Name: 말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 배우세요 말라리아 감염 적혈구에서 방출되는 세포 외 소포체의 기능을 평가하는 방법을. 이 기법은 Plasmodium falciparum 기생충과 숙주 세포 간 상호작용 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 연구 재정적으로 일부 의학-생물학 연구 (미국적)를,는 고트프리트 줄리아 Bangerter-Rhyner-재단 (MW 미국적)를, 그리고 Fribourg의 대학 (에 미국적)의 연구 수영장에 대 한 노바 티 스 재단에 의해 지원 되었다. 추가 보조금 외국 학자 (갑과 SM) 스위스 정부 우수 장학금 포함 됩니다. 우리 기술 지원에 대 한 이자벨 Fellay와 Solange Kharoubi 헤스 감사합니다.

인간의 Rbc는 Swissethics (swissethics.ch)의 지침에 따라 건강 한 기증자의 혈액에서 얻은 했다.
참고: P. falciparum 기생충 문화 (3D 7)와 EV 생산은 이전에 설명 된 Mbagwu, 외 알. 11 P. falciparum 인간의 병원 체 이기 때문에 처리에 대 한 현지 규정을 참조 하십시오. 문화는 유지 되어야 한다 살 균 전체 시간.
1. 형광 EVs의 라벨
참고: 다음 절차는 EV 막의 지질 지역에서 큰 지방 족 꼬리와 안정적으로 녹색 형광 염료 (PKH67)를 통합 하는 라벨 기술 이용 합니다. 반응은 200 µ L PKH67의 20 µ M 최종 농도 포함 하는 볼륨을 얼룩 마지막에 수행 됩니다. 주위 온도 (20-25 ° C)에서 모든 단계를 수행
<ol><li>장소 100 µ g EVs의 microcentrifuge 튜브에 PBS의 1 mL에.</li>
	<li>펠 렛를 7 분에 대 한 최대 속도 (20000 x g) microcentrifuge 관에서 EVs 원심 참고: 말라리아 EVs에 존재 이므로, 레드-어두운 갈색 펠 릿 관찰 해야. 경우는 상쾌한 붉은, 다음 EVs 있다 lysed.</li>
	<li>원심, 후 어떤 EVs를 제거 피하기 위하여는 상쾌한을 신중 하 게, 발음. 참고: 재현성 및는 얼룩의 효율성을 증가 하기 위하여 희석제 C에 EVs를 resuspending 하기 전에 나머지 버퍼의 양을 최소화 합니다.</li>
	<li>희석제 C의 100 µ L에서 EV 펠 릿 resuspend (EV 정지 X 2)와 완전 한 분산을 막으려고 피펫으로 부드럽게.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 튜브를 준비 하 고 희석제 C. 소용돌이 잘 혼합의 100 µ L을 PKH67 ethanolic 염료 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 얼룩이 지기 직전이 2 배 염료 솔루션 (40 µ M)를 준비 합니다. 참고: 이기종 얼룩을 방지 하려면 추가 하지 마십시오 PKH67 ethanolic 염료 솔루션 EV 펠 릿에 직접.</li>
	<li>빠르게, 염료 솔루션 (단계 1.5) X 2의 100 µ L EV 정지 (단계 1.4) X 2의 100 µ L 결합 되어 있습니다. 그런 다음 10 번 위아래로 pipetting으로 샘플을 혼합.</li>
	<li>빛과 믹스에서 vortexing에 의해 3-4 회 동안 보호 5 분 인큐베이션 단계 1.6 5 분에서에서 EV/염료 정지를 품 어. 참고: 긴 시간에 대 한 EV/염료 정지 잠복기 때문에 얼룩이 지는 그래서 빠른 이점이, 제공 합니다.</li>
	<li>혈 청의 동일한 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 여 착 색 반응 중지 하 고 과잉 염료의 바인딩 수 있도록 1 분 동안 품 어. 참고: 얼룩이 지는 중지 하기 전에 20 분 20000 x g에서 원심 분리 하 여 EVs에서 혈 청을 고갈 합니다.</li>
	<li>PBS로 3 번 세척 하 고 스핀 다운 5 분에 대 한 20000 x g에서 1 µ g / µ L의 최종 농도 도달 하는 PBS의 100 µ L에 EVs를 Resuspend.</li>
</ol>2. Confocal 현미경 검사 법에 의해 EVs의 시각화
참고: 다음 프로토콜 설명 유리 coverslips에 성장 하는 내 피 세포에 의해 EV 국제화의 추적을 합니다. 내 피 세포는 반 불멸 하 게 인간의 골 수 내 피 세포12에 설명 된 대로.
<ol><li>메 마른 환경에서 working coverslips 0.01% 폴 리-L-리 신 실 온 (RT)에서 10 분의 초과 코트.</li>
	<li>폴 리-L-리 신 솔루션을 발음 하 고 완전히 말리는 것을 coverslips 허용.</li>
	<li>Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 내 피 세포 수를 수행 합니다.</li>
	<li>완전 한 내 피 세포 성장 매체 폴 리-L-리 신-코팅 coverslips에 보충 혼합을 포함 하 고는 단층에 성장 하는 세포의 1 mL에 1 x 105 내 피 세포를 전송 합니다. 참고: 매체 성장 인자 세포는 단층을 형성 하 고 꽉 접합을 형성 있도록 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>세포는 단층을 형성, 일단 신중 하 게 매체를 발음 하 고 셀을 씻어 신선한 매체의 1 mL를 추가 합니다. 한 번 더 세척을 반복 합니다. PKH67 표시 된 EVs의 50 µ g을 추가 하 고 4 시간 품 어. 참고: 통풍 관에 대 한 최적의 시간 포인트를 찾으려고 한 시간 코스 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>4 h 후 매체, 발음 하 고 3 회 초과 및 언바운드 EVs를 제거 하는 PBS 가진 세포를 씻어. 15 분에 대 한 PBS에 3 %paraformaldehyde 솔루션 셀을 수정 합니다. 참고: 메탄올 중단 될 수 있습니다 걸 고정 과정; 따라서, fixatives 또는 다른 용 매 기반 fixatives 포함 된 어떤 메탄올을 피하기 위해 최상 이다. 메탄올-무료 포 름 알 데히드는 정착 액으로 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>3 회 PBS로 세포 세척. 0.1%의 신중 하 게 250 µ L 추가 세포를 permeabilize에 PBS에 트라이 톤 X-100. 5 분에 대 한 RT에서 품 어.</li>
	<li>PBS로 3 회 세척. 일반적인 바인딩을 차단 하는 RT에 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS에 5 %BSA)의 400 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>PBS 한번 셀을 씻어. 5 µ L의 각 커버 슬립 당 200 µ L PBS/1% BSA의 phalloidin 재고 솔루션 diluting 하 여 얼룩 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 200 µ L는 coverslip에 얼룩 솔루션의 실시간에서 20 분 동안 품 어 고</li>
	<li>PBS로 3 회 세척. 30에 대 한 DNA counterstain 2 µ g/mL PBS의 200 µ L에서의 최종 농도에 Hoechst 33342 s.</li>
	<li>PBS의 400 µ L을 추가 하 여 2는 coverslip 배를 씻어. 조심 스럽게 집게는 coverslip 잡아 하 고 유리 슬라이드에 미디어를 마운트 하는 antifade의 드롭 상단 반전. 부드럽게 휴지로 초과 미디어를 제거 하 고 매니큐어와 양쪽 인감.</li>
	<li>4 ° c.에 빛에서 보호 하는 슬라이드 저장</li>
	<li>레이저 업무가 405, 488, 543 nm와 63 X, 형광 방출 450-470 nm (파란색), 505-530 nm (녹색), 및 620에서 1.3 나 오일 목표에 confocal 현미경을 사용 하 여 셀을 시각화 nm. 참고: 일반적인 F-말라 얼룩 결과 그림 1에 표시 됩니다.</li>
</ol>3. 내 피 세포 침투성
참고: 내 피 세포 침투성 내 피 세포 단층에 걸쳐 rhodamine B isothiocyanate-dextran (평균 MW 70000)의 이전을 측정 하 여 평가입니다. Dextran 혈관 침투성을 공부 하는 훌륭한 도구를 제공 합니다.
<ol><li>0.4 %Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 내 피 세포를 계산 합니다.</li>
	<li>24-잘 조직 문화 삽입 (0.4 µ m 기 공 크기)와 차별화 된 monolayers를 적어도 5 일 동안 그대로 두고 합류 105 셀 x 0.6의 밀도에서 내 피 세포 격판덮개 두 번째 매일 매체를 새로 고칩니다.</li>
	<li>세포는 단층에 도달, 로드 EVs (1 mL에서 50 µ g) 상단 챔버에. 20 mg/mL의 최종 농도에서 최고 잘 rhodamine dextran을 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>40 µ L 중간 aliquots에서 형광 방출 측정에 의해 잘 아래 형광 dextran의 이전을 모니터링 합니다. 544 nm 여기 및 측정에 대 한 590 nm 방출에서 다중 레이블 microplate 리더를 설정 합니다. 참고: 확산된 dextran 양의 수 측정할 수 재고 솔루션 설립 보정 곡선을 사용 하 여. 또한, 운동 실험 시간 과정 (그림 2) 외부 챔버 매체의 작은 샘플을 제거 하 여 수행할 수 있습니다. 어떤 치료 없이는 dextran 셀 단층을 통해 무마 합니다.</li>
</ol>4. 결정 Puromycin 감도
참고: lentivirus와 셀 라인을 시험 하기 전에 그것은 그 특정 셀 라인에 대 한 선택 된 약물의 kill 곡선을 결정 하는 것이 중요. 모든 셀, 선택 된 약물의 증가 복용량을 사용 하는 복용량 응답 실험을 수행 하는 데 필요한 약물 농도의 최소 금액을 결정 합니다. 각 포유류 세포 라인 실험, 전에 다른 감도 있기 때문에 항생제의 최적 농도 아래 서 kill 곡선 적정 개발 하 여 결정 되어야 합니다.
<ol><li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 완전 한 내 피 세포 성장 매체 포함 하는 보충 믹스에에서 1 x 105 셀/mL의 농도에서 내 피 세포 resuspend</li>
	<li>내 피 세포 성장 매체의 100 µ L의 최종 볼륨에서 96 잘 접시로 플레이트 1 x 104 셀.</li>
	<li>0.1-10 µ g/mL의 농도 얻기 위해 항생제를 포함 하는 매체의 100 µ L를 추가 ( 그림 3참조).</li>
	<li>세포 생존 능력 20 X 목표를 사용 하 여 가벼운 현미경 2 일 마다 검사 합니다. 10 월 14 일에 대 한 셀을 문화 고 puromycin 세포 성장에 따라 매 2-3 일을 포함 하는 미디어를 대체 합니다.</li>
	<li>10 µ L/잘 MTS 시 약 각 잘 믹스에 추가 하 고 표준 문화 조건에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>짧게 통에 접시를 흔들 및 490에서 플레이트 리더를 사용 하 여 치료 및 치료 세포의 흡 광도 측정 nm (그림 3).</li>
</ol>5. 변환 Lentiviral 벡터와 내 피 세포의
<ol><li>플레이트 1 x 10의 완전 한 매체 변환 전에 하루 1 mL에 내 피 세포를5 . 셀에는 50-80 %confluency 도달 했습니다 때 변환을 수행 합니다.</li>
	<li>얼음, lentivirus 녹여 그리고 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 바이러스의 aliquots. 스핀 30 200 x g에서 자료 다운 유출 피하기 위하여 열기 전에 튜브에 s.</li>
	<li>Hexadimethrine 브 로마 이드 8 µ g/mL의 최종 농도에 셀을 추가 합니다. 그러나 참고: Hexadimethrine 브 로마 이드 어떤 경우에는 셀에 대 한 독성이 있을 수 있습니다 변환 효율을 도움이 됩니다. 따라서, 변환 하기 전에 죽이 곡선을 수행 하 여 최적의 농도 결정 한다.</li>
	<li>부드럽게 혼합 하 판을 소용돌이 친다. 감염 (MOI)의 적당 한 복합성에 (0.5-2 x 106 입자) 사이 바이러스 성 입자의 적절 한 수량을 추가 하 고 부드럽게 30 대 판 소용돌이를 섞어 s.</li>
	<li>변환 효율을 높이 300 x g에서 45 분 RT에서 원심 분리기에서 셀 바이러스 성 입자 혼합 원심 37 ° C에서 셀 바이러스 성 입자 혼합물을 밤새 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 바이러스 입자에 포함 된 매체를 제거 하 고 적절 하 게 삭제. 신선 하 고, 미리 데워 진 완전 한 문화 매체 바꿉니다.</li>
	<li>두 번째 날에 puromycin 선택 시작: 매체를 제거 하 고 신선한 매체 puromycin 섹션 4 (그림 3)에서 이전 결정의 정확한 농도 포함 하.</li>
	<li>Puromycin 선택 후 세포를 수확 하 고 RNA는 RNA 키트 제조업체의 지침에 따라 격리를 사용 하 여 분리.</li>
	<li>선택 된으로 cDNA 합성을 수행 miRNAs 반전 녹음 방송을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>13인용된 프로토콜 따라 정량 반응을 설정 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2015/report/en/">WHO Malaria Report 2015</a>. , (2015).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11832955">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li>
<li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744(2010).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li>
<li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727(2016).</li>
<li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li>
<li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line%3A+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li>
<li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port%3A+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis%2C+clinical+features%2C+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li>
<li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas 등 여러 기생충 감염 된 주인 세포에 의해 EVs의 석방을 트리거합니다. 병원 체에 따라 출시 된 EVs 호스트 면역 반응을 조절 하거나 기생충6사이 셀룰러 통신을 중재 수 있습니다. 그러나, 이러한 작은 소포 말라리아 질병에 기여 하는 방법을 제안 하는 조금 기록이 있다. 여기, 우리는 변형 체 감염 동안 EVs의 기능을 조사 하기 위해 여러 가지 방법으로 설명 했습니다. 예를 들어, 받는 사람 세포 vivo에서 EVs의 통풍 관의 라벨 PKH67 형광 염료와 효율적으로 모니터링할 수 있습니다. 여러 컨트롤 라벨의 특이성을 보장 하기 위해 수행 해야 합니다. 그것은 일단 희석제 C와 혼합, PKH67 염료 양식 집계 하는 경향이 있다 그리고 그것은 일반적인 얼룩 확인 하려면 EVs 없이 혼자 염료를 사용 하 여 컨트롤을 포함 하는 데 필요한 따라서 중요. Confoc...

세계 보건 기구에 따르면 말라리아의 212 백만 새로운 경우 2015 년에 전세계 있었고 약 429,000 명이 사망, 주로 어린이 나이1의 5 년. 종종 연관 된 혈관 부전, 심한 질병으로 이어지는 메커니즘 남아 병이 정의2. 변형 체iRBCs extracellular 소포 (EVs)로 알려진 작은 이중 지질 막 분야 분 비. 그것은 알려져 이러한 EVs는 잠재적으로 관련 감염 프로세스 및 호스트 면역 반응 감염; 그러나, 약간 말라리아 감염3동안 이러한 작은 소포의 정확한 기능에 대 한 알려져 있다. 그들은 두 가지 중요 한 역할을 재생 가능: 한 반면에, 그들은 수 있습니다 기여할 병 인 세포4,5;를 활성화 하 여 그리고 다른 한편으로, 그들은 셀룰러 통신 기생충 및 기생충과 호스트6,7을 중재할 수 있습니다. 사실, EVs를 통해 서로 간의 기생충 단백질 또는 핵 산을 전송할 수 있습니다. 예를 들어 Trypanosoma brucei rhodesiense EVs 독성 요소 Serum Resistance-Associated (SRA)를 전송할 수 있습니다 그리고 다른 T. brucei 와 호스트 모두 적혈구8타겟팅 할 수 있습니다. 또한, P. falciparumiRBCs EVs 내의 핵 산을 전송 하 여 서로 간에 통신 합니다. 기생충을 최적화 하 고의 성장을 동기화 수 있습니다. 사실, EVs gametocyte 변환의 주요 레 귤 레이 터 수 되 고 따라서 전송 단계7의 규정에 기여.
뿐만 아니라 EVs는 기생충을 통제, 그들은 또한 기생충-호스트 상호 작용을 중재. 우리는 최근에 iRBCs에서 EVs 호스트 파생 microRNAs (miRNAs; 21-25의 뉴클레오티드9의 범위에 작은 RNA 종) 인간의 내 피 세포에 의해 채택 되었다을 포함 발견 했다. EVs에 miRNAs 안정 Ago2와 복잡 한 형성 (구성원 RNA 유도 침묵의 복잡 한), 받는 사람 세포에 전달 되 면 구체적으로 유전자 발현을 침묵 하 고 셀10의 장벽 속성에 영향을 미치는입니다. 표준 프로토콜 EVs의 기능을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 자, 먼저 받는 사람 세포에 의해 그들의 통풍 관을 조사 하기 위해 EVs의 형광 라벨 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, confocal 현미경을 사용 하 여 셀 내부 EV의 운명을 추적 수는. 여러 형광 염료 EVs를 추적을 사용할 수 있습니다. 아민-반응성 염료, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 그리고는 소포 안에 한 번 Calcein-오전 될 형광. 밝게 하 고 더 많은 일정 한 신호를 제공 하기 때문에 우리 PKH, amphiphilic 레이블을 사용을 선호 합니다. 이 방법은 EVs와 받는 사람 세포 간의 상호 작용을 이해 하는 중요 한 정보를 제공 합니다. 경우에 따라 EVs는 세포의 표면에 묶는, 하는 동안 일부 소포는 급속 하 게 채택 되었다. 글귀, 시 EVs는 그들은 그들의 규정 하는 기능을 발휘 하는 세포에 그들의 화물을 제공 합니다.
여기, 우리는 세포 단층을 통해 형광 dextran의 전송을 측정 하 여 체 외에서 내 피 세포의 장벽 기능을 측정 하는 프로토콜을 설명 합니다. 방사선된 마커 같은 더 민감한 추적기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 그들은 사용 하기 위해 특별 한 안전 조치를 요구 한다. 다른 분석 실험 꽉 접합 무결성 측정 transendothelial 전기 저항 (TEER) 같은 생체 외에서 의 장벽 기능을 측정 하기 위해 존재 한다. 마지막으로 조로-1, 긴밀 접합 단백질 면역 형광에 의해 시각화 뿐만 아니라10으로 꽉 접합 무결성 평가 수 있습니다. EVs 잠재적인 규정 특성을 가진 여러 화물을 포함 하는 복잡 하 고 유형이 다른 엔터티 있기 때문에, 그것을 받는 사람 세포에 미치는 영향을 연구 하는 특정 RNA overexpress 유용 합니다. 따라서, 우리는 또한 관심10의 miRNA를 표현 안정적 셀 라인을 생성 하는 것을 목표로 하는 프로토콜을 정의 합니다.

<table><tbody><tr><td>PKH67 녹색 형광 세포 링커 미니 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>희석제 C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&ndash; Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>PET 막 투명 Falcon 삽입물&nbsp; 플레이트 24 웰</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장&nbsp; 중간 MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS 세포 증식 색량 분석 키트</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp; Lenti microRNA, Human has-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction</td><td>Particles Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp; Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 역전사 키트 1000 반응</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>has-mir-451a&nbsp; RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

말라리아는 변형 체 기생충으로 인 한 생명이 질병, P. falciparum 되 가장 아프리카 대륙에서 우세 하 고 대부분 말라리아 관련 사망자에 대 한 책임 세계적으로. 조직, 혈관 부전, 및 염증 응답 기생충 격리 등 여러 가지 요인 말라리아에 감염 된 사람들에 있는 질병의 진화에 영향. P. falciparum-감염 된 적혈구 (iRBCs) 출시 작은 extracellular 소포 (EVs) 기생충과 호스트 사이의 pathogenesis 및 휴대 통신을 중재 하는 화물 분자의 다른 종류를 포함. EVs는 효율적으로 있는 그들은 그들의 기능을 조절 하는 세포에 의해 촬영. 여기 우리는 기생충-호스트 상호 작용에서 EVs의 역할을 해결 하기 위해 전략을 논의. 첫째, 우리는 녹색 셀 링커 염료를 사용 하 여 레이블 및 내 피 세포에 의해 EV 국제화를 추적 간단 방법을 설명 합니다. 둘째, 우리 보고 붙일 레이블된 dextran을 사용 하 여 내 피 세포 단층에서 침투성을 측정 하는 간단한 방법. 마지막으로, 우리 내 피 세포 기능에 작은 비 코딩 RNA 분자의 역할을 조사 하는 방법을 보여 줍니다.

여기, 우리 호스트 셀 EVs의 상호 작용을 조사 하는 프로토콜을 설명 합니다. 붙일 레이블된 EVs의 글귀는 confocal 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 모니터링 됩니다. 그러나 내 피 세포 효율적으로 차지 EVs, EVs와 보육 시간 통풍 관을 추적 하기 위해 낙관 될 수 있다. 셀 내부 EVs의 더 나은 지역화, phalloidin와 말라 얼룩. 다음, 우리는 내 피 세포의 단층 성장 필터 멤브레인을 사용 합니다. Rhodamine B isothiocyanate-dextran 필터 멤브레인의 최고 약 실에 적용 하 고 내 피 단층의 침투성 바닥 챔버 (그림 2A)에 형광 dextran의 전송을 모니터링 하 여 측정 된다. 일반적으로, 내 피 세포의 침투성은 EVs (그림 2B)의 증가 금액으로 부 화...

이 작품에서는, 우리는 변형 체 falciparum 감염 적혈구에 의해 발표 하는 extracellular 소포 (EVs)의 역할을 조사 하기 위해 프로토콜 설명 합니다. 특히, 우리는 내 피 세포와 EVs의 상호 작용에 초점.

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

이 절차의 전반적인 목표는 말라리아 기생충에 감염된 적혈구가 방출하는 세포 외 소포의 기능을 조사하는 것입니다. 이 방법은 기생충이 기생충-숙주 의사소통을 어떻게 조절하는지와 같은 말라리아 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 indoterot 세포에 의한 소포 RNA의 조절 기능을 연구하는 indoterot 세포에 의한 소포 중재를 시각화하는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 Mya Alondez, Smartin Bagu, Bayo Babatunde로, 모두 제 연구실의 대학원생입니다. 마이크로 원심분리 튜브에 100마이크로그램의 세포외 소포체와 1밀리리터의 인산염 완충 식염수를 추가합니다. 다음 20, 펠릿을 형성하기 위하여 7 분 동안 000 시간 g의 최대 속도로 세포외 소포체를 분리기하십시오.원심분리가 끝나면 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 폐기합니다. 그런 다음 세포외 소포 펠릿을 100마이크로리터의 희석액에 용해 C.To 여러 번 피펫을 완전히 혼합합니다. 다음으로, 새로운 마이크로 분리기 관에서는, Dilmant C.Then 와류의 100개 마이크로리터에 PKH67 에탄올 염료 해결책의 4 마이크로리터를 혼합물 잘 추가하십시오.염색 과정 직전에 40 마이크로몰 2XPKH67 염료 용액을 준비합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 2 x 세포 외 소포 현탁액을 동일한 부피의 PKH67 에탄올 염료 용액과 신속하게 결합하십시오. 그런 다음 혼합물을 10회 피펫팅하여 적절한 혼합을 확인합니다.혼합이 완료되면 세포외 소포 및 PKH67 에탄올 염료 용액을 빛에서 5분 동안 배양합니다. 배양 과정에서 혼합물을 3-4회 계속 와류로 가열합니다. 염색 반응을 중지하려면 혼합물에 200마이크로리터의 혈청을 추가하고 과도한 염료가 결합할 때까지 1분 동안 배양합니다.다음으로, 인산염 완충 식염수로 세포외 소포체를 세 번 세척합니다. 세척 후에, 20, 5 분 동안 000 시간 g에 표본을 분리기. 그런 다음 세포외 소포 펠릿을 100마이크로리터의 인산염 완충 식염수에 용해시켜 마이크로리터당 1마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.1ml의 완전한 내피 세포 성장 배지에 있는 내피 세포를 폴리-엘리텐 코팅된 커버 슬립으로 옮깁니다. 세포가 커버 슬립에서 단층으로 성장하도록 합니다. 단층이 형성된 후 배지를 조심스럽게 제거하고 1ml의 새 배지를 추가하여 세포를 두 번 세척합

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 GFP 형질 전환 말라리아 기생충이 장기 내에 기생충의 이동성과 혈액 흐름의 부량를 사용하여 비장의 intravital 현미경을 수행하는 방법을 보여줍니다.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

이 메소드는 혈소판 응집 매개 표현형을...

의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜<em&gt; 변형체 falciparum의</em자원별로 설정에서&gt; - 감염된 적혈구

의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한...

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

항체의 기능을 측정하는 것은 변형체 falciparum의 말라리아에 대한 내성을 이해하는 열쇠입니다. 이 방법은 가능한 merozoites의 정화 및 유동 세포 계측법에 의해 옵 소닌 의존 식균 작용의 측정에 대해 설명합니다.

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

적혈구 내에서 말라리아 기생충 침입하여 및 복제합니다. merozoite 침공과 기생충의 정확한 평가는 말라리아 감염의 과정을 평가에 따라서 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 말라리아의 마우스 모델에서 이러한 매개 변수의 측정을위한 기반 프로토콜 유동 세포 계측법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의해 쥐 말라리아 기생충의 생체 내 평가와 Merozoite 침공

인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

인간 microRNA는 숙주 적혈구에서 Plasmodium falciparum 기생충으로 전위합니다. 여기에서는 합성 microRNA를 숙주 적혈구로 transfection하고 P. falciparum에서 모든 RNA를 분리하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다.  또한 이 논문에서는 기생충 전사체의 리보솜 점유 및 번역 가능성을 결정하기 위해 P. falciparum에서 폴리솜 분리 방법을 자세히 설명합니다.

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Plasmodium falciparum 감염에 자연적으로 드러나는 개인의 혈장 또는 혈장에 존재하는 항체의 용량을 측정하는 방법에 대한 지침을 제공하여 기생충에 감염된 적혈구 (IEs)의 phagocytosis를 opsonize 및 유도하는 것입니다.

유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정

여기서 우리는 감염의 혈액 단계에서 Plasmodium 에 대한 세포 면역의 메커니즘을 밝히는 데 도움이되는 새로운 방법을 설명합니다. 이것은 세포 독성 림프구에 의한 감염된 적혈구 사멸을 측정하는 시험관 내 분석입니다.

체외 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸 분석

배우세요 말라리아 감염 적혈구에서 방출되는 세포 외 소포체의 기능을 평가하는 방법을. 이 기법은 Plasmodium falciparum 기생충과 숙주 세포 간 상호작용 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

더 많은 동영상 탐색