말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 말라리아 기생충에 감염된 적혈구가 방출하는 세포 외 소포의 기능을 조사하는 것입니다. 이 방법은 기생충이 기생충-숙주 의사소통을 어떻게 조절하는지와 같은 말라리아 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 indoterot 세포에 의한 소포 RNA의 조절 기능을 연구하는 indoterot 세포에 의한 소포 중재를 시각화하는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Mya Alondez, Smartin Bagu, Bayo Babatunde로, 모두 제 연구실의 대학원생입니다. 마이크로 원심분리 튜브에 100마이크로그램의 세포외 소포체와 1밀리리터의 인산염 완충 식염수를 추가합니다. 다음 20, 펠릿을 형성하기 위하여 7 분 동안 000 시간 g의 최대 속도로 세포외 소포체를 분리기하십시오.

원심분리가 끝나면 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 폐기합니다. 그런 다음 세포외 소포 펠릿을 100마이크로리터의 희석액에 용해 C.To 여러 번 피펫을 완전히 혼합합니다. 다음으로, 새로운 마이크로 분리기 관에서는, Dilmant C.Then 와류의 100개 마이크로리터에 PKH67 에탄올 염료 해결책의 4 마이크로리터를 혼합물 잘 추가하십시오.

염색 과정 직전에 40 마이크로몰 2XPKH67 염료 용액을 준비합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 2 x 세포 외 소포 현탁액을 동일한 부피의 PKH67 에탄올 염료 용액과 신속하게 결합하십시오. 그런 다음 혼합물을 10회 피펫팅하여 적절한 혼합을 확인합니다.

혼합이 완료되면 세포외 소포 및 PKH67 에탄올 염료 용액을 빛에서 5분 동안 배양합니다. 배양 과정에서 혼합물을 3-4회 계속 와류로 가열합니다. 염색 반응을 중지하려면 혼합물에 200마이크로리터의 혈청을 추가하고 과도한 염료가 결합할 때까지 1분 동안 배양합니다.

다음으로, 인산염 완충 식염수로 세포외 소포체를 세 번 세척합니다. 세척 후에, 20, 5 분 동안 000 시간 g에 표본을 분리기. 그런 다음 세포외 소포 펠릿을 100마이크로리터의 인산염 완충 식염수에 용해시켜 마이크로리터당 1마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.

1ml의 완전한 내피 세포 성장 배지에 있는 내피 세포를 폴리-엘리텐 코팅된 커버 슬립으로 옮깁니다. 세포가 커버 슬립에서 단층으로 성장하도록 합니다. 단층이 형성된 후 배지를 조심스럽게 제거하고 1ml의 새 배지를 추가하여 세포를 두 번 세척합니다.

그런 다음 PKH67 염색된 세포외 소포체 50마이크로그램을 커버 슬립에 추가하고 4시간 동안 배양합니다. 배양 후 배지를 흡인합니다. 결합되지 않은 모든 세포외 소포체를 제거하려면 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 씻습니다.

커버 슬립을 염색하는 동안 세포 손실과 커버 슬립 파손을 방지하기 위해 미세한 집게를 사용하여 커버 슬립을 조작하는 동안 세심한 주의를 기울여야 합니다. 세척 후 인산염 완충 식염수에 파라포름알데히드 용액 3%를 사용하여 15분 동안 세포를 고정합니다. 다시 말하지만, 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 세척하고 인산염 완충 식염수 250마이크로리터에 0.1% 트리탄 x 100을 첨가하여 세포를 투과화하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로, 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 세척하고 세포에 400마이크로리터의 차단 완충액을 추가합니다. 그런 다음 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 차단 후 인산염 완충 식염수로 세포를 한 번 세척합니다.

그런 다음 5마이크로리터의 phalloiden 원액을 200마이크로리터의 인산염 완충 식염수에 1% 소 혈청 알부민으로 희석하여 각 커버 슬립에 대한 염색 용액을 준비합니다. 그런 다음 커버 슬립에 염색 용액 200마이크로리터를 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 씻습니다.

그런 다음 200마이크로리터의 인산염 완충 식염수에 후크 3342 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 농도를 사용하여 30초 동안 DNA를 역염색합니다. 염색 후 400마이크로리터의 인산염 완충 식염수를 추가하여 커버 슬립을 두 번 세척합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 커버 슬립을 조심스럽게 들어 올리고 유리 슬라이드의 페이드 방지 장착 미디어 한 방울 위에 뒤집습니다.

티슈를 사용하여 여분의 매체를 부드럽게 제거한 다음 매니큐어로 주변을 밀봉합니다. 또한 세포 표백을 피하기 위해 현미경 검사 중에 세포가 너무 많은 염료에 노출되지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다. 0.4 마이크로몰 붓기 크기의 24웰 조직 배양 삽입물에서 종자 내피 세포.

그런 다음 세포가 분화된 단층을 형성하기 위해 방해받지 않고 5일 동안 배양액에서 자라도록 합니다. 이틀에 한 번씩 매체를 계속 바꾸십시오. 단층이 형성되면 상부 챔버에 1ml의 세포외 소포체에 50마이크로그램을 파종합니다.

그런 다음 로토민 덱스트란을 밀리리터당 20mg을 상단 웰에 넣고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 40마이크로리터의 배지 아보쿼트에서 형광 임무를 측정하여 형광 덱스트란이 웰 바닥으로의 이동을 모니터링합니다. 그런 다음 여기 파장을 544나노미터로, 방출 파장을 590나노미터로 프로그래밍하여 다중 라벨 마이크로 플레이트 리더를 사용할 수 있습니다.

혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 완전한 내피 배양 배지에서 내피 세포를 다시 현탁시키고 100 마이크로리터의 내피 세포 성장 배지에 96 웰 플레이트에 세포를 시딩합니다. 밀리리터당 0.1-10마이크로그램의 농도를 달성하려면 100마이크로리터의 항생제 함유 배지를 첨가하십시오.

이틀에 한 번씩 광학 현미경으로 20배 대물렌즈를 사용하여 세포의 생존력을 모니터링합니다. 10-14일 동안 세포를 계속 배양하고 세포 성장에 따라 2-3일마다 항생제 함유 배지를 교체합니다. 다음으로, 각 웰에 10마이크로리터의 MTS 시약을 추가하고 시약을 혼합합니다.

96웰 플레이트를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후 셰이커로 접시를 잠시 저어줍니다. 그런 다음 490나노미터의 플레이트 리더를 사용하여 처리된 세포와 처리되지 않은 세포의 흡수제를 읽습니다.

렌티바이러스 형질도입 하루 전, 내피 세포를 1ml의 완전한 배지에 파종합니다. 세포가 렌티바이러스 형질도입을 위한 50-80% 농도에 도달할 때까지 기다립니다.튜브를 열기 전에 렌티바이러스 현탁액을 200회 g에서 30초 동안 회전시켜 넘쳐나지 않도록 합니다. 그런 다음 hexidimethryn bromide를 세포에 추가하여 최종 농도인 밀리리터당 8마이크로그램으로 조정하고 플레이트를 부드럽게 소용

렌티바이러스를 세포에 첨가하고 플레이트를 30초 동안 부드럽게 휘젓어 적절한 혼합을 확인합니다. 렌티바이러스 형질도입 효율을 높이려면 실온에서 45분 동안 300배의 g으로 세포-바이러스 혼합물을 원심분리합니다. 그런 다음 세포-바이러스 혼합물을 밤새 섭씨 37도에서 배양합니다.

다음 날, 배지를 함유한 바이러스 입자를 버리고 예열된 신선하고 완전한 배양 배지로 교체하십시오. 둘째 날에는 퓨로마이신 선택을 시작합니다. 전체 배양 배지를 퓨로마이신 함유 배지로 교체합니다.

퓨로마이신 선택 후 세포를 수확합니다. 제조업체의 지침에 따라 RNA 분리 키트를 사용하여 세포에서 RNA를 분리합니다. 역전사 키트를 사용하여 선택한 micro-RNA로 보상적 DNA를 분리합니다.

그런 다음 정량적 PCR 반응을 설정합니다. 내피 세포에 의한 세포외 소포의 내부화를 모니터링하기 위해 PKH67 표지된 녹색 소포를 컨포칼 현미경을 사용하여 분석했습니다. 분석에서 염색이 각각 빨간색과 파란색으로 작용하는 faloudine 및 hookst 33342는 내피 세포 내부의 소포 전좌를 추적하는 데 사용됩니다.

얻어진 컨포칼 이미지는 4시간 후 내피 세포가 소포를 즉시 흡수할 수 있음을 보여줍니다. 다음으로, 로다민 b 이소티오시오데덱스트란의 내피세포 단층 확산 능력의 투과성을 연구하기 위해 분석하였다. 이 분석은 내피 세포에 밀리리터당 50 및 100 마이크로그램의 세포외 소포를 배양하면 2시간 후 내피 단층 투과성이 증가했음을 보여줍니다.

플롯에서 x축은 세포외 소포의 농도를 나타내고 y축은 590나노미터에서 판독된 내피 투과성의 접힘 변화를 나타냅니다. 다음으로, 퓨로마이신 처리로 내피 세포의 민감도를 결정하기 위해 사멸 곡선을 표시했습니다. 사멸 곡선은 퓨로마이신이 밀리리터당 0.15마이크로그램 미만이면 모든 세포를 죽이기에 충분하다는 것을 보여줍니다.

또한, 내피 세포에서 분리된 micro-RNA451a의 발현 수준을 확인하기 위해 실시간 정량 PCR을 수행했습니다. 막대 플롯은 가정부 유전자 U6에 대한 micro-RNA451a 전사체의 상당한 과발현을 보여줍니다. 개발 후 이 기술은 감염병 분야의 연구자들이 유전 물질의 전달을 통한 숙주 상호 작용 및 세포 통신에서 Evs의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 수용 세포의 EV 흡수를 시각화하는 방법과 내피 세포의 조절에서 RNA를 포함한 작은 기능을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

말라리아 기생충 및 인간의 혈액을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 실험복, 멸균 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.