Name: 5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 5-브로모우리딘 라벨링과 면역침전을 활용한 RNA 합성 측정 방법을. HEK293T 세포 배양에서 RNA 대사 변화를 정량 분석하고, RNA 수준 변화가 합성률 변화에 의한 것인지 확인할 수 있습니다.

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Lundbeck 재단 아후 스 대학, Dandrite와 Lundbeck a/S 지원이 작품.

참고: 달리 명시 되지 않은 실 온에서 모든 단계를 수행 하 고 얼음 이나 냉장고 (를 제외 하 고는 차입에서 SDS를 포함 하는 버퍼) 버퍼를 유지. 프로토콜 5 섹션으로 나뉘어져: 준비의 RNA 샘플; ip; 구슬의 준비 구슬;에 RNA BrU 표시의 바인딩 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출;에 의해 바운드 BrU 셔 서 RNA의 정화 (실시간 정량 Pcr를 사용 하 여이 예제)에서 RNA의 분석
1입니다. RNA 샘플의 준비
<ol><li>자동화 된 셀을 사용 하 여 카운트 HEK293T 셀 카운터와 10 mL 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 및 50 µ g/mL 페니실린/스)에서 10 cm 배양 접시에서 3,500,000 셀의 합계를 씨앗 > 40 µ g RNA 따라 추출 48 h 후. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합니다.</li>
	<li>시드, 후 48 h 8 mL 성장 매체를 발음 하 고 셀 밖으로 건조를 피하기 위해 2 mL를 남겨두고. 2mm BrU를 추가 하 고 모든 치료 8 mL를 발음 하는 성장 매체, 그리고 8 mL BrU 포함 성장 매체를 다시 적용 하기 전에 셀에서 잔여 2 mL를 제거. 이 유전자 발현에 변화를 일으킬 수 있기 때문에, 세포는 BrU의 응용 프로그램에 따라 신선한 미디어 사용을 하지 않습니다.</li>
	<li>BrU와 치료 1 시간에 대 한 셀을 품 어. 5 mL 행 크의 버퍼에 셀을 세척 하 고 2 mL 0.05% 트립 신을 사용 하 여 셀을 trypsinize. 8 mL 성장 미디어 반응을 중지, 15 mL 튜브에 세포를 전송 1000 x g 2 분에 대 한 셀 아래로 회전을 추가 합니다.</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 RNA 격리를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 총 RNA 추출 키트 ( 재료의 표참조) 또는 다른 메서드를 선호 하 고 진행 준비까지-80 ° C에서 RNA RNase 무료 H2o. 저장소에에서 elute.</li>
</ol>2입니다. 준비 구슬의 IP에 대 한
<ol><li>조사를 더하기 하나 pipetting 동안 손실에 대 한 계정 및 혼합 소용돌이 추가 샘플 수에 대 한 배치에 비즈를 준비 합니다. 회전 혼합 하 여 철저 하 게 반대로 마우스 IgG 자석 구슬 resuspend 고 RNase 무료 1.5 mL 튜브에 샘플 당 20 µ L 구슬 꺼내. 장소는 마그네틱 스탠드에는 구슬을 두고 약 20 s 1.5 mL 튜브에 수집.</li>
	<li>제거는 상쾌한, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 꺼내와 pipetting으로 400 µ L 1 x BrU IP 버퍼에서 resuspend. 아주 짧게 2에 대 한 튜브를 회전 탁상 원심 분리기에 s 마그네틱 스탠드에 다시 배치 하 고는 상쾌한 제거. 한 번 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>헤 파 린을 사용 하 여 구슬 블록 난다 바인딩입니다. 1 ml 1 구슬 resuspend x BrU-IP + 1 mg/mL 헤 파 린 버퍼, 그리고 회전 30 분 세척을 위한 구슬, 단계 2.2에서 두고. 참고: 헤 파 린은 RNAs 바인딩을 위해 경쟁할 것 이다 마이너스로 충전 된 중합체 이다. tRNA 또는 다른 관련이 없는 RNAs 또한 사용할 수 있습니다 경우 다운스트림 응용 프로그램 시퀀싱 하지.</li>
	<li>BrU IP 버퍼 x 1 ml 1 구슬 resuspend 고 추가 1.25 µ g/샘플 안티-α-Bromodeoxyuridine 항 체, BrU 인식 합니다. 1 시간에 대 한 구슬 회전 하는 동안 품 어 또는 실 온에서 하룻밤.</li>
	<li>세척 단계 2.2에서 세 번 비즈. 1mm BrU와 떠나 난다 바인딩 IP 중의 위험을 구슬 하 고 이로써 항 체의 감도 낮추는 30 분 회전 보충 50 µ L/샘플 1 x BrU IP 버퍼에 구슬 resuspend.</li>
	<li>3 번 단계 2.2에서 구슬 세척 하 고 50 µ L/샘플 1xBrU-IP 버퍼에서 resuspend.</li>
</ol>3. 구슬에 RNA BrU 표시 바인딩
<ol><li>1.3 단계에서 RNA 추출에서 RNA 농도 측정 자외선 보이는 분 광 광도 법, 사용 하 고 40 µ g RNA 각 샘플에서 RNase 무료 H2O 200 µ L의 총 볼륨을 희석.</li>
	<li>열 변성 RNA와 짧게 탁상 원심 분리기에서에서 회전에 80 ° C에서 2 분 동안 RNA 샘플. BrU-IP + BSA/RNAse 억제제 x 200 µ L 2를 추가 합니다.</li>
	<li>50 µ L resuspended과 구슬 단계 2.6에서에서 각 샘플을 준비 하 고 회전 1 h. 세척 4 번 단계 2.2에서 구슬을 두고 추가 합니다.</li>
</ol>4. 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출에 의해 RNA의 정화
<ol><li>
RNA을 elute 및 페 놀 추출
	<ol>
<li>RNA, elute 200 µ L 차입 버퍼에 구슬 resuspend 그리고 그 후 신속 하 게 추가 200 µ L 페 놀, pH 6.6 (주의: 독성, 참조 단계 4.1.2 아래) 샘플에서 어떤 비 RNA 분자를 제거 하.</li>
		<li>회전 혼합 샘플, 그리고 스핀 탁상 원심 분리기에 25000 x g에서 3 분. 참고: 페 놀 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 약 산 성 pH RNA 및 DNA 하지 추출 됩니다 보장 합니다. RNA의 친수성 특성상 위 수성 단계에서 유지 됩니다. 단백질의 소수 성 코어 페 놀을 바인딩할 하 고 낮은 유기 페 놀-단계로 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
페 놀-클로 프롬 추출
	<ol>
<li>(처리에 경험에 따라 200 µ L의 약 190 µ L) 가능한 만큼 위 단계를 발음 하 고 200 µ L 페 놀/클로 프롬, pH 6.6 튜브로 이동 (주의: 독성, 참고). 샘플에 걸쳐 동일한 금액을 발음 해야 합니다.</li>
		<li>소용돌이 샘플 스핀 25000 x g에서 3 분에 대 한 믹스. 참고: 클로 프롬 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 클로 프롬 반전 녹음 방송14 및 중 합 효소 연쇄 반응을15를 억제 하 여 RNA의 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 페 놀 제거에 추가 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(지금 약 180 µ L), 앞으로 수성 위 단계 발음 하 여 클로 프롬 적 출을 수행 하 고 200 µ L 클로 프롬을 포함 하는 관에 전송. 소용돌이 샘플을 혼합 하 고 스핀 25000 x g에서 3 분.</li>
	<li>(지금 약 170 µ L) 앞으로 수성 위 단계를 발음 하 고 17 µ L (1/10 볼륨) 3 M 채널3COONa, pH 6.0 포함 된 튜브에 그것을 전송. 중화 하 고 수성 해결책에서 RNA를 침전, RNA와 함께 침전 하 고 RNA 펠 릿을 더 보이는 게 2 µ L glycogen (20 mg/mL)을 추가 합니다.</li>
	<li>몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 RNA와 혼합 소금 이온 사이의 바인딩을 증가 500 µ L 96% 에탄올을 추가 합니다. 드라이 아이스에 하룻밤-20 ° C에서 15 분 튜브를 둡니다.</li>
	<li>25000 x g, 4 ° C는 펠 렛을 방해 하지 않고 30 분 삭제 상쾌한에 샘플을 회전 하 고 모든 잔여 소금 제거 하려면 185 µ L 75% 에탄올에 펠 릿을 세척. 25000 x g, 5 분 동안 4 ° C에서 회전 합니다.</li>
	<li>펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한을 완전히 삭제 하 고 열린 뚜껑으로 5 ~ 10 분 건조 펠 릿을 둡니다. RNase 무료 H2O 튜브의 측면에 적용 되는 펠 렛을 방해 하지 않으려면 10 µ L resuspend.</li>
</ol>5입니다. RNA의 분석
<ol><li>CDNA cDNA 반전 녹음 방송을 사용 하 여 준비 ( 재료의 표참조) 장비 또는 선호 하는 다른 방법을 사용 하 여 2 µ L RNA 샘플 및 1 µ g 효 모 총 RNA RNA 매체로 cDNA 합성 반응 (사용 되지 않음 cDNA 다음 세대 시퀀싱에 사용 하는 경우)에 대 한. 효 모 RNA 없이 1 µ g RNA를 사용 하 여 해당 입력의 cDNA 준비에 대 한.</li>
	<li>희석 cDNA 1시 25분와 혼합 희석 9 µ L cDNA 10 µ L 정량으로 마스터 믹스와 1 µ L fluorogenic 프로브, 두 재료의 테이블에에서 지정 된. 참고: cDNA 희석 cDNA 준비 및 사용 되는 정량 Pcr 방법에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>(예를 들어, 7500 빠른 실시간 PCR 시스템 또는 동등한) 다음 정량 프로그램 실행: 50 ° C, 20에서 2 분 95 ° C, 3의 40 주기에서 s s 95 ° C와 30에서 60 ° c.에 s</li>
</ol>

<ol><li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase+2+modulates+%CE%B1-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li>
<li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRIC-seq%3A+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+and+its+Misregulation+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.</a> Cell. 152, 1237-1251 (2014).</li>
<li>Farrer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kindreds+with+parkinsonism+and+%CE%B1-synuclein+genomic+multiplications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications.</a> Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).</li>
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<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li>
<li>Dölken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li>
<li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li>
<li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li>
<li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 RNA 생산 새로 라벨의 결정 BrU, 즉각적인 RNA 추출 및 BrU 셔 서 RNA의 immunoprecipitation와 1 시간에 대 한 RNA를 생산을 위한 BrU IP의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 참조16에서 설명한 하 고이 문서를 페 놀-클로 프롬 정화 단계 BrU의 낮은 농도와 미리 치료 구슬 IP 특이성 및 RNA 순도 증가 몇 가지 추가 단계를 포함 IP 다음 RNA 순도 증가. 또한, 우리는 또한 여기 BrU IP의 특이성 BrU와 비 BrU에서 캡처한 RNA를 비교 하 여 보여주는 데이터 제시 세포 치료. 페 놀-클로 프롬 정화 저렴 한, 하지만 부 순으로 표시 하는 RNA의 낮은 금액을 고려 하면 다운스트림 분석에서 증가 신호 대신 RNA 청소 키트를 사용 하 여 가져올 수 있습니다. 그러나 우리의 경험, 이다, 샘플에서 RNA의 가장 동등한 추출 페 놀-클로 프롬 정화를 사용 하 여 얻어진 다.
<p class="jove_content"...

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) 없이 세포에서 RNA 생산의 연구 또는 매우 제한 된 효과에 짧은 기간1,2라벨 동안 생리학 세포. 메서드는 안티-BrU 항 체 (그림 1)를 사용 하 여 이라는 RNA의 IP에 의해 새로 합성된 RNA로 부 순 뒤 합성 uridine 파생의 기반으로 합니다.
수십 년간 그 단백질 합성은 transcriptionally 통제 될 수 있다, 그리고 녹음 방송 요인의 존재는 이상의 50 년 전 가설 되었다 알려져 있다3. 오늘, 그것은 여러 가지 질병은 전사 및 RNA 안정성의 dysregulation에 의해 발생 알려져 (참조4보충 그림 S1), RNA 생산에 변화를 측정 하는 능력은 이해 질병에 매우 중요 하 고 개발입니다.
다른 한편으로, RNA 생산 규제 도구 너무 적은 또는 너무 많은 단백질 식 또는 파 킨 슨 병 (PD)에 같은 단백질 축적으로 인 한 질병 치료를 위한 새로운 가능성을 제공 합니다. 주된 단백질 축적으로 불용 성 집계 PD에서 α-synuclein 이며 α-synuclein 유전자의 유전자 곱셈 발생 가족 PD5α-synuclein의 수준, 질병에 직접 연결 합니다. 또한, α-synuclein 농도 의존 방식으로 집계합니다. Α-synuclein mRNA 수준의 Downregulation 그러므로 성공적으로 달성 하고있다 RNA 간섭 PD 설치류 모델6,7에 신경 세포 손실 감소를 사용 하 여 흥미로운 치료 전략 이다.
그것은 질병 또는 치료 내정간섭에 기인 하는 RNA 생산의 변화를 측정할 수 있을 해야 합니다. 첨단 방법 등 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량), 뒤 반전 녹음 방송 RNA의 측정 정상 상태 수준은 구별 또는 transcriptional 규칙에 의해 발생 하는 변경의 수 변경 RNA 안정성입니다. RNA 감소율의 조사를 위해 널리 사용 되는 방법은 transcriptional 기계 화합물 α-amanitin 악티노마이신 D 뒤에 부패 RNAs의 측정 등을 사용 하 여 차단 합니다. 그러나, 세포 apoptosis8,9의 유도 등에서 전사의 전반적인 방해와 관련 된 몇 가지 문제가 있다. 세포 독성 효과 옆에 transcriptional 억제제는 또한 느린 세포질 통풍 관에 α-amanitin 악티노마이신 D (참조10검토)의 특이성의 부족 등 여러 가지 기술적인 문제를 제시.
전사의 전반적인 막힘을 피하기 위해, 뉴클레오티드 아날로그 사용 되었습니다, 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU), 부 순 등. 이들은 쉽게 포유류 세포에 의해 채택 고 새로 합성된 RNA, RNA의 특정 시간 프레임 내에서 펄스 라벨 사용에 통합. BrU 5-EU와 4-부 엉, 보다 적은 독성 그것은 선택11,12의 기본 아날로그.
BrU IP RNA 합성 속도, 안정성 모두를 조사 하 고 따라서 총 RNA에 변화의 근본 원인 사이 구별을 사용할 수 있습니다. 이 문서는 RNA 합성의 측정에 초점을 것입니다 고2 RNA 안정성의 조사에 대 한 자세한 내용은 참조를 참조. RNA 합성을 조사, 세포는 BrU 예 1 h BrU-IP1 (그림 1C) 다음으로 이라는 짧게. 이 시간 내에 짧은 라벨 합성 하는 RNA의 측정을 가능 하 게 하 고 관찰 된 변화 보다 RNA 합성에 실시간 정량 하 여 총 RNA에 변화를 측정 하 여 규정의 더 나은 견적을 줄 것 이다. 그러나 그것은,, 그 라벨에, 예를 들어 1 h만 하더라도 저하 아직도 있을 수 있다 관찰 RNA 수준에 영향을 미치는 언급 한다.
BrU IP 실험에서 RNA는 실시간 정량1 또는 다음 세대 시퀀싱2,13다운스트림 분석에 적합 합니다. 다른 표준 RNA 검출 방법, 북부에 게 더 럽 히기 등 ribonuclease 보호 분석 결과, 특정 RNAs에 적용할 수도 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Ribolock Rnase 억제제</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bromodeoxyuridine mouse 항체</td><td>BD Bioscience</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>자외선 가시광선 분광광도법</td></tr><tr><td>수성 포화 페놀 pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9712</td><td></td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:IAA 25:24:1 pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>고순도 RNA 분리 키트</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444557</td><td>qPCR 마스터 믹스</td></tr><tr><td>Taqman RNA 프로브</td><td>ThermoFisher</td><td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td><td>Flurogenic probes</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR system</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cell line</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Biochrom</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>행크 버퍼</td><td></td><td></td><td>5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 및 136.8 mM NaCl pH 6.77, 오토클레이브.</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td></td><td></td><td>0.1% 디에틸피로카보네이트 처리된 H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP 버퍼</td><td></td><td></td><td>DEPC의 pH 7.5 및 500mM NaCl H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP+BSA/RNAse 억제제</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP 버퍼 1 &mu; 지/&무; L BSA 및 80 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>BrU-IP+ 1 mg/mL 헤파린</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP 완충액, 1:1 DEPC-H2O 희석 및 1mg/mL 헤파린</td></tr><tr><td>1xBrU-IP</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP 완충액 보충, DEPC-H2O에서 1:1 희석 및 0.5 &mu 보충; 지/&무; L BSA 및 20 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>용리 완충액</td><td></td><td></td><td>0.1% SDS in RNAse-free H2O</td></tr></tbody></table>

5-bromouridine 라벨 및 immunoprecipitation를 사용 하 여 rna 합성의 조사

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

정상 상태 RNA 레벨 두 가지 조건 사이 비교는, 변화는 생산 또는 RNA의 변경으로 인해 발생 하는 여부를 구별 수는. 이 프로토콜의 RNA 생산, 5-Bromouridine immunoprecipitation, 짧은 기간 (예를 들어, 1 시간) 내에서 합성 하는 RNA의 조사를 가능 하 게 선행 하는 RNA의 라벨을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 5 Bromouridine 라벨 및 immunoprecipitation의 α-amanitin 악티노마이신 D 등 독성 transcriptional 억제제의 사용을 통해 장점은 없습니다 또는 단기 사용 중 세포 생존 능력에 매우 낮은 효과. 그러나, 5-Bromouridine-immunoprecipitation만 캡처 RNA 시간 내에 짧은 라벨 생산, 천천히 생산 뿐만 아니라 급속 하 게 저하 때문에 RNA이이 방법으로 측정 하기 어려운 수 있습니다. 5-Bromouridine-immunoprecipitation에 의해 체포 5 Bromouridine 이라는 RNA 반전 녹음 방송, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응, 그리고 다음 세대 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다. RNA의 모든 종류, 조사 하 고 메서드가이 예에서 제시 mRNA를 측정에 국한 되지 않습니다.

BrU 라벨 시간의 초기 테스트 AsPC-1 셀에서 수행 했다. 셀 0, 1, 2, 및 4.5 h, 총 RNA 추출 및 BrU IP BrU로 치료 했다. GAS5와 GAPDH는 충분 한 약 9-및 44 배 변경에 비해 배경 (0 h) GAPDH와 GAS5, 각각을 도달 하는 1 h 라벨 BrU IP RNA에서 측정 되었다.
BrU IP 및 위에서 설명한 분석 변경 사항을 발견 하는 경우를 조사 하는 데 사용 했다 (PLK-2) 폴로-같은 키 2에 α-synuclein mRNA의 정상 상태 수준에서 억제 mRNA 합성1에 변화에 의해 발생 했다. 1 h 라벨 시간이 배경 (그림 2)에 비해 충분 한 라벨을 제공 하 고 또한 영향을가지고 처리 시간을 허용 하기 때문에 선택...

RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

이 실험의 전반적인 목표는 브로모리딘 표지 및 면역침전을 통해 RNA 합성의 변화를 측정하는 것입니다. 이 방법은 RNA 수치의 변화가 RNA 합성의 변화로 인해 발생하는지 여부를 측정하여 RNA 대사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 선호하는 모든 유형의 세포 배양에 사용할 수 있고 사용된 재료에 쉽게 접근할 수 있다는 것입니다.프로토콜을 시작하려면 10cm 페트리 접시에 10cm 페트리 접시에 세포를 3.5배 10배에서 6 HEK293T 파종하여 48시간 후 추출할 때 총 40마이크로그램 이상의 RNA를 얻습니다. 파종 후 세포를 섭씨 37도 및 5%CO2.48로 유지하고, 8ml의 성장 배지를 흡인하고, 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 2ml를 남겨둡니다. 2 밀리몰의 브로 모리딘 및 처리를 성장 배지에 첨가하고, 8 밀리리터의 브로 모리딘 함유 성장 배지를 다시 적용하기 전에 세포에서 잔류 2 밀리리터를 제거한다.다음으로, 1시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 5ml의 Hank's buffer로 세포를 세척하고 2ml의 0.05% 트립신으로 5분 동안 세포를 트립신화합니다. 반응을 멈추기 위하여 성장 매체의 8 밀리리터를 추가하고, 15 밀리리터 관에 세포를 옮기고, 1, 000 시간 g에 2 분 동안 세포를 회전시키십시오.그런 다음 RNA 분리 키트를 사용하여 상등액을 제거하고 세포 펠릿에서 총 RNA를 추출하고 RNase가 없는 물에 RNA를 용리합니다. 이 기술은 매우 민감하므로 고품질의 RNA로 작업하는 것이 중요합니다. 따라서 RNA 추출은 중요한 단계이지만 오늘날의 RNA 추출 키트로도 쉽게 수행할 수 있습니다.조사할 샘플의 수와 파이펫팅 및 소용돌이 혼합 중 손실을 설명하기 위해 추가로 하나의 배치로 비드를 준비합니다. 소용돌이 혼합으로 anti-Mouse IgG 마그네틱 비드를 철저히 재현탁하고 RNase가 없는 1.5ml 튜브에서 샘플당 20마이크로리터의 비드를 꺼냅니다. 1.5ml 튜브를 마그네틱 스탠드에 20초 동안 놓고 비드가 측면에 모일 때까지 기다립니다.상층액을 제거하고 마그네틱 스탠드에서 튜브를 꺼낸 다음 피펫팅으로 40마이크로리터의 1배 bromouridine-IP 버퍼에 비드를 다시 현탁시킵니다. 탁상용 원심 분리기에서 튜브를 2초 동안 돌리고 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 상층액을 제거합니다. 다음으로, 헤파린을 사용하여 비드에 대한 비특이적 결합을 차단합니다.브로모리딘-IP 1배의 1밀리리터와 헤파린 완충액 1밀리그램을 더한 후 비드를 30분 동안 회전시켜 재현탁합니다. 그런 다음 구슬을 한 번 씻으십시오. 비드를 1 밀리리터의 bromouridine-IP buffer에 재현탁시키고 anti-alpha-bromodeoxyuridine 항체 샘플당 1.25μg을 추가합니다.회전하는 동안 1시간 동안 구슬을 배양합니다. 배양 후 구슬을 세 번 씻습니다. 세척된 비드를 1밀리몰 브로모리딘이 보충된 1회 브로모리딘-IP 완충액 샘플당 50마이크로리터에 재현탁하고 비드를 30분 동안 회전시킵니다.회전 후 비드를 세 번 세척하고 1회 브로모리딘-IP 완충액의 샘플당 50마이크로리터에 비드를 재현탁합니다. 자외선 가시광선 분광 광도법을 사용하여 RNA 추출물의 RNA 농도를 측정하고 RNase가 없는 물에 각 샘플의 RNA 40마이크로그램을 총 부피 200마이크로리터로 희석합니다. RNA를 섭씨 80도에서 2분 동안 변성시킨 후 탁상용 원심분리기에서 샘플을 잠시 회전시킵니다.회전 후 200마이크로리터의 2배 브로모리딘-IP와 BSA, RNase 억제제를 첨가합니다. 그런 다음 각 샘플에 재현탁 및 준비된 비드 50마이크로리터를 추가하고 샘플을 1시간 동안 회전시킵니다. 배양 후 구슬을 네 번 씻으십시오.200마이크로리터의 용리 완충액에 비드를 재현탁시켜 RNA를 용리화하고, 200마이크로리터의 pH 6.6 페놀을 빠르게 첨가하여 샘플에서 비 RNA 분자를 제거합니다. 섞기 위하여 표본을 소용돌이치고, 탁상용 분리기에 있는 25, 000 시간 g에 3 분 동안 그것을 회전시키십시오. 다음으로, 약 190 마이크로 리터의 상부상을 가능한 한 많이 흡입하고 200 마이크로 리터의 pH 6.6 페놀 클로로포름이있는 튜브로 이동합니다.여러 샘플에서 동일한 양을 흡인해야 합니다. 샘플을 소용돌이치고 회전시킵니다. 스핀 후 약 180μl의 수성 상부상을 흡인하여 클로로포름 추출을 수행하고 200μl의 클로로포름이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.소용돌이친 다음 샘플을 회전시킵니다. 약 170마이크로리터의 수성 상부상을 흡인하고 17마이크로리터의 3몰 pH 6 아세트산나트륨이 들어 있는 튜브로 옮겨 수용액에서 RNA를 중화하고 침전시킵니다. 다음으로, 2마이크로리터의 글리코겐을 첨가하면 RNA와 함께 침전되어 펠릿이 더 잘 보입니다.500 마이크로 리터의 96 % 에탄올을 첨가하여 염 이온과 RNA 사이의 결합을 증가시키고 튜브를 몇 번 뒤집어서 혼합합니다. 튜브를 영하 20도에서 하룻밤 동안 또는 드라이 아이스에서 15 분 동안 그대로 두십시오. 식힌 샘플을 회전시키고 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리고 펠릿을 185 마이크로 리터의 75 % 에탄올로 세척하여 잔류 염을 제거합니다.그런 다음 샘플을 25, 000 회 g에서 섭씨 4도에서 5 분 동안 회전시킵니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 완전히 버리고 뚜껑을 연 상태에서 펠릿을 5-10분 동안 건조시킵니다. 펠릿을 방해하지 않도록 튜브 측면에 적용된 10마이크로리터의 RNase-free 물에 펠릿을 재현탁합니다.AsPC-1 세포를 0시간, 1시간, 2시간, 4.5시간 동안 브로모리딘으로 처리한 후 전체 RNA 추출 및 브로모리딘-IP를 수행했습니다. GAS5 및 GAPDH는 bromouridine-IP RNA에서 측정되었으며, 이는 1시간의 라벨링이 배경에 비해 9배 및 44배의 변화에 도달하기에 충분함을 보여주었습니다. 2밀리몰의 브로모리딘 처리는 1시간 또는 더 긴 4시간 처리 동안 HEK293T 세포에서 어떠한 형태학적 변화도 유도하지 않았습니다.PLK-2 억제는 입력 및 브로무리딘-IP 모두에서 알파-시누클레인 mRNA의 증가를 유발했으며, 이는 정상 상태 RNA의 증가가 RNA 합성의 증가에 의해 발생함을 시사합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 새로 합성된 RNA를 브로무리딘으로 표지하고 브로무리딘과 표지된 RNA의 후속 면역침전을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

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유전학

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