Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

이 연구에서는 E.coli를 발현 숙주로 사용하여 특정 부위에서 균질하게 아세틸화된 단백질을 생산하는 손쉬운 프로토콜을 시연할 것입니다. 단백질의 가역적 라이신 아세틸화는 자연계에서 가장 풍부한 번역 후 변형 중 하나입니다. 그것은 유전자 전사, 스트레스 반응, 세포 분화 및 신진대사를 포함한 광범위한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.

설계 위치에서 순수 아세틸화된 단백질을 생성하는 것은 단백질 아세틸화를 연구하는 데 매우 유용합니다. 그러나 대부분의 고전적인 방법에서는 어렵습니다. 이 문제는 유전자 코드 확장 기술에 의해 해결되었습니다.

엔지니어링된 pyrrolysyl-tRNA synthetase variate를 사용하여 tRNA-Pyl에 acetyllysine을 충전한 다음 숙주 번역 메커니즘을 사용하여 mRNA에서 UAG 정지 코돈을 억제하고 표적 단백질의 설계 위치에 acetyllysine의 통합을 지시합니다. 첫째, 호박 정지 코돈은 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 표적 유전자의 해당 위치로 도입되어야 합니다. 야생형 단백질의 유전자를 함유한 template plasmid를 증폭하고, PCR 반응에 의해 primer로부터 stop codon mutation을 삽입한다.

PCR 후, 증폭된 물질을 순환화 및 주형 제거를 위해 실온에서 1시간 동안 kinase-ligase-Dpn1 효소 혼합물에 직접 첨가합니다. 25마이크로리터의 해동된 적격 E.coli 세포의 튜브에 5마이크로리터의 혼합물을 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 튕겨 섞고 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 놓습니다.

혼합물을 섭씨 42도에서 30초 동안 열충격을 가하고 얼음 위에 5분 더 놓습니다. 600마이크로리터의 실온 SOC 매체를 혼합물에 피펫팅합니다. 섭씨 37도에서 60분 동안 흔들면서 배양합니다.

해당 항생제와 함께 플레이트에 100마이크로리터를 펴 바르고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 단일 콜로니의 플라스미드는 염기서열분석을 위해 보내집니다. 두 번째 단계는 부위 특이적 아세틸화 단백질을 발현하고 정제하는 것입니다.

돌연변이된 TAG를 함유한 표적 유전자와 아세틸리신 통합 시스템을 포함하는 플레이트에서 단일 콜로니를 집어냅니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 해당 항생제를 15ml의 신선한 LB 배지에 접종합니다. 15ml의 야간 배양을 항생제가 함유된 300ml의 새로운 LB 배지로 옮기고 섭씨 37도에서 배양합니다.

600나노미터에서 흡광도가 5에 도달할 때 성장 매체의 최종 농도로 5밀리몰 아세틸리신과 20밀리몰 니코틴아미드를 추가합니다. 섭씨 37도에서 추가로 1시간 동안 세포를 성장시킵니다. 그런 다음 단백질 발현을 위한 유도체를 추가하고 하룻밤 동안 섭씨 25도에서 세포를 성장시킵니다.

3, 15 분 동안 000 g에 원심분리해서 세포를 모으십시오. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 음의 80도에서 보관하십시오. 얼어붙은 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동하고 15ml의 용해 완충액, 5마이크로리터의 베타-메르캅토에탄올, 1마이크로리터의 뉴클레아제로 재현탁합니다.

세포는 초음파 처리에 의해 파괴됩니다. 20, 4 도에 25 분 동안 000 g에 분리기 조잡한 추출물. 45마이크로미터 멤브레인 필터로 상층액을 여과합니다.

여과된 샘플을 1ml의 니켈 NTA 수지가 포함된 컬럼에 로드하고 20ml의 용해 완충액으로 평형을 이룹니다. 20ml의 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 표적 단백질은 2ml의 용리 완충액으로 회피됩니다.

정제된 단백질은 2.5ml 샘플을 첨가하여 PD-10 컬럼에 의해 탈염되고 3.5ml 탈염 버퍼로 탈염된 샘플을 수집합니다. 다음 단계는 정제된 아세틸화 단백질을 생화학적으로 특성화하는 것입니다. SDS 샘플 버퍼로 100도 이상에서 5분 동안 단백질을 변성시킵니다.

혼합물을 원심분리하고 SDS-PAGE 젤에 로드한 다음 200볼트에서 30분 동안 작동합니다. 증류수로 젤을 씻고 부드럽게 흔듭니다. 음극에서 양극까지 웨스턴 블로팅용 샌드위치를 만들기 위해 스펀지, 여과지, 전사 완충액, 담근 SDS-PAGE 젤, 메탄올 활성 PVDF 멤브레인, 다른 여과지, 샌드위치의 기포 및 다른 스폰지를 제거합니다.

스택을 이송 탱크에 넣으십시오. 350 밀리 암페어의 정전류에서 45 분 동안 실행하십시오. PVDF 멤브레인을 25ml TBST 버퍼로 부드럽게 흔들어 5분 동안 세척합니다.

실온에서 1시간 동안 5% BSA와 TBST 완충액으로 멤브레인을 막습니다. 희석된 HRP 접합 아세틸리신 항체를 멤브레인에 넣고 실온에서 1시간 또는 4도에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 20ml의 TBST 완충액으로 멤브레인을 부드럽게 흔들어 5분 동안 세척합니다.

이 단계를 네 번 반복합니다. 화학발광 기질을 멤브레인에 1분 동안 적용합니다. CCD 카메라 기반 이미저로 신호를 캡처합니다.

동일한 부피의 용출 분획 및 단백질 정제를 SDS-PAGE 겔에 로드했습니다. 아세틸화 단백질의 수율은 야생형 단백질의 약 절반으로 효율이 높으며, 아세틸리신 및 성장 배지가 없는 동일한 발현 균주는 검출 가능한 양의 단백질을 생산할 수 없으며, 이는 이 특정 위치에 혼입된 표준 아미노산이 없기 때문에 아세틸화 단백질의 순도가 높다는 것을 나타냅니다. 웨스턴 블로팅(western blotting)은 야생형 단백질에서 검출 가능한 아세틸화가 없음을 보여주었으며, 이는 이 발현 시스템의 비특이적 아세틸화의 낮은 배경을 나타내는 반면, 아세틸화 단백질은 명확한 띠를 가졌습니다.

탠덤 질량 분석법은 유전자의 해당 위치가 정지 코돈으로 돌연변이된 올바른 위치에서 아세틸화가 발생한다는 것을 확인했습니다. 아세틸화 단백질의 우수한 수율과 순도를 얻으려면 최적화된 아세틸리신 혼입 시스템을 고효율 및 고순도 모두에 사용해야 합니다. BL21(DE3) 세포는 순도를 높이기 위해 낮은 백그라운드 및 비특이적 아세틸화에 사용해야 합니다.

유전자 통합 시스템은 더 광범위한 응용 프로그램을 위해 진핵 시스템에서 사용될 수 있습니다.