5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

이 실험의 전반적인 목표는 브로모리딘 표지 및 면역침전을 통해 RNA 합성의 변화를 측정하는 것입니다. 이 방법은 RNA 수치의 변화가 RNA 합성의 변화로 인해 발생하는지 여부를 측정하여 RNA 대사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 선호하는 모든 유형의 세포 배양에 사용할 수 있고 사용된 재료에 쉽게 접근할 수 있다는 것입니다.

프로토콜을 시작하려면 10cm 페트리 접시에 10cm 페트리 접시에 세포를 3.5배 10배에서 6 HEK293T 파종하여 48시간 후 추출할 때 총 40마이크로그램 이상의 RNA를 얻습니다. 파종 후 세포를 섭씨 37도 및 5%CO2.48로 유지하고, 8ml의 성장 배지를 흡인하고, 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 2ml를 남겨둡니다. 2 밀리몰의 브로 모리딘 및 처리를 성장 배지에 첨가하고, 8 밀리리터의 브로 모리딘 함유 성장 배지를 다시 적용하기 전에 세포에서 잔류 2 밀리리터를 제거한다.

다음으로, 1시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 5ml의 Hank's buffer로 세포를 세척하고 2ml의 0.05% 트립신으로 5분 동안 세포를 트립신화합니다. 반응을 멈추기 위하여 성장 매체의 8 밀리리터를 추가하고, 15 밀리리터 관에 세포를 옮기고, 1, 000 시간 g에 2 분 동안 세포를 회전

그런 다음 RNA 분리 키트를 사용하여 상등액을 제거하고 세포 펠릿에서 총 RNA를 추출하고 RNase가 없는 물에 RNA를 용리합니다. 이 기술은 매우 민감하므로 고품질의 RNA로 작업하는 것이 중요합니다. 따라서 RNA 추출은 중요한 단계이지만 오늘날의 RNA 추출 키트로도 쉽게 수행할 수 있습니다.

조사할 샘플의 수와 파이펫팅 및 소용돌이 혼합 중 손실을 설명하기 위해 추가로 하나의 배치로 비드를 준비합니다. 소용돌이 혼합으로 anti-Mouse IgG 마그네틱 비드를 철저히 재현탁하고 RNase가 없는 1.5ml 튜브에서 샘플당 20마이크로리터의 비드를 꺼냅니다. 1.5ml 튜브를 마그네틱 스탠드에 20초 동안 놓고 비드가 측면에 모일 때까지 기다립니다.

상층액을 제거하고 마그네틱 스탠드에서 튜브를 꺼낸 다음 피펫팅으로 40마이크로리터의 1배 bromouridine-IP 버퍼에 비드를 다시 현탁시킵니다. 탁상용 원심 분리기에서 튜브를 2초 동안 돌리고 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 상층액을 제거합니다. 다음으로, 헤파린을 사용하여 비드에 대한 비특이적 결합을 차단합니다.

브로모리딘-IP 1배의 1밀리리터와 헤파린 완충액 1밀리그램을 더한 후 비드를 30분 동안 회전시켜 재현탁합니다. 그런 다음 구슬을 한 번 씻으십시오. 비드를 1 밀리리터의 bromouridine-IP buffer에 재현탁시키고 anti-alpha-bromodeoxyuridine 항체 샘플당 1.25μg을 추가합니다.

회전하는 동안 1시간 동안 구슬을 배양합니다. 배양 후 구슬을 세 번 씻습니다. 세척된 비드를 1밀리몰 브로모리딘이 보충된 1회 브로모리딘-IP 완충액 샘플당 50마이크로리터에 재현탁하고 비드를 30분 동안 회전시킵니다.

회전 후 비드를 세 번 세척하고 1회 브로모리딘-IP 완충액의 샘플당 50마이크로리터에 비드를 재현탁합니다. 자외선 가시광선 분광 광도법을 사용하여 RNA 추출물의 RNA 농도를 측정하고 RNase가 없는 물에 각 샘플의 RNA 40마이크로그램을 총 부피 200마이크로리터로 희석합니다. RNA를 섭씨 80도에서 2분 동안 변성시킨 후 탁상용 원심분리기에서 샘플을 잠시 회전시킵니다.

회전 후 200마이크로리터의 2배 브로모리딘-IP와 BSA, RNase 억제제를 첨가합니다. 그런 다음 각 샘플에 재현탁 및 준비된 비드 50마이크로리터를 추가하고 샘플을 1시간 동안 회전시킵니다. 배양 후 구슬을 네 번 씻으십시오.

200마이크로리터의 용리 완충액에 비드를 재현탁시켜 RNA를 용리화하고, 200마이크로리터의 pH 6.6 페놀을 빠르게 첨가하여 샘플에서 비 RNA 분자를 제거합니다. 섞기 위하여 표본을 소용돌이치고, 탁상용 분리기에 있는 25, 000 시간 g에 3 분 동안 그것을 회전시키십시오. 다음으로, 약 190 마이크로 리터의 상부상을 가능한 한 많이 흡입하고 200 마이크로 리터의 pH 6.6 페놀 클로로포름이있는 튜브로 이동합니다.

여러 샘플에서 동일한 양을 흡인해야 합니다. 샘플을 소용돌이치고 회전시킵니다. 스핀 후 약 180μl의 수성 상부상을 흡인하여 클로로포름 추출을 수행하고 200μl의 클로로포름이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.

소용돌이친 다음 샘플을 회전시킵니다. 약 170마이크로리터의 수성 상부상을 흡인하고 17마이크로리터의 3몰 pH 6 아세트산나트륨이 들어 있는 튜브로 옮겨 수용액에서 RNA를 중화하고 침전시킵니다. 다음으로, 2마이크로리터의 글리코겐을 첨가하면 RNA와 함께 침전되어 펠릿이 더 잘 보입니다.

500 마이크로 리터의 96 % 에탄올을 첨가하여 염 이온과 RNA 사이의 결합을 증가시키고 튜브를 몇 번 뒤집어서 혼합합니다. 튜브를 영하 20도에서 하룻밤 동안 또는 드라이 아이스에서 15 분 동안 그대로 두십시오. 식힌 샘플을 회전시키고 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리고 펠릿을 185 마이크로 리터의 75 % 에탄올로 세척하여 잔류 염을 제거합니다.

그런 다음 샘플을 25, 000 회 g에서 섭씨 4도에서 5 분 동안 회전시킵니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 완전히 버리고 뚜껑을 연 상태에서 펠릿을 5-10분 동안 건조시킵니다. 펠릿을 방해하지 않도록 튜브 측면에 적용된 10마이크로리터의 RNase-free 물에 펠릿을 재현탁합니다.

AsPC-1 세포를 0시간, 1시간, 2시간, 4.5시간 동안 브로모리딘으로 처리한 후 전체 RNA 추출 및 브로모리딘-IP를 수행했습니다. GAS5 및 GAPDH는 bromouridine-IP RNA에서 측정되었으며, 이는 1시간의 라벨링이 배경에 비해 9배 및 44배의 변화에 도달하기에 충분함을 보여주었습니다. 2밀리몰의 브로모리딘 처리는 1시간 또는 더 긴 4시간 처리 동안 HEK293T 세포에서 어떠한 형태학적 변화도 유도하지 않았습니다.

PLK-2 억제는 입력 및 브로무리딘-IP 모두에서 알파-시누클레인 mRNA의 증가를 유발했으며, 이는 정상 상태 RNA의 증가가 RNA 합성의 증가에 의해 발생함을 시사합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 새로 합성된 RNA를 브로무리딘으로 표지하고 브로무리딘과 표지된 RNA의 후속 면역침전을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.