Name: 칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 칩 기반 디지털 PCR을 이용하여 위암 조직에서 CDH1 희귀 전사체 변이를 검출하는 방법을. 이 기술은 저발현 표적의 민감한 검출을 통해 정밀도와 재현성을 향상시켜 암 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자 편집 지원 Gráinne Tierney를 감사 하 고 싶습니다.

프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
참고:이 절차는 신선한 냉동 인간의 조직에 cDNA 분자의 낮은 수의 탐지를 위해 특별히 설계 되었습니다. 조직 섹션 동안 여전히 동결, 이전 검증된 환자 파생 위 종양 또는 정상적인 조직 샘플에서 드라이 아이스에 잘라 왔다.
1. RNA 분리 및 정화
<ol><li>
RNA 추출 참고: 특정 제품을 사용 하 여 후드 RNA 격리 수행 ( 재료의 표참조). 그러나, 격리 키트의 다양 한 상업적으로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>균질 RNA 격리 시 약 및 소용돌이의 1 mL와 함께 1.5 mL 튜브에 잘게 잘린된 신선한 냉동 조직 샘플의 50-100 mg 적극적으로 15 미 품에 대 한 튜브-80 ° C에서 하룻밤.</li>
		<li>15 vortexing에 의해 5 분 및 혼합에 대 한 실 온에서 샘플을 포함 하는 튜브를 품 어 s.</li>
		<li>얼음에 튜브를 유지, 클로 프롬, 및 15에 대 한 적극적으로 소용돌이의 200 µ L 추가 s.</li>
		<li>60 s에 대 한 실 온에서 튜브와 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기를 품 어</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 수성 단계를 전송 하 고 glycogen의 20 µ g을 추가 합니다. 참고: 그것은 신중 하 게 오염을 줄이기 위해 interphase 또는 유기 층을 전송 하지 않도록 하는 것이 중요입니다.</li>
		<li>소 프로 파 놀, 혼합, 및 10 분 동안 얼음에 품 어 튜브 반전의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>12000 x g RNA 침전 하 4 ° C에서 15 분 동안에 튜브 원심 참고: RNA 사이드와 원심 분리 후 자주 보이지 않는 튜브의 하단에 젤 같은 펠 릿에 표시 됩니다.</li>
		<li>침전을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 pipetting으로 75% 에탄올의 1 mL와 함께 그것을 씻어.</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 7500 x g에서 튜브 원심 고는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>펠 릿 침전 투명 하 게 될 때까지 건조 하 고 50 µ L RNase 무료 물에 용 해 보자.</li>
		<li>부 량 전에 적어도 하룻밤-80 ° C에서 샘플을 동결.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
게놈 DNA 제거 및 RNA 정화 참고: 열 기반 RNA 정화 뒤 DNase 소화 단계는 오염 DNA를 소화 하기 위해 낮은 풍부 목표의 분석에 대 한 권장.<ol>
<li>동결 건조 된 DNase (1500 Kunitz 단위) RNase 무료의 550 µ L에 주사기, 유리병, 반전으로 부드럽게 혼합을 사용 하 여 물 어 aliquots로 재구성된 재고 솔루션 분할 해산.</li>
		<li>15 µ g의 RNA 샘플의 계산된 볼륨 1.5 mL 튜브에 전송, DNase 소화의 10 µ L 버퍼 키트 ( 재료의 테이블에나열 된), DNase의 2.5 µ L에서에서 나 재고 솔루션 및 100 µ L. 물 RNase 무료 10 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>조직 세포의 용 해 버퍼의 350 µ L 추가 (장비, 재료의 표참조) pipetting으로 혼합.</li>
		<li>Pipetting으로 100% 에탄올과 혼합의 250 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>새로운 스핀 열 및 15 12000 x g에서 원심 분리기로 전체 볼륨 (700 µ L) 전송 s.</li>
		<li>새로운 컬렉션 튜브로 필터를 전송, 열 및 2 분 12000 x g에서 원심 분리기를 80% 에탄올 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>새로운 컬렉션 튜브 필터; 건조 스핀 열 및 5 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기의 뚜껑을 열으십시오 다음 1.5 mL 튜브에 필터를 전송.</li>
		<li>필터 십 분 12000 x g에서 원심 분리기에 직접 RNase 무료 물 14 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>얼음에 샘플을 계속 벤치 정상 분 광 광도 계에는 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 정량화를 진행 하거나 사용까지-80 ° C에서 RNA를 저장할.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. cDNA 합성
<ol><li>RNA, 믹스 마스터의 4 µ L, 역전사, 및 살 균 PCR 튜브에서 20 µ L의 최종 볼륨을 RNase 무료 물 1 µ L의 장소 1000 ng. 부드럽게 혼합 하 고 아래로 회전.</li>
	<li>다음과 같은 조건 적용 열 cycler에 반응 혼합 품 어: 25 ° C, 42 ° C, 85 ° c.에 5 분에서 30 분에서 5 분</li>
	<li>튜브를 짧게 원심 dPCR 분석을 진행 하거나 필요할 때까지-20 ° C에서 저장.</li>
</ol>3. 디지털 PCR 반응 설정
<ol><li>
dPCR 반응 혼합 및 준비 샘플
	<ol>
<li>적어도 20 분 동안 실 온에서 시험 하 고 마스터 믹스 해 동.</li>
		<li>300의 농도에 cDNA 샘플 희석 물 6 µ L에서 ng.</li>
		<li>부드럽게 소용돌이 마스터 믹스와 믹스 마스터 믹스의 8.7 µ L, CDH1a 사용자 정의 설계 분석 결과 뇌관의 0.87 µ L과 nuclease 무료 물 1.83 µ L 무 균 튜브에 11.4 µ L의 최종 볼륨에 대 한 준비. 주: CDH1a 사용자 정의 설계 분석 결과 뇌관 세부 정보에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.</li>
		<li>준비 된 믹스의 11.4 µ L 희석된 cDNA 샘플을 전송, 부드럽게, 혼합 하 고 짧게 원심. 참고: 볼륨 20% 초과를 pipetting 볼륨 손실에 대 한 보상을 포함 됩니다. 모든 샘플 및 아무 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대 한 믹스를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
칩 준비 참고: 최적의 결과 대 한 로드 칩 최대한 빨리.<ol>
<li>칩 로더에 연결 하 고는 표시등이 녹색 밝혀 졌 때까지 기다립니다.</li>
		<li>살짝 다시 플런저를 당겨 침수 액체 주사기의 뚜껑을 제거 1-2 mm이 고이 단계를 촉진 하 고 팁을 공개.</li>
		<li>새로운 칩을 받아 고 샘플 연관 뚜껑에 작성 된 코드의 숙지 합니다.</li>
		<li>뚜껑 신중 하 게 그것의 측면에 의해, 보호 필름 벗 겨 누른 올바른 방향에서 위로 끈 적 얼굴 뚜껑을 배치.</li>
		<li>신중 하 게 칩을 내부 부분을 건드리지 않도록 돌을 선택 하 고 열 클램프 레버를 눌러 올바른 위치에 있는 칩 둥지에 그것을 로드.</li>
		<li>로더에 새로운 로드 블레이드를 로드 하 고 부드럽게 되도록 그것 확고 하 게 자리에 밀어.</li>
		<li>기포 없이 로드 블레이드에 dPCR 반응 혼합의 14.5 µ L을 전송 배포는 칩에 볼륨 버튼을 로드 블랙은 보도 후 블레이드, 왜곡 또는.</li>
		<li>침수 액체 주사기를 사용 하 여 전송 팁과 표면 접촉 하지 않도록 주의 복용 칩 표면에 약 20 방울. 참고: 그것은 가장자리에 액체를 흘리 고 하지 않고 전체 표면을 커버 하는 것이 중요입니다.</li>
		<li>칩을 접촉 하 고 15 눌러 뚜껑을 로더 팔 회전 s.</li>
		<li>칩을 놓고 팔의 위치에 반환을 뚜껑 단추를 누릅니다.</li>
		<li>조립된 칩 45 ° 각도로 하 고 신중 하 게 채우기 포트를 통해 주사기로 침수 액체 분배, 칩 없는 기포 확인을 약간 회전 누른 살 균 삭제 기능으로 어떤 과잉 액체를 제거.</li>
		<li>부드럽게 필 링 멀리 칩 뚜껑과 보도 위에 레이블 적어도 5에 대 한 채우기 포트를 통해 하 여 칩 케이스를 밀봉 s.</li>
		<li>열 cycler에서 로드할 준비가 될 때까지 어둠 속에 칩을 저장 합니다. 참고: 준비 된 칩 2 시간 이내 사용 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
dPCR 반응
	<ol>
<li>뚜껑 열고 단일 블록을 사용 하는 경우에 두 블록에 어댑터를 설치 합니다.</li>
		<li>올바른 위치에 샘플 블록에 칩을 놓습니다. 참고: 채우기 포트 칩의 윈도우를 방해 하지 않고 상단에 떠 있는 공기 방울을 허용 하는 높은 위치에서 열 cycler의 앞 쪽으로 지향 되어야 합니다. 빈 칩을 사용 하 여 두 개의 블록을 균형.</li>
		<li>칩을 완전히 커버 샘플 블록에 열 패드를 하다.</li>
		<li>뚜껑을 닫고 PCR 실행, 다음과 같은 조건 적용 시작: 10 분; 96 ° C에서 개최 30 60 ° C 2 분 및 98 ° C의 45 주기 s; 2 분;에 대 한 60 ° C에서 개최 4 ° c.에서 개최 열 cycler 끄고 칩 적어도 10 분 동안 실 온에서 해 동. 참고: 칩 분석 1 시간 내에서 수행 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
칩 분석
	<ol>
<li>악기의 뚜껑을 열고 열 패드를 제거 다음 어댑터에서 칩을 제거 합니다. 참고: 분석까지, 깨끗 한 위치에 칩을 저장 합니다.</li>
		<li>소 프로 파 놀과 살 균 지우기 칩 표면 청소. 참고: 누수 또는 잠재적인 문제에 대 한 각 칩을 검사 합니다.</li>
		<li>데이터를 저장 하는 검출기 시스템에 USB를 삽입 합니다.</li>
		<li>검출기 시스템의 칩 트레이 열고, 올바른 위치에 있는 칩 보여지는 로드 한 다음 트레이 닫습니다.</li>
		<li>30 대기 처리용, s 다음 칩을 제거 하 고 다음 중 하나를 삽입.</li>
		<li>모든 처리 칩에 대 한 완료 후 파일을 전송 하는 컴퓨터에 USB를 삽입 분석을 기다립니다. 참고: 분석에 대 한 총 시간은 약 3 분/칩 2 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 분석 및 해석
<ol><li>모든 다운스트림 분석을 수행 하는 데 필요한 클라우드 기반 소프트웨어 플랫폼에 연결 합니다.</li>
	<li>프로젝트를 만들고 관심의 칩의 모든 데이터 파일을 가져올.</li>
	<li>샘플 이름;을 입력합니다 염료 및 분석 결과 "정의 칩" 탭에서 사용을 선택 합니다.</li>
	<li>얼마나 철저 하 게 샘플 칩에 로드 된 및 얼마나 많은 데이터 요소는 evaluable 검사 "검토 데이터" 탭에 그것을 시각화 하 여 칩 허용 인지 확인 합니다. 참고: 보다 13000 evaluable 데이터 요소에 대 한 칩을 거부 합니다.</li>
	<li>화면;의 오른쪽에 선택한 칩의 점도로 이동 모든 칩에 6000 fluorescein amidite (FAM) 기자 염료 신호 (y 축)에 대 한 임계값을 적용 합니다. 참고: 설정 임계값 사용 분석에 근거 하 여 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>제거는 분산형에 상대적인 자리를 선택 하 여 거짓 긍정적인 결과 방지 하기 위해 어떤 모호한 긍정적인 신호 플롯 올가미 도구를 사용 하 고 "미정"에서. 모든 나머지 긍정적인 명소 드문 대상 분석의 cDNA 복사본의 존재를 나타냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 작품에 대 한 관심의 없습니다 충돌을 보고합니다.

dPCR는 원래 위해 개발 DNA 분자 측정10,11,,1213 시간 microRNAs 및 RNA 사본5의 정량화에이 기술을 적응 했다 , 1415. 이 프로토콜에서 우리는 신선한 냉동 조직 샘플에서 파생 된 희귀 증명서의 탐지를 포함 하는 응용 프로그램의 목록을 확대 했습니다. 그 목적에 활용 하는 cDNA의 다소 높은 금액 (300 ng). 이 금액은 아니지만 dPCR에서 사용할 수 있는 최대, 그것은 우리의 모든 샘플 비교 표준화 조건 설정에 대 한 충분 한 했다. 6000에서 개화 신호 임계값을 설정 하 고 칩 및 분산형 플롯에 ...

CDH1 유전자 세포 접착, 생존, 확산, 및 마이그레이션1의 규제를 통해 정상적인 위 상피의 유지에 관여 하는 핵심 요소 E cadherin 위한 인코딩합니다. 해로운 생식의 결과로 전자 cadherin 단백질의 손실 또는 CDH1 의 체세포 변경 GC2,3의 개발과 관련 된 되었습니다. Intron의 유전자 2에서 발생 하는 비 정식 성적 증명서 또한 위 발암4,5에 역할을 가설 되어 있다. 특히, 이러한 한 사본, CDH1a, GC 셀 라인에 표현 될 표시 되었습니다 하지만 결 석 정상 위4에서. 우리는 최근 칩 기반 dPCR5를 사용 하 여 GC 환자에서 GC 조직 샘플에서 CDH1a 를 감지. dPCR CDH1a 유전자 사본 장 GC에 정상 조직에의 존재를 처음으로 평가 하는 데 사용 되었다.
유전자 발현을 확인 하기 위해 표준 방법은 실시간 양이 많은 PCR (정량)입니다. 그러나, 결과 데이터 때로는 변수 수 이며 가난한 품질, 특히 때 샘플에는 대상의 수준 낮은. 이 변화는 일반적인 증폭 및 경쟁 측 반응6뇌관 어 닐 링, 및 중 합 효소 활동을 억제 하는 오염 물질에 의해 발생할 수 있습니다.
DPCR의 기본적인 생 화 확 적인 원리는 정량의 그들과 유사 하, dPCR genomic DNA (gDNA)의 매우 정확한 측정을 위해 수 있도록 하는 몇 가지 장점을 보여줍니다 / 보완 DNA (cDNA) 분자. 실제로, dPCR 각각 잘 0 또는 단일 대상 분자 포함 되도록 수천 웰 스, 샘플의 보정 분할에 의존 하는 끝점 반응입니다. 증폭 대상의 복사본을 포함 하는 우물에만 발생 합니다 그리고 형광 신호에 의해 표시 됩니다. 원래 샘플에서 대상 분자의 절대 수 다음 이항 포아송 통계7를 사용 하 여 전체 파티션을 긍정적인의 비율을 결정 하 여 계산할 수 있습니다.
DPCR 기술 표준 곡선을 실행 하기 위한 필요성을 제거 하는 또한, 및, 따라서, 연결 된 바이어스 및 다양성, 대상8,9;의 직접 정량화에 대 한 허용 그것은 오염 물질과 효율성 억제제10; 높은 관용 때문에 독립적으로 더 정확 하 고 재현 가능한 결과 생산 하 그것 더 과민 하 고 정량, 보다 구체적 이며 따라서 드문 대상의 검출에 대 한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 마지막으로, 여러 반응으로 샘플의 분할 배경 분자와 경쟁 줄어들고 대상 검출, 증폭을 가능 하 게 하 고 gDNA/cDNA6의 단일 분자의 검출 한계 향상 . 검색 및 칩 기반 dPCR에 의해 핵 산의 정량화 점점에 적용 된 복사 번호 유사, DNA의 정량화는 파편, 그리고 돌연변이 분석11,,1213, 주어진는 정밀도 낮은 자료 입력 방법의 요구 사항. 또한, dPCR는 최근 두 microRNAs14 그리고 유전자 사본5,15의 분석에 통합 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>TRIazol 시약</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐 20 mg/ml</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>CDH1a IDT 맞춤형 설계 분석</td><td>통합 DNA 기술 (IDT)</td><td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR 최적화 분석 농도: 900 nM (F),&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td></tr><tr><td>QuantStudio 3D 디지털 PCR 20K 칩 키트 v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>Thermo&nbsp; Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler (Labcycler)</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>듀얼 플랫 블록 시료 모듈</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>플랫 블록 열 순환기용 QuantStudio 3D 디지털 PCR 칩 어댑터 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D 디지털 PCR 칩 로더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D 디지털 PCR 기기(전원 코드 포함</td>) <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

칩 기반 디지털 pcr에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 cdh1 드문 사본 이체의 탐지

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

반면 결 석 CDH1a, CDH1 유전자의 정식이 아닌 대 본 일부 위 암 (GC) 셀 라인에 표현 될 발견 되었습니다 정상 위 점 막에서. 최근에, 우리는 GC 가진 환자에서 얻은 신선한 냉동 종양 조직에 CDH1a 사본 이체를 감지. 조직 샘플에서이 이체의 식 칩 기반 디지털 PCR (dPCR) 접근 방식에 의해 여기에 제시 된 조사 했다. dPCR 핵 산의 정확한, 강력한, 그리고 매우 중요 한 측정에 대 한 잠재력을 제공 하 고 점점 더 다양 한 분야에 많은 응용 프로그램에 대 한 활용. dPCR는 감지 드문 목표; 또한, dPCR는 교정기 및 표준 곡선에 대 한 필요 없이 핵 산의 완전 하 고 정확한 정량화에 대 한 가능성을 제공합니다. 사실, 증폭 효율과 억제제에 내성 향상 배경에서 대상을 풍요롭게 반응 분할. 이러한 특성 dPCR CDH1a 희소 한 대 본의 검출을 위한 최적의 도구를 확인합니다.

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리는 위 신선한 냉동 조직에 드문 사본 이체 CDH1a 의 표현에 대 한 확인 합니다. DPCR에 의해 분석 및 11 추가 종양 샘플 21 쌍 정상 및 암 조직 샘플에서 수행 되었다. 아니 정상적인 조직 샘플 보여이 희소 한 대 본5의 존재 하는 반면 CDH1a 15 중 32 (47%) 종양에서 감지 했다. 우리의 분석으로 비 균질 로드 칩 미만 13000 데이터 요소에 대 한 칩 거부 했다. 그림 1 보여줍니다 칩 evaluable (그림 1A)와 비 evaluable (그림 1B, C)에 대 한 샘플 보기. 후자의 경우는 칩 또는 임계값 (<strong class="...

원고는 칩 기반 디지털 PCR 분석 결과를 신선한 냉동 정상에 드문 CDH1 사본 이체 (CDH1a) 및 위 암 환자에서 얻은 종양 조직 검출을 설명 합니다.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

이 방법의 전반적인 목표는 칩 기반 디지털 PCR을 통해 신선 냉동 조직에서 희귀한 전사체 변이체를 검출하는 것입니다. 이 방법은 발암에 관여할 수 있는 희귀 전사체 변이체의 검출과 같은 암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소량의 표적을 검출할 수 있어 골드 스탠다드(gold standard) 정량 PCR에 대한 정밀도와 재현성을 개선할 수 있다는 것입니다.이 방법은 인간의 신선 냉동 조직에서 적은 수의 cDNA 분자 검출에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 종류의 생물학적 샘플에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 칩을 준비하고 분석을 위한 매개변수를 정의하는 데 약간의 기술을 습득해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 시작하려면 마스터 믹스와 분석을 실온에서 최소 20분 동안 해동합니다.그런 다음 0.5 ml 튜브에 6 마이크로리터 분취량의 cDNA 샘플을 로드합니다. 또한 템플릿이 없는 제어 튜브를 만드십시오. 다음으로, 마스터 믹스를 부드럽게 와류시키고 반응당 8.7마이크로리터를 멸균 튜브로 분주합니다.그런 다음 각 반응에 대해 0.87마이크로리터의 맞춤형 분석 프라이머를 추가하고 1.83마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 조합을 부드럽게 혼합하고 11.4마이크로리터를 cDNA가 포함된 각 튜브와 템플릿 없음 대조군으로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 혼합하고 펄스 원심분리를 사용하여 튜브 내용물을 모읍니다.최적의 결과를 얻으려면 가능한 한 빨리 칩을 로드하십시오. 칩 로더를 연결하고 표시등이 녹색으로 바뀔 때까지 기다립니다. 그런 다음 플런저를 1-2mm로 부드럽게 당겨 침지 주사기를 준비한 다음 캡을 제거하고 팁을 추가합니다.다음으로, 새 칩의 뚜껑에 쓰여진 코드를 기록해 두십시오. 그런 다음 뚜껑을 옆으로 조심스럽게 잡고 보호 필름을 벗겨낸 다음 끈적한 면이 위로 향하게 하여 뚜껑 둥지에 놓습니다. 이제 레버를 눌러 클램프를 열고 칩을 칩 네스트에 조심스럽게 로드합니다.다음으로, 새 로딩 블레이드를 로더에 넣습니다. 제자리에 단단히 고정되도록 부드럽게 밀어 넣습니다. 이제 14.5마이크로리터의 반응 혼합물을 로딩 블레이드로 옮깁니다.기포를 만들지 말고 칼날을 편향시키지 마십시오. 그런 다음 검은색 로딩 버튼을 눌러 칩에 볼륨을 분배합니다. 로딩 블레이드가 제자리에 있는지 확인하는 것이 중요합니다.그런 다음 블레이드를 채우는 동안 거품이 발생하지 않도록 피펫을 두 번째 스톱으로 누르지 마십시오. 또한 끝으로 칼날을 휘게 하지 마십시오. 주사기를 사용하여 약 20방울의 침지 유체를 칩 표면으로 옮기십시오.끝으로 표면을 만지지 않도록 주의하고 넘치지 않도록 표면을 완전히 덮으십시오. 그런 다음 로더 암을 회전하여 덮개가 칩에 닿도록 하고 15초 동안 누릅니다. 그런 다음 덮개 버튼을 눌러 칩을 분리하고 로더 암을 정지 위치로 되돌립니다.이제 클램프를 열고 조립된 칩을 45도 각도로 잡고 주사기를 통해 충전 포트를 통해 침지 유체를 조심스럽게 분배합니다. 그런 다음 칩을 약간 회전하여 기포를 제거한 다음 멸균 물티슈로 여분의 액체를 제거합니다. 칩 경계에 침지 액체를 흘리지 마십시오.이 경우 밀봉하기 전에 초과분을 조심스럽게 제거하십시오. 마지막으로 뚜껑의 라벨을 부드럽게 떼어낸 다음 주입 포트를 최소 5초 동안 막아 칩 케이스를 밀봉합니다. 이제 2시간 이내에 칩을 사용하고 그때까지 어두운 곳에 보관하십시오.반응을 설정하려면 단일 블록을 사용하는 경우에도 뚜껑을 열고 두 블록에 어댑터를 설치하십시오. 그런 다음 샘플 블록에 칩을 놓고 주입 포트를 열 순환기 앞쪽으로 향하게 하고 포트를 약간 올립니다. 빈 칩을 사용하여 두 블록의 균형을 맞춥니다.그런 다음 칩을 완전히 덮도록 설정 위에 열 패드를 놓습니다. 그런 다음 사이클을 프로그래밍하고 뚜껑을 닫고 반응을 시작합니다. 반응이 끝나면 열 순환기를 끄고 열 패드를 제거한 다음 칩을 제거하십시오.어둠 속에서 최소 10분 동안 칩을 실온으로 해동하고 한 시간 이내에 분석하십시오. 칩 표면을 이소프로판올로 청소하면서 누출 또는 기타 문제가 있는지 검사합니다. 데이터를 저장하려면 데이터를 저장할 수 있는 감지기 시스템에 USB 메모리 스틱을 삽입하십시오.그런 다음 감지기 시스템의 칩 트레이를 열고 칩을 위로 향하게 로드합니다. 트레이를 닫고 데이터가 처리될 때까지 30초 동안 기다립니다. 그런 다음 칩을 제거하고 다음 칩에 대해 이 과정을 반복합니다.그런 다음 USB 스틱을 감지기에서 컴퓨터로 이동하고 파일을 전송합니다. 클라우드 기반 소프트웨어를 연 다음 프로젝트를 만들고 관심 칩에 대한 모든 데이터 파일을 가져옵니다. 그런 다음 Define Chips 탭에서 사용된 염료와 분석을 선택합니다.칩이 허용 가능한지 확인하려면 Review Data 탭에서 시각화합니다. 샘플이 잘 로드되면 최소 13, 000 포인트를 사용할 수 있어야 합니다. 다음으로, 선택한 칩에 대한 산점도를 살펴봅니다.거기에서 분석 유형에 의해 정의된 임계값을 적용합니다. fluorescein amidite 리포터 염료 신호의 경우 임계값 6, 000을 사용합니다. 이제 오탐을 유발할 수 있는 모호한 신호를 제거합니다.올가미 도구를 사용하여 산점도에서 의심스러운 지점을 선택하고 결정되지 않음 옵션을 선택합니다. 나머지 모든 양성 반점은 분석된 희귀 표적의 cDNA 사본이 있음을 나타냅니다. 여기에 제시된 절차를 사용하여 위 신선 냉동 조직에서 희귀 전사체 변이체 CDH1a의 발현을 확인했습니다.칩에 여러 개의 거품, 하나의 큰 거품 또는 13,000개 미만의 데이터 포인트가 있는 경우 분석에서 생략되었습니다. FAM 채널에 대해 선택한 임계값인 6, 000을 초과하는 양의 신호가 템플릿 없음 컨트롤에 존재하지 않았습니다. 노란색 점은 증폭이 없음을 나타냅니다.미세 칩 분석을 통해 품질이 낮은 데이터 포인트를 필터링하고 모호한 결과의 위험을 제거했습니다. 증폭을 나타내는 파란색 신호가 발견되었을 때, 칩의 경계에 있거나 거품 주변에 있는 경우 신호가 생략되었습니다. 마찬가지로, 거짓 긍정의 위험을 더욱 방지하기 위해 선택한 FAM 임계값 위와 플롯의 맨 오른쪽에 있는 신호는 비특이적일 가능성이 높았으며 필터링되었습니다.21쌍의 정상 및 암 조직 샘플과 11개의 추가 종양 샘플을 분석했습니다. 전체적으로 희귀 전사체 CDH1a는 32개의 종양 중 15개에서 검출되었습니다. 대조적으로, 21개의 대조군 조직 샘플 중 어느 것도 이 희귀한 전사체의 존재를 보여주지 않았습니다.이 비디오를 시청한 후에는 칩 기반 디지털 PCR로 신선 냉동 조직에서 희귀한 전사체 변이체를 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행된다면 샘플 수에 따라 6시간에서 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플을 블레이드에 정확하게 로드해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후 이 기술은 분자 진단 분야의 연구자들이 암 환자의 희귀 염기서열 변이를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 DNA 샘플에서 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하기 위한 chip-in-a-tube 형식의 디지털 PCR의 유용성을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적인 PCR 반응으로 작용하는 챔버로 분할되며, 챔버 내 증폭된 표적에서 형광 신호를 검출하는 것은 샘플 내 변이 대립유전자의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

이 비디오는 희귀 전사체 변이체를 검출하는 데 유용한 디지털 PCR 기술의 변형인 칩 기반 디지털 PCR을 보여줍니다. PCR 반응은 나노유체 칩의 챔버로 분할되며, 각 챔버는 독립적인 반응으로 작용합니다. 증폭된 표적이 있는 챔버에서 형광 신호를 감지하면 샘플에 희귀한 전사체 변이체가 존재함을 확인할 수 있습니다.

나노유체 칩을 사용하여 희귀한 전사체 변이체를 검출하는 칩 기반 디지털 PCR

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

순환 혈액에서 ribonucleic 산 (cRNA)의 임상 진단에 unmet 필요 이다. 여기 우리가 과민 하 고 특정 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 비 작은 세포 폐 암 환자에서 cRNA를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 테스트 72 시간 이내 퓨전 변종 감지 하 디자인 요구 사항을 충족.

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여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

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말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

배우세요 칩 기반 디지털 PCR을 이용하여 위암 조직에서 CDH1 희귀 전사체 변이를 검출하는 방법을. 이 기술은 저발현 표적의 민감한 검출을 통해 정밀도와 재현성을 향상시켜 암 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

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