하여 초파리에서 전기생리학적으로 단일 시냅스 연결을 식별하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 시냅스의 화학적 성질을 드러낼 수 있다는 것입니다. 또한 부피 또는 벌크 전송 연구에 적합합니다.일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 비디오에서는 해부의 어려움 때문에 어려움을 겪습니다. 그러나 단순히 방법을 이해하면 logic 를 마우스와 같은 다른 모델 시스템으로 쉽게 전송할 수 있습니다. 녹음을 위해 7메가옴 근처의 저항에 대한 패치 피펫을 준비하십시오.또한 pH 7.3 이하의 외부 기록 식염수를 95%의 산소와 5%의 이산화탄소를 함유한 탄수화물로 지속적으로 폭기해야 합니다. 피험자의 경우, 0.2 밀리몰의 모든 트랜스 레티날을 포함하는 음식에서 증식하는 csChrimson을 발현하는 플라이 스톡을 가지고 있습니다. 녹음의 경우 생후 1일에서 3일 된 성인을 선택합니다.유리 섬광 바이알에 넣고 얼음처럼 차가운 조건에 1분 동안 노출시켜 고정시킵니다. 그런 다음 해부 스코프와 거친 집게의 광 수준을 낮추어 마취된 파리를 맞춤형 녹음 챔버에 로드합니다. 왁스 또는 UV 경화 에폭시로 둘러싸서 플라이를 챔버에 고정합니다.호일이 흉부의 대략 절반 위로 올라가도록 등 쪽이 위로 향하게 놓습니다. 훌륭한 준비를 하는 열쇠는 호일의 구멍을 딱 맞는 크기로 잘라서 파리가 쥐어짜지거나 빠지지 않도록 하는 것입니다. 양쪽에서 광섬유 조명으로 준비물을 비추고 가능한 한 어둡게 유지하십시오.다음으로, 4-6방울의 식염수로 준비물을 덮습니다. 다음으로, 해부를 위해 텅스텐 와이어 또는 필라멘트를 날카롭게합니다. 질산칼륨 포화 용액에 약 20볼트의 AC 전류를 가하고 와이어 끝을 용액에 매우 빠르게 반복적으로 담그십시오.20회 담그면 팁이 날카로워집니다. 이제 큐티클을 제거한 다음 기관과 뚱뚱한 몸을 제거하여 뇌를 노출시키기 위해 날카로운 와이어를 사용할 수 있을 만큼 충분한 가시성을 제공하도록 조명을 조정합니다. 안테나 엽에 접근하려면 구부러진 텅스텐 와이어를 사용하여 안테나를 호일 차폐 아래에 부드럽게 밀어 넣습니다.그런 다음 날카로운 집게를 사용하여 관심 영역을 덮고 있는 신경교 외피를 부드럽게 뜯어냅니다. 이제 준비물을 전기 생리학 리그로 옮겨 녹음합니다. 리그에서 즉시 발탄제로 거품을 일으킨 식염수를 기록하여 제제를 관류하기 시작합니다.현미경 스테이지 위에 배치된 중력 공급 식염수 저장소를 사용합니다. 배설물을 수집하려면 진공 라인과 2리터 플라스크를 사용하십시오. 다음으로, 패치 피펫에 4마이크로리터의 내부 기록 용액을 넣고 피펫을 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다.그런 다음 증폭기의 오프셋을 0으로 설정하고 테스트 펄스를 전달하도록 증폭기를 설정합니다. 그런 다음 뇌를 명확하게 볼 수 있도록 IR 경사 조명을 조정합니다. 이제 피펫에 양압을 가하면서 피펫으로 세포에 접근합니다.세포와 접촉이 이루어지면 양압을 해제하여 피펫을 멤브레인에 밀봉합니다. 그런 다음 멤브레인의 유지 전위를 -60 밀리 볼트로 설정하십시오. 그리고 피펫은 세포막과 함께 기가옴 밀봉을 형성해야 합니다.유지 전류는 낮은 서브 피코암페어 수준으로 떨어져야 합니다. 일정한 기가옴 밀봉을 얻으려면 양압을 유지하여 피펫을 깨끗하게 유지하고 조직에 부딪히거나 세포에 접근하지 않도록 하십시오. 계속하려면 테스트 펄스를 영하 50에서 영하 60밀리볼트까지 전달하도록 증폭기를 설정하십시오.테스트 펄스는 패치 파이펫을 충전하는 데 필요한 전류를 나타내는 큰 용량성 과도 현상을 나타냅니다. 용량성 과도 현상을 제거하려면 증폭기의 용량 보상 손잡이를 조정하십시오. 이제 짧은 음압 펄스를 가하여 세포막을 파열하고 전체 세포 구성을 얻습니다.용량성 과도 현상이 크게 증가하면 성공을 나타냅니다. 유지 전류의 약간의 증가도 관찰해야 합니다. 그런 다음 증폭기를 현재 cl로 설정합니다.amp 모드.그리고 전지의 전위를 영하 50에서 영하 60밀리볼트 사이로 조정하십시오. 준비 과정에서 기술 프로토콜에 표시된 대로 데이터 수집 시스템을 구성합니다. 이 시스템에는 준비물 아래에 고출력 적색 LED가 필요하며, 제곱밀리미터당 0.238밀리와트로 플라이를 비출 수 있는 위치에 있어야 합니다.이제 csChrimson 발현에서 펄스 적색광을 사용하여 시냅스전 뉴런을 광유전학적으로 활성화합니다. 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 테트로도톡신을 적용하기 전에 40밀리초의 광 펄스에 대한 반응으로 시냅스 연결을 볼 수 있어야 합니다.응답이 없다는 것은 연결 가능성이 없음을 의미합니다. 그에 따라 홀딩 포텐셜은 흥분성 또는 억제성 연결을 강조하기 위해 조정될 수 있습니다. 연결이 확인되면 식염수에서 재순환을 위해 식염수 풍부를 설정합니다.수조의 식염수 수치가 안정적으로 유지되도록 펌프를 설정하십시오. 그런 다음 1마이크로몰의 최종 농도를 위해 시스템에 충분한 테트로도톡신을 추가합니다. 이렇게 하면 패치된 뉴런의 스파이크 활동이 중지됩니다.그렇지 않은 경우 시스템에 더 많은 테트로도톡신을 추가하십시오. 이제 짧은 적색 광 펄스를 적용하여 단일 시냅스 연결일 가능성이 있는 것을 활성화합니다. 그런 다음 순환 식염수에 약리학적 길항제를 추가하여 시냅스 연결의 화학적 성질을 테스트합니다.민감한 나트륨 채널 노치백에서 테트로도톡신의 형질전환 발현은 뉴런의 흥분성을 구하고 큰 고원 전위를 초래합니다. 더듬이 엽의 중간뉴런은 냄새에 반응합니다. 그러나 흥분성 시냅스 후 전류는 소마에서 쉽게 해결되지 않습니다.그렇다면, 반응은 후각 수용체 뉴런 입력에서 직접 발생합니까? tERP를 사용하면 후각 수용체 뉴런이 국소 인터뉴런과 직접 연결되어 있음을 알 수 있습니다. 더듬이 엽(antennal lobe)에 있는 세로토닌성 뉴런(serotonergic neuron)의 자극은 국소 중간뉴런(interneuron)에서 흥분(excitation)과 억제(inhibition)의 혼합을 초래합니다.광범위한 5HT 수용체 길항제인 메티서지드(methysergide)의 적용은 느린 과분극을 차단했지만 탈분극에는 영향을 미치지 않은 반면, 메카밀아민은 빠른 탈분극을 차단합니다. 이것은 자극이 콜린성임을 암시합니다. tERP는 GABA 또는 신경조절제에서 발생하는 시냅스외 부피 전달을 해결하는 데 사용되었습니다.한 가지 예에서, 테트로도톡신의 적용은 국소 중간뉴런에서 억제 신호를 억제하지 않았습니다. 이 억제는 세로토닌 길항제인 메티세르지드(methysergide)를 사용하여 차단되었으며, 이는 특정 세로토닌 뉴런의 직접 신호를 암시합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 초파리 뉴런에서 전체 세포 기록을 얻고 tERP를 사용하여 전도도를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 인내심을 갖고 어려운 해부를 반복해서 연습하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 화학적 시냅스의 특성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 약리학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.테트로도톡신으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이러한 절차를 수행하는 동안 항상 장갑을 착용하고 소량으로 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

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Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

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