Name: Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 배우세요 대장균에서 유전자 코드 확장 기술을 이용하여 특정 부위에 균일하게 아세틸화된 단백질을 생성하는 방법을. 이 프로토콜은 단백질 아세틸화 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NIH (AI119813), 아칸소 대학에서에서 시작 및 아칸소 생명과학 연구소에서 수상에 의해 지원 되었다.

1. 사이트 감독 Mutagenesis 대상 유전자의
참고: MDH T7 발기인 CloDF13 원본 및 복사본 수가 20 ~ 4034 pCDF 1 벡터에서 아래 표시 됩니다.
<ol><li>뇌관에 의해 유전자에 140 위치에서 황색 정지 codon를 소개 (뇌관을 앞으로: GGTGTTTATGAC태그AACAAACTGTTCGGCG 및 뇌관을 역방향: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC)의 사이트 지시 된 mutagenesis 키트 명령 다음.</li>
	<li>야생-타입 malate dehydratase의 유전자를 포함 하는 템플릿 플라스 미드를 증폭 하 고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 반응에 의해 정지 codon 돌연변이 삽입 합니다. 반응 혼합물에서 포함 2 X DNA 중 합 효소 효소 혼합의 12.5 µ L, 10 µ M 앞으로 뇌관, 10 µ M 역 뇌관의 1.25 µ L, 템플릿 DNA의 1 µ L의 1.25 µ L (20 ng / µ L) (pCDF 1 플라스 미드의 야생-타입 MDH 유전자를 포함), 그리고 9 µ L nuclease 무료 물.<ol>
<li>PCR 반응 매개 변수를 사용 하 여 다음과 같습니다: 30 98 ° C에 변성을 초기 s; 10의 25 주기 98 ° C, 30에서 s s 55 ° C, 및 72 ° C에서 3 분에서 3 분 동안 72 ° C에서 최종 확장. PCR, 후 circularization 및 서식 파일 제거에 대 한 실 온에서 1 h 킷에서 증폭 된 자료 니 리가 DpnI 효소 혼합에 직접 추가 합니다. 참고: 반응 혼합물의 PCR 제품, 반응 버퍼 X 2의 5 µ L, 10 X 키-리가-DpnI 효소 혼합, 1 µ L nuclease 무료 물 3 µ L 1 µ L를 포함합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 µ L 25 µ L의 튜브에 반응 혼합의 유능한 대장균 해 동 추가 키트에서 DH5α 셀. 신중 하 게 혼합, 튜브를 터치 하 고 30 분 열 충격 30 s, 및 추가 5 분 동안 얼음에 42 ° C에 혼합물에 대 한 얼음에 혼합물을 놓습니다.<ol>
<li>혼합물으로 실내 온도 Catabolite 억압 (SOC) 미디어 키트에서와 함께 슈퍼 최적의 국물의 600 µ L를 플라스틱, 250rpm에서 떨고 함께 60 분 동안 37 ° C에서 품 어, 해당 항생제와 lysogeny (파운드)의 국물 한 접시에 100 µ L를 확산 그리고 250 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 mL 신선한 파운드 미디어 해당 항생제로 4-6 한 식민지를 선택 하 고 250 rpm에서 떨고와 하룻밤 37 ° C에서 품 어. 다음 제조 업체의 설명서, 다음 올바른 위치에 정지 codon 돌연변이 확인 하는 서비스 공급자의 프로토콜에 따라 DNA 연속을 위한 송신 플라스 미드 플라스 미드 정화 키트에 의해 각 숙박 문화에서 플라스 미드를 추출 합니다.</li>
	<li>1 mL 하룻밤 문화와 300 µ L 100 %DMSO 혼합 하 여 스트레인-80 ° C에서 올바른 시퀀스를 저장 합니다.</li>
</ol>2입니다. 표현의 Acetylated 단백질
<ol><li>최적화 된 acetyllysyl-tRNA 합성33 의 유전자를 삽입 하 고 최적화 된 tRNAPyl 32 pTech 플라스 미드로. 제정 lpp 발기인에서 tRNA 합성 유전자를 놓습니다. 제정 proK 발기인34에서 tRNA 유전자를 놓습니다.<ol>
<li>공동 변환 식 벡터34 malate 효소의 돌연변이 태그 포함 된 유전자를 포함 하 고 최적화 된 acetyllysine 설립 시스템을 은닉 하는 플라스 미드 25 µ L로 해 동된 유능한 대장균 BL21(DE3) 세포에 의해 10 s, 및 추가 5 분 동안 얼음에 42 ° C에서 열 충격.</li>
		<li>혼합물으로 실내 온도 SOC 미디어의 600 µ L를 플라스틱, 275 rpm 동요와 함께 60 분 동안 37 ° C에서 품 어, 100 µ g/mL 스와 50 µ g/mL 페니, 한 접시에 100 µ L를 확산 그리고 275 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시에서 단 하나 식민지를 선택 하 고 15 mL 신선한 파운드 미디어 100 µ g/mL 스와 250 rpm의 속도로 흔들어 하룻밤 37 ° C에서 50 mL 튜브에 50 µ g/mL 페니로 예방. 1 L 플라스 크에 항생제와 300 mL 신선한 파운드 미디어 15 mL 숙박 문화를 전송 하 고 250 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>Acetyllysine 100 m m 재고 솔루션, 4 ° c.에 저장 물으로 분해 흡 광도 600 0.5에 도달 하는 때 성장 매체를 5mm acetyllysine 및 20mm 니코틴 (deacetylases의 억제제)를 추가 nm.<ol>
<li>37 ° c, 250 rpm에서 떨고 추가 1 시간에 대 한 세포 성장 다음 0.5 m m IPTG 단백질 표정, 추가 하 고 180 rpm에서 떨고, 25 ° C에서 세포 성장. 참고: 식 조건이 다른 단백질에 대 한 최적화를 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 분 동안 4 ° C에서 3000 x g에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 상쾌한, 삭제 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 버퍼 (10 m m 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4, 137 m m NaCl, 2.7 m m KCl)와 펠 릿을 세척. 5 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 씻어 세포를 수집, 상쾌한, 삭제 및 셀 알 약-80 ° c.에 저장</li>
</ol>3입니다. Acetylated 단백질의 정화
<ol><li>얼음, 냉동된 셀 펠 릿을 녹여 그리고 다시 (50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.8, 300 mM NaCl, 20mm 이미, 그리고 20mm 니코틴아미드), 세포의 용 해 버퍼의 15 mL와 β-mercaptoethanol와 1 µ L Benzonase nuclease (250 대)의 5 µ L 일시 중단.</li>
	<li>40 kHz 쥡니다 70% 파워 10 사이클 간격 30 다음 10 s 짧은 파열의 출력에 의해 세포를 휴식 양식 원유 추출에 대 한 s. 4 ° c.에 25 분 20000 x g에서 원심 분리기 원유 추출 상쾌한 0.45 μ 막 필터를 필터링 하 고 니켈 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) 수 지 물과 세포의 용 해 버퍼의 20 mL 20 mL와 equilibrated의 1 mL를 포함 하는 열에 로드 합니다. 참고: 쥡니다 사용할 수 없는 경우에 셀 온화한 세제에 의해 깨진 수 있습니다.</li>
	<li>20 mL (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 50mm 이미, 및 20 m m 니코틴아미드) 워시 버퍼의 열 세척 하 고의 차입 버퍼 (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 150mm 이미, 및 20 m m 니코틴아미드) 2 mL와 함께 elute.</li>
	<li>제조업체의 설명서에 따라 PD-10 열 버퍼 (25mm Tris pH 7.8와 10 mM NaCl) 담와 차입 분수 desalt. Bradford 단백질 분석 실험 시 약의 지시에 따라 eluted 단백질의 농도 측정 합니다. Desalted 단백질은 추가 실험을 위한 준비 이다. 참고: 단백질의 50% 글리세롤 재고 확인 하 고 저장을 위한-80 ° C에서 유지.</li>
</ol>4. 생 화 확 적인 특성 Acetylated 단백질의
<ol><li>
SDS 페이지 및 질량 분석 분석입니다.
	<ol>
<li>나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 샘플 버퍼 (SDS 샘플 버퍼 X 2 µ L 4와 5 µ L 단백질 견본) 5 분 동안 105 ° C에서 2 mL 튜브와 단백질 변성, 2000 x g 10에서 혼합물을 원심 s, 4-20% 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 electroph에 로드 oresis (SDS-PAGE) 젤, 고 200 V 30 분 실행 합니다.</li>
		<li>증류수와 젤을 세척 하 고 3 번 과정을 반복 5 분 동안 부드럽게 흔들어. 물, 삭제 하 고 젤 부드러운 동요와 1 h Coomassie 파란 얼룩과 얼룩. 증류수와 젤 드 얼룩, 30 분, 그리고 반복이 드 3 번 얼룩에 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>Coomassie 파란 얼룩이 SDS 페이지 젤에 33 kDa에 밴드를 잘라내어 질량 분석 시설 또는 회사는 acetyllysine 디자인 된 위치에서 통합 되었다 확인 하. 참고: 질량 분석 분석의 프로토콜은 이전 실험34을 따 랐 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
서 부 럽
	<ol>
<li>4.1 단계에서 동일한 프로토콜 SDS 페이지 젤을 실행 합니다. 실행 젤, 후 15 분에 대 한 전송 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글리신, pH 8.3 및 20% 메탄올) 젤을 담근 다.</li>
		<li>0.2 µ m, 1 분에 대 한 메탄올을 가진 7 cm x 8.5 c m polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 활성화 되 고 전송 샌드위치를 준비 하기 전에 전송 버퍼와 린스. 참고: 메탄올은 피부 접촉, 눈 접촉, 섭취, 또는 흡입 위험. 심한 노출은 죽음에 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>음극에서 양극 (스폰지 필터 종이, SDS 페이지 젤, PVDF 막, 필터 종이, 스폰지)에 전송 샌드위치를 확인 합니다. 스택의 350의 정 전류에서 실행 전송 탱크에 넣어 45 분 mA. 참고: 전송 시간 최적화를 할 수 있습니다.</li>
		<li>씻어 25 mL Tris 버퍼 식 염 수, 0.1 %PVDF 막 트윈 20 (TBST) (137 m m NaCl, 20 mM Tris, 0.1% 트윈 20, pH 7.6) 부드러운 떨고와 5 분에 대 한 버퍼. 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온에서 1 h TBST 버퍼에서와 막을 차단 합니다.</li>
		<li>HRP 활용 된 acetyllysine-항 체로 부드러운 떨고와 하룻밤 4 ° C에서 5% BSA TBST에 희석 1 µ g/mL의 최종 농도와 막 품 어. 참고: 빠른 결과 위해 1 시간 실 온에서이 단계를 수행 수 있습니다. 항 체의 희석 최적화를 할 수 있습니다.</li>
		<li>부드러운 진동으로 5 분 동안 20 mL TBST 버퍼와 막 씻어 4 번 단계를 반복. 제조업체의 지침에 따라 화학 기질 막에 적용 합니다. 와 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 기반 영상 신호를 캡처.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

비정규 아미노산 (ncAAs)의 유전 결합 ncAA 청구 tRNA에 의해 할당 된 codon, 주로는 황색 정지 codon UAG36,37,38,39의 억제에 기반 해당 anticodon 포함 하. UAG codon 릴리스 요소-1 (RF1) 박테리아에 의해 인식 된다로 알려져 있다 그리고 그것은 또한 억제할 수 있습니다 의해 정식 아미노산 (cAAs)로 청구 하는 호스트에서 동족 tRNAs 근처 lysine과 티로신40,41등. 그래서, UAG codon에 ncAA 관 효율 ncAA 관 순도 경쟁 ncAA 충전 tRNAs 사이 동족 tRNAs 근처 cAA 청구에 의존 하는 동안 ncAA 충전 tR...

포스트 번역 상 수정 (PTMs) 단백질의 번역 과정 후 발생 하 고 공유 추가 기능 그룹에서 발생 하는 아미노산 잔류물, 유전자를 포함 하 여 거의 모든 생물 학적 과정에 중요 한 역할을 재생을 전사, 스트레스 반응, 세포 분화, 및 물질 대사1,2,3 날짜 하려면, 약 400 독특한 PTMs 확인된4되었습니다. 게놈과는 프로테옴의 intricacy는 단백질 PTMs로 대부분 증폭 단백질 활동 및 지역화, 고 단백질, 핵 산, 지질, 및 공동 인자5등 다른 분자와 상호 작용에 영향을 미칠.
단백질 acetylation 지난 2 년간6,7,,89,10,11,12PTMs 연구의 최전선에 왔다. Lysine acetylation 처음 발견 되었다 히스톤에 이상의 50 년 전13,14은 잘 조사 되어, 80 개 이상의 녹음 방송 요인, 레 귤 레이 터, 및 다양 한 단백질15에 알려져 있다 16,17. 단백질 acetylation에 대 한 연구 뿐만 아니라, 규제 메커니즘의 깊은 이해를 제공 하지만 다양 한 역 기능 acetylation18,19, 로 인 한 질병에 대 한 치료 가이드 20 , 21 , 22 , 23. lysine acetylation 진핵생물에서 발생 하지만 최근 연구는 단백질 acetylation 또한 세균 생리학, chemotaxis, 내 산 성, 활성화 및 안정화를 포함 하 여 주요 역할 재생 믿어 pathogenicity 섬과 다른 독성 단백질24,25,26,27,,2829관련.
Lysine acetylation 화학적 특성을 일반적으로 사용 되는 방법은 사이트 지시 된 mutagenesis 사용 하는. 글루타민은 비슷한 크기와 극성 때문에 acetyllysine의 모방으로 사용 됩니다. 아르기닌은 생리 적인 조건 하에서 그것의 긍정적인 요금을 유지 하지만 acetylated 수 없습니다 비 acetylated lysine 모방으로 활용 됩니다. 그러나, 두 모방 하지 진짜 isosteres 이며 항상 예상된 결과30를 생성 하지 않습니다. 가장 엄격한 접근은 어렵거나 lysine acetylation 자연7,11의 낮은 산출할 인해 가장 고전적인 방법에 대 한 특정 리 진 잔류물에 균질 acetylated 단백질을 생성 하는 것입니다. 이 문제는 설계 pyrrolysyl-tRNA 합성을 사용 하 여 유전자 코드 확장 전략에 의해 unraveled 되었습니다 tRNA 충전 Methanosarcinaceae 종에서 벗어나 acetyllysine와Pyl 활용 호스트 변환 기계는 UAG를 억제 하는 mRNA에 codon를 중지 하 고 대상 단백질31의 설계 위치에 acetyllysine의 지휘. 최근에, 우리는 향상 된 EF-부 엉-바인딩 tRNA32 와 업그레이드 된 acetyllysyl-tRNA 합성33이 시스템을 최적화 했습니다. 또한, 우리는 malate 효소34 와 tyrosyl-tRNA 합성35의 acetylation 연구에서이 향상 된 통합 시스템을 적용 했습니다. 여기, 우리가 우리가 광범위 하 게 실증 사례로 공부 malate 효소 (MDH)를 사용 하 여 생화학 식별 분자 클로닝에서 순전히 acetylated 단백질을 생성 하기 위한 프로토콜을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Bradford 단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>단백질 농도</td></tr><tr><td>4x Laemmli 시료 완충액</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td>SDS 시료 완충액</td></tr><tr><td>Coomassie G-250 Stain</td><td>Bio-Rad</td><td>1610786</td><td>SDS-PAGE 겔 염색</td></tr><tr><td>4-20% SDS-PAGE 레디 젤</td><td>Bio-Rad</td><td>4561093</td><td>단백질 측정</td></tr><tr><td>Ac-K-100 (HRP Conjugate)</td><td>Cell 신호</td><td>6952</td><td>항체</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>CHEM-IMPEX</td><td>194</td><td>발현 유도제</td></tr><tr><td>N&epsilon; -Acetyl-L-lysine</td><td>CHEM-IMPEX</td><td>5364</td><td>비표준 아미노산</td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>탈염</td></tr><tr><td>Q5 부위 지정 돌연변이 유발 키트</td><td>NEB</td><td>E0554</td><td>stop codon</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 세포</td><td>NEB</td><td>C2527</td><td>발현 균주</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td> <td>소개플라스미드</td></tr><tr><td>추출 Ni-NTA 수지</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>친화성 정제 수지</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3376</td><td>탈아세틸화효소 억제제</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>환원제</td></tr><tr><td>BugBuster 단백질 추출 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70584</td><td>파괴 세포</td></tr><tr><td>벤조나아제 nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>DNase</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher</td><td>32106</td><td>Chemiluminescence</td></tr><tr><td>Premixed LB Broth</td><td>VWR</td><td>97064</td><td>세포 성장 배지</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td>western blots blocking</td></tr></tbody></table>

site-specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 acetylated 대장균 에서 단백질

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

포스트 번역 상 수정 단백질의 특정 위치에서 발생 하는 다양 한 세포질 프로세스에서에서 중요 한 역할을 보여왔다. 그 중, 가역 lysine acetylation 생활의 모든 영역에서 가장 넓게 분배 된 중 하나입니다. 수많은 acetylome 질량 분석 기반 연구를 수행 하는 있지만 더이 상 상속 acetylation 대상의 제한 되었습니다. 가능한 이유 하나 대부분 클래식 생 화 확 적인 방법에 의해 원하는 위치에 순전히 acetylated 단백질을 생성 하기 어렵습니다. 이 문제를 해결 하려면 유전자 코드 확장 기술 cotranslational 설립을 직접 설계 pyrrolysyl-tRNA 합성 변종, Methanosarcinaceae 종에서 그것의 동족 tRNA의 쌍을 사용 하 여 적용 된 관심사의 단백질에 특정 사이트에 acetyllysine의. Histone acetylation의 연구에서 첫 번째 응용 프로그램, 후이 이렇게 다양 한 단백질에 acetylation 연구 촉진 했다. 이 작품에서는, 우리는 호스트 모델 박테리아 대장균 을 사용 하 여 site-specifically acetylated 단백질을 생산 하는 손쉬운 프로토콜을 증명 하고있다. Malate 효소는이 작품에서 데모 예제로 사용 되었습니다.

야생-타입 MDH 그건 1 L 문화 당 31 mg acetylated MDH 단백질의 수익률 1 L 문화, 당 15 밀리 그램 이었다. 그림 1에서 보듯이 순화 된 단백질 SDS-PAGE로 분석 되었다. 야생-타입 MDH 긍정적인 제어34로 사용 되었다. 성장 매체에서 acetyllysine (AcK) 설립 시스템 및 돌연변이 mdh 유전자를 은닉 하는 세포에서 하지만 AcK 없이 순화 하는 단백질은 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 순화 된 단백질의 lysine acetylation 서쪽 더 럽 히를 사용 하 여 그림 2와 같이 acetyllysine 항 검색 되었습니다. Malate 효소에서 리 진 잔류물 140의 acetylation 탠덤 질량 분석 분석 그림 3<...

유전자 코드 확장 acetylation 단백질을 포함 한 생물 학적 과정의 넓은 범위를 공부 하는 강력한 도구 역할을 합니다. 여기 균질 생성 하기 위한이 기술을 악용 하는 손쉬운 프로토콜 acetylated 단백질 대장균 세포에 특정 사이트에 설명 합니다.

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

이 연구에서는 E.coli를 발현 숙주로 사용하여 특정 부위에서 균질하게 아세틸화된 단백질을 생산하는 손쉬운 프로토콜을 시연할 것입니다. 단백질의 가역적 라이신 아세틸화는 자연계에서 가장 풍부한 번역 후 변형 중 하나입니다. 그것은 유전자 전사, 스트레스 반응, 세포 분화 및 신진대사를 포함한 광범위한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.설계 위치에서 순수 아세틸화된 단백질을 생성하는 것은 단백질 아세틸화를 연구하는 데 매우 유용합니다. 그러나 대부분의 고전적인 방법에서는 어렵습니다. 이 문제는 유전자 코드 확장 기술에 의해 해결되었습니다.엔지니어링된 pyrrolysyl-tRNA synthetase variate를 사용하여 tRNA-Pyl에 acetyllysine을 충전한 다음 숙주 번역 메커니즘을 사용하여 mRNA에서 UAG 정지 코돈을 억제하고 표적 단백질의 설계 위치에 acetyllysine의 통합을 지시합니다. 첫째, 호박 정지 코돈은 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 표적 유전자의 해당 위치로 도입되어야 합니다. 야생형 단백질의 유전자를 함유한 template plasmid를 증폭하고, PCR 반응에 의해 primer로부터 stop codon mutation을 삽입한다.PCR 후, 증폭된 물질을 순환화 및 주형 제거를 위해 실온에서 1시간 동안 kinase-ligase-Dpn1 효소 혼합물에 직접 첨가합니다. 25마이크로리터의 해동된 적격 E.coli 세포의 튜브에 5마이크로리터의 혼합물을 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 튕겨 섞고 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 놓습니다.혼합물을 섭씨 42도에서 30초 동안 열충격을 가하고 얼음 위에 5분 더 놓습니다. 600마이크로리터의 실온 SOC 매체를 혼합물에 피펫팅합니다. 섭씨 37도에서 60분 동안 흔들면서 배양합니다.해당 항생제와 함께 플레이트에 100마이크로리터를 펴 바르고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 단일 콜로니의 플라스미드는 염기서열분석을 위해 보내집니다. 두 번째 단계는 부위 특이적 아세틸화 단백질을 발현하고 정제하는 것입니다.돌연변이된 TAG를 함유한 표적 유전자와 아세틸리신 통합 시스템을 포함하는 플레이트에서 단일 콜로니를 집어냅니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 해당 항생제를 15ml의 신선한 LB 배지에 접종합니다. 15ml의 야간 배양을 항생제가 함유된 300ml의 새로운 LB 배지로 옮기고 섭씨 37도에서 배양합니다.600나노미터에서 흡광도가 5에 도달할 때 성장 매체의 최종 농도로 5밀리몰 아세틸리신과 20밀리몰 니코틴아미드를 추가합니다. 섭씨 37도에서 추가로 1시간 동안 세포를 성장시킵니다. 그런 다음 단백질 발현을 위한 유도체를 추가하고 하룻밤 동안 섭씨 25도에서 세포를 성장시킵니다.3, 15 분 동안 000 g에 원심분리해서 세포를 모으십시오. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 음의 80도에서 보관하십시오. 얼어붙은 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동하고 15ml의 용해 완충액, 5마이크로리터의 베타-메르캅토에탄올, 1마이크로리터의 뉴클레아제로 재현탁합니다.세포는 초음파 처리에 의해 파괴됩니다. 20, 4 도에 25 분 동안 000 g에 분리기 조잡한 추출물. 45마이크로미터 멤브레인 필터로 상층액을 여과합니다.여과된 샘플을 1ml의 니켈 NTA 수지가 포함된 컬럼에 로드하고 20ml의 용해 완충액으로 평형을 이룹니다. 20ml의 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 표적 단백질은 2ml의 용리 완충액으로 회피됩니다.정제된 단백질은 2.5ml 샘플을 첨가하여 PD-10 컬럼에 의해 탈염되고 3.5ml 탈염 버퍼로 탈염된 샘플을 수집합니다. 다음 단계는 정제된 아세틸화 단백질을 생화학적으로 특성화하는 것입니다. SDS 샘플 버퍼로 100도 이상에서 5분 동안 단백질을 변성시킵니다.혼합물을 원심분리하고 SDS-PAGE 젤에 로드한 다음 200볼트에서 30분 동안 작동합니다. 증류수로 젤을 씻고 부드럽게 흔듭니다. 음극에서 양극까지 웨스턴 블로팅용 샌드위치를 만들기 위해 스펀지, 여과지, 전사 완충액, 담근 SDS-PAGE 젤, 메탄올 활성 PVDF 멤브레인, 다른 여과지, 샌드위치의 기포 및 다른 스폰지를 제거합니다.스택을 이송 탱크에 넣으십시오. 350 밀리 암페어의 정전류에서 45 분 동안 실행하십시오. PVDF 멤브레인을 25ml TBST 버퍼로 부드럽게 흔들어 5분 동안 세척합니다.실온에서 1시간 동안 5% BSA와 TBST 완충액으로 멤브레인을 막습니다. 희석된 HRP 접합 아세틸리신 항체를 멤브레인에 넣고 실온에서 1시간 또는 4도에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 20ml의 TBST 완충액으로 멤브레인을 부드럽게 흔들어 5분 동안 세척합니다.이 단계를 네 번 반복합니다. 화학발광 기질을 멤브레인에 1분 동안 적용합니다. CCD 카메라 기반 이미저로 신호를 캡처합니다.동일한 부피의 용출 분획 및 단백질 정제를 SDS-PAGE 겔에 로드했습니다. 아세틸화 단백질의 수율은 야생형 단백질의 약 절반으로 효율이 높으며, 아세틸리신 및 성장 배지가 없는 동일한 발현 균주는 검출 가능한 양의 단백질을 생산할 수 없으며, 이는 이 특정 위치에 혼입된 표준 아미노산이 없기 때문에 아세틸화 단백질의 순도가 높다는 것을 나타냅니다. 웨스턴 블로팅(western blotting)은 야생형 단백질에서 검출 가능한 아세틸화가 없음을 보여주었으며, 이는 이 발현 시스템의 비특이적 아세틸화의 낮은 배경을 나타내는 반면, 아세틸화 단백질은 명확한 띠를 가졌습니다.탠덤 질량 분석법은 유전자의 해당 위치가 정지 코돈으로 돌연변이된 올바른 위치에서 아세틸화가 발생한다는 것을 확인했습니다. 아세틸화 단백질의 우수한 수율과 순도를 얻으려면 최적화된 아세틸리신 혼입 시스템을 고효율 및 고순도 모두에 사용해야 합니다. BL21(DE3) 세포는 순도를 높이기 위해 낮은 백그라운드 및 비특이적 아세틸화에 사용해야 합니다.유전자 통합 시스템은 더 광범위한 응용 프로그램을 위해 진핵 시스템에서 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 5 일간의 프로토콜은 모든 단계, 장비 및 기반의 효율적인 내생 대장균 처음부터 TX-TL의 무 세포 발현 시스템을 구축 및 실행에 필요한 추가 소프트웨어를 설명합니다. 시약, 프로토콜은 8 셋업 시간 이하의 반응, 수집, 및 프로세스 데이터를 걸린다.

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

이 기사는 관심 단백질과 E. coli의 다른 인자 간의 상호 작용을 모니터링하기 위해 부위 특이적 광교차결합과 함께 펄스 추적 무선 라벨링을 사용하는 방법을 설명합니다. 기존의 화학적 가교 방법과 달리 이 접근 방식은 살아있는 세포에서 정렬된 조립 경로의 고해상도 "스냅샷"을 생성합니다.

부위별 교차결합을 사용하여 분비된 박테리아 독성 인자의 조립 모니터링

다운스트림 분석을 포함하여 비표준 아미노산 유사체를 단백질에 잔류물 특이적으로 통합하기 위한 사용하기 쉬운 무세포 발현 프로토콜이 의료, 제약, 구조 및 기능 연구를 위해 제시됩니다.

를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립<em&gt; 대장균</em&gt; 휴대없는 전사 번역 시스템

여기에서는 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 통합한 후 균주 촉진 아지드-알킨 고리첨가(SPAAC)에 의해 아지드를 화학 프로브와 결합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.

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합성 생물학 비정규 아미노산의 co-translational 삽입을 사용 하 여 전례 없는 속성으로 단백질의 엔지니어링을 수 있습니다. 여기, 우리는 어떻게 소설 형광 분 광 속성, "금" 형광 성 단백질 (GdFP), 불리는 GFP 형 fluorophore의 spectrally 레드 이동 변종 생산 대장균 에서 선택적 압력 관 (SPI)를 통해 제시.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

이 연구는 유전 암호 확장을 활용하여 대 장균 과 포유류 세포에서 인간 에놀라제-1(hENO1)과 슈퍼폴더 GFP(sfGFP)의 특정 부위에 락틸-라이신(Klac)을 성공적으로 통합하는 방법을 확립했습니다.

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배우세요 대장균에서 유전자 코드 확장 기술을 이용하여 특정 부위에 균일하게 아세틸화된 단백질을 생성하는 방법을. 이 프로토콜은 단백질 아세틸화 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

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