Name: Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 배우세요 수정란 크로마틴 완화와 배아 발달 잠재력의 연관성을 zFRAP 기법으로 분석하는 방법을. 이 비침습 기술은 수정란이 전체 기간 발달할 수 있도록 하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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우리 감사 사토시 Kishigami, 사야카 와카야마, 히로 아키 Nagatomo, 사토시의 카 미 무라, 그리고가 나 Kishida 중요 한 의견 및 기술 지원 제공. 이 작품의 지;에 국립 대학 개혁을 승진 시키기를 위한 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 프로그램에 의해 부분적으로 투자 되었다 과학 (16 H 02593)의 승진, 아사 다 과학 재단과 T.W. 다케다 과학 재단에 대 한 일본 사회 Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

이 연구는 관심과 야마나시 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장 사항을 따라에서 수행 되었다. 프로토콜 야마나시 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (허가 번호: A24-50). 모든 수술 tribromoethanol 마 취하에 수행 했다 하 고 고통을 최소화 하기 위해 모든 노력 했다. 절차 및 타임 테이블의 그림된 개요는 각각 그림 1 및 표 1에 표시 됩니다.
1. 메신저 RNA (eGFP H2B mRNA의체 외에서 전사)의 준비
<ol><li>하지 의 30 U 템플릿 DNA pTOPO eGFP H2B3,7 의 5 µ g을 선형화 나 37 ° C에서 50 µ L에서 하룻밤.</li>
	<li>전기 이동 법에 의해 완전히 소화 여부 확인에 대 한 소화 DNA의 1.5 µ L를 수집 합니다.<ol>
<li>1.5 µ L와 소화 되지 않은 DNA 전기 이동 법 및 2 %agarose 젤의 우물에 염료를 각각, 로드의 3-5 µ L를 적용 합니다. 참고: 완전히 소화, 단일 밴드 (약 5 kb) 관찰 됩니다. 소화 되지 않은 DNA는 서로 다른 위치에 표시 되는 컨트롤으로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DdH2O의 151.5 µ L를 더하고 200 µ L 나머지를 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1)의 DNA를 소화.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구는 상쾌한 고 클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구는 상쾌한 고 20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트 및 ethachinmate의 1.5 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>100% 에탄올의 550 µ L을 추가 하 고 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nuclease 무료 물 8 µ L에서 침전 된 플라스 미드 DNA를 분해.</li>
	<li>플라스 미드 농도 평가 (예상된 농도 300-500 ng / µ L) 제조업체의 지시에 따라 nanodrop와 함께.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 총 반응 볼륨의 20 µ L에서 템플릿으로 eGFP H2B 1 µ g의 정제 DNA와 인코딩 mRNA 녹음 방송 생체 외에서 수행 합니다.<ol>
<li>녹음 방송 생체 외에서 후 물 36 μ를 추가한 다음 (로 하지 않고 폴 리 A) 전기 이동 법에 의해 분석에 대 한 합성된 mRNA의 56 µ L에서 1.5 µ L를 복구 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 합성된 mRNA를 100 µ L 반응 볼륨에 대 한 폴 리 A 미행을 수행 합니다.</li>
	<li>폴 리의 eGFP H2B 꼬리 mRNA 리튬 염화 물 해결책 강수량의 60 µ L을 추가 하 고 적극적으로 섞는다.<ol>
<li>30 분-30 ° C에 냉각 하십시오.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 분 동안 55 ° C에 난방에 의해 nuclease 무료 물 20 µ L와 펠 릿을 디졸브.</li>
	<li>Nanodrop와 침전 된 mRNA의 농도 평가 합니다. 사용까지 nuclease 무료 물과 저장소-80 ° C에서 500 ng / µ L를 희석.</li>
	<li>확인 기본 설정된 mRNA 생산; 제목/없이 mRNA의 1 µ L (얻은 1.8.1 1.12 단계, 각각) 폴 리 꼬리 0.1 mg/mL ethidium 평범한 사람의 1.5 µ L와 3 µ L 전기 이동 법 분석 샘플 로드 염료의 혼합. 적용 된 볼륨 5.5 µ L 이었다입니다. 참고: 폴 리 A 미행에 성공 하면 폴 리는 미행 없이 mRNA에 비해 이동된 밴드 관찰 해야 (그림 2A).</li>
</ol>2입니다. Vasectomized 남성 생쥐의 준비
<ol><li>ICR 남성 쥐 체중 규모를 사용 하 여 8-12 개월에 무게.</li>
	<li>0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취와 함께 남성 쥐를 주사 intraperitoneally. 참고: 마 취의 크기는 마우스의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어 마우스 무게 40 g tribromoethanol 마 취의 0.8 mL로 주사 된다.</li>
	<li>70% 에탄올과 베리 젖은.</li>
	<li>작은 베리에 (3-5 m m)를 잘라 이며가 위의 도움으로 근육 벽에 절 개를 확인 합니다. 참고:가 위, 집게 청소 되어야 한다 70% 에탄올과 수술을 시작 하기 전에.</li>
	<li>집게와 지방 패드를 살짝 밖으로 당겨. 그러면, 고환과 vas deferens 나타납니다. 참고: Vas deferens 는 U 자형 튜브와 빨간 혈관.</li>
	<li>수술 봉합 두 지점에서 vas deferens 에서 고 묶인된 점 사이의 중간 부분을 잘라.</li>
	<li>부드럽게 다시 지방 패드와 고환에 밀어 베리.<ol>
<li>나머지 고환으로 수술을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>외과 봉합과 두 개의 바늘으로 근육 벽에 바느질도 해요.</li>
</ol>3입니다. 시험관
<ol><li>8-10 주 오래 된 여성 B6D2F1 주사 7.5 IU 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG)와 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 46-50 h 간격에 intraperitoneally (BDF1) 쥐.</li>
	<li>Capacitation 및 수정을 1 일전 30 mm 접시에는 IVF에 대 한 300 µ L 인간의 튜 유체 (HTF)8 미디어의 방울을 준비 하 고 실험실 벤치에 미네랄 오일이 방울 커버 다음 하룻밤 인큐베이터에 preincubate.</li>
	<li>자 궁 경부 전위에 의해 성숙 된 남성 ICR 마우스를 희생. Cauda epididymis 27 G 바늘으로 해 부와 정자를 수집 합니다. 38 ° c.에 1-2 h HTF 미디어의 capacitation 300 µ L에 대 한 문화</li>
	<li>hCG 주사 후 16 h는 자 궁 경부 전위에 의해 슈퍼 ovulated 여성 쥐를 희생. 수 란 관 ampulla HTF 미디어 옆 미네랄 오일으로 전송 하 고 후 적 운 세포와 복잡 한 oocytes에서에서 그릴이 수 란 관 ampulla 30 G 바늘 preincubated 인공 HTF 매체에. 참고: 일부 여성 쥐 슈퍼 배 란 치료에도 불구 하 고 배 란 자주 표시 되지 않습니다. 확대 수 란 관 ampulla 배 란의 표시 이다입니다.</li>
	<li>Capacitation, 후 2-3 µ L capacitated 정자의 수정을 HTF 미디어 ovulated oocytes 수집 된로 전송 합니다.</li>
	<li>1 시간 후에 수정, 수정 란된 zygotes 수집 하 고 hyaluronidase CZB9 미디어에서 10 분 100 µ g/mL에서 그들을 치료. 참고: 수정을 제대로 수행 되 면 수정, 후 1 h 2nd 북극 시체와 함께 수정된 zygotes 관찰 된다. 또는 낮은 품질 정자를 사용 하는 경우 2차 극 체와 작은 zygotes만 관찰 된다. 또한, 많은 sperms 수정을 위해 사용 하는 경우 polyspermy 발생 합니다. 적절 한 인공 zygotes 남성과 여성 pronuclei로 이끌어 낸다. 이러한 기준을 사용 하 여 수정을 잘 되었는지를 찾아야 가능 하다.<ol>
<li>CZB 미디어에서 세척, 후 두 번째 극 시체 zygotes eGFP H2B mRNA와 microinjection를 주제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 준비 실 및 Microinjection의 펫
<ol><li>희석 RNA eGFP H2B nuclease 무료 물 250 ng / µ L의 농도를 사용 하 여 인코딩.</li>
	<li>PVP-HTF의 2-3 방울을 준비 및 eGFP H2B mRNA, 삭제 하 고 5-6 방울 Hepes 버퍼링 60 mm 접시에 드랍 스 CZB (H-CZB). 미네랄 오일이 방울을 커버. 참고: 이러한 준비는 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다. 공기 흐름을 층 류 캐비닛을 사용 하 여에 대 한 필요가 있다.</li>
	<li>Micropipette 끌어당기는 사람와 붕 규 산 유리를 끌어 (예를 들어, P = 500, 열 = 825, 풀 30, 벨 = = 120, 및 시간 = 200)</li>
	<li>중단 후 피 펫, 팁은 microforge를 사용 하 여 30 °의 주위에 가져온된 유리 microinjection 피 펫 팁 (−300 다시 µ m) 주변을 구 부.</li>
</ol>5입니다. microinjection
<ol><li>Micromanipulator mRNA 주입 중 한 피와 zygotes의 살인을 방지 하기 위해 무대에 플레이트 히터를 끕니다.</li>
	<li>워시와 HEPES 버퍼링 HTF에 주사 바늘의 내부 코트 10% 포함 된 PVP (PVP-HTF).</li>
	<li>2차 극 체 (그림 2B)와 수정된 zygotes 수집 하 고는 micromanipulator와 연결 된 현미경 단계의 상공에 20-25 zygotes 전송.</li>
	<li>도움말에서 붕 규 산 유리 모 세관으로 희석된 eGFP H2B mRNA를 채우십시오.</li>
	<li>들고 피 펫과 접합 자 누른 다음 zona pellucida 및 피에 조 드라이브 cytosolic 막 휴식.</li>
	<li>약 10 주사는 zygotes의 세포질에 mRNA의 pL. 더 이상 인큐베이터 밖에 zygotes 경작으로 인 한 피해를 방지 하기 위해 10 분 이내 mRNA-주입 완료. 참고: 사출 볼륨 2nd 극 몸 만큼 큰 해야 합니다. 주입 하는 mRNA의 양을 너무 크면, 모바일 분수에 영향을 미칠 수 있습니다 무료 eGFP H2B 분수 발생 가능 하다.</li>
	<li>microinjection, 후 10 분 이상 3 방울에 세척 하 고 zFRAP 분석까지 38 ° C에 CZB에 주입된 zygotes 문화.</li>
</ol>6입니다. zFRAP 분석
<ol><li>zFRAP 분석, 이전 1 h 레이저 confocal 현미경의 단계에 연결 된 핫 플레이트에 설정. 38 ° c.에 온도 설정</li>
	<li>위에 6-10 µ L HEPES 버퍼 CZB 미디어의 60 m m 유리 하단 접시에 미네랄 오일으로 덮여와 따뜻한 히터 zygote 컬렉션까지.</li>
	<li>8-수정 후 12 h, 수집 5-10 zygotes eGFP H2B 표현 및 전송의 6-10 µ L로 미리 예 열 HEPES 버퍼 CZB 중간 드롭. 참고: 인큐베이터 밖에 더 이상 경작을 피하기 위해, 5-10 eGFP H2B 표현 zygotes 각 분석에서 사용 되었다. 1 시간 이내 5 ~ 10 zygotes는 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 표백 및 이미징 조건을 설정 합니다. 경우는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (자료 테이블)는 아래와 같습니다.<ol>
<li>사용 오일 렌즈 X 60 (60 X 60 X 1.35 / 기름). 참고: 높은 배율 (높은 수 가늠 구멍) 쇼 높은 감도와 렌즈.</li>
		<li>스캐닝 속도 4.0 µs/픽셀 및 크기 "512" "수집 설정" (보충 그림 1)로 설정 합니다.</li>
		<li>증가 디지털 확대/축소 "5" (보충 그림 1). 참고: 높은 줌 초점 드리프트 발생 하거나 하지 여부를 인식 해야 합니다.</li>
		<li>염료 (보충 그림 1) 목록과 다음 선택 "EGFP"를 엽니다. 1.6 관측 시간 설정 s (간격 "무료 실행" 설정으로 설정 되어) (보충 그림 1) 참고: 더 많은 관찰 포인트 더 자세한 데이터를 하지만 그것은 또한 phototoxicity를 발생할 수 있습니다. ZFRAP 분석에서 1.6 s 관측 시간 chromatin 풀림의 부모의 비대칭을 감지 하기에 충분 한 것으로 보인다.</li>
		<li>총 (보충 그림 1)에서 12 그림의 수를 설정 합니다.</li>
		<li>"자극 설정" 패널을 시작 하 고 UseScanner에 "기본"을 클릭 합니다. 스캐닝 속도 10.0 µs/픽셀으로 설정 합니다. "시리즈에 활성화"를 클릭 하 고 설정 PreActivation "3 프레임" 및 활성화 시간으로 "5 초" (보충 그림 1).</li>
		<li>"포커스 x 2" 클릭 하 고 포커스를 설정 하 고 "중지".</li>
		<li>표백 및 이미징 레이저 전원 설정 (477 nm) 110 및 15 µW에 각각으로 조정 "게이지 전원 레이저" (보충 그림 1). 참고: 매우 강한 표백 정량 분석에 대 한 어려움을 일으키는 원인이 되는 더 큰 표백된 지역에 발생할 수 있습니다. 레이저 힘의 측정, 전력 측정기를 사용 합니다. 그것은 레이저 파워 레이저 힘의 시간 관련 저하의 효과 피하기 위해를 확인 하는 것이 중요입니다.</li>
		<li>자극 설정 패널에서 "클립 Rect" (보충 그림 1)를 클릭 합니다. (투자 수익; 빨강; 관심 영역을 설정 투자 수익 #1B) 40 x 40 픽셀 (7.6 μ m2). 준비 참조 영역 (REF; 녹색; 투자 수익 #2), 그리고 배경 (BG; 파랑; 투자 수익 #3)를 사용 하 여 "ROI 복사" 및 "ROI 붙여넣기" (마우스 오른쪽 클릭 버튼). 참고: 픽셀 크기는 커서가 ROI에 있을 때 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 호출할 수 있습니다 "ROI 관리자"를 통해 설정할 수 있습니다. 이후 그들은 zFRAP 점수의 분산을 표준화할 수 있습니다 나은 사람이 되도록 큰 ROIs 생각 된다. 그러나, ROI의 너무 큰 사용할 수 없습니다이 분석을 위해 그것은 어려운 핵소체 전조 몸 (일)을 방지 하기 때문에. 이 구획 eGFP H2B chromatin에서 자유를 생각 하 고 보여준 놀라운 높은 이동성3했다. 투자 수익 및 REF 영역 가능한 분리 되어야 한다. 이 두 영역은 긴밀, 표백 수 있습니다 또한 영향을 미칠 REF의 지역.</li>
		<li>도구 모음에서 "라이브"를 클릭 한 다음 "라이브 플롯" (보충 그림 1)을 시작 합니다. 참고: 라이브 작 각 ROI 내의 형광 신호 강도 나타냅니다 및 HV를 사용 하 여 레이저 파워를 조정 하기 위해 사용 됩니다. 투자 수익을 선택 하지 않으면 아무 강도 라이브 플롯 패널에 감지 것 참고.</li>
		<li>투자 수익 위치 결정 참고: 투자 수익 pronuclei의 원하는 위치로 드래그 하 여 이동할 수 있습니다. (1) 핵소체, 방지 하 고 (2)는 nucleoplasm에 전체 투자 수익 적합. 투자 수익에 핵 막 (세포질)의 영역 외부 영역을 포함 하지 않습니다. 쉽게 투자 수익 세포질 포함 여부 eGFP H2B의 형광을 찾을 수 있도록 eGFP H2B의 지역화는 매우는 nucleoplasm로 제한 됩니다. 남성 pronuclei 2차 극 체 근처 지역화 종종 여성 보다 더 큰이 어 경향이 있다. 이러한 기준을 사용 하 여, 하는 동안 남성 또는 여성 pronuclei 판단.</li>
		<li>"포커스 x 2" 클릭 (추가 그림 1)는 HV 파워 게이지 채널의 EGFP 위한 형광 강도 약 2000으로 조정 (형광 강도 "라이브 음모" 창에서 볼 수 있습니다).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"시간" 및 다음 "XY" (보충 그림 1) zFRAP 분석 시작을 클릭 합니다. 참고: "시간" 버튼 선택 적절 한 "t" "XY" 버튼에 표시 됩니다.<ol>
<li>클릭 "시리즈 완료" (보충 그림 1), FRAP 이미징 후 나타나는 "XY 버튼" 근처 고 FRAP 분석 데이터.</li>
		<li>"2D 이미지 보기 XXXXX" 의해 기본 명명 된 파일 (oib. 파일 형식)으로 "다른 이름으로 저장" 파일을 저장 (Ctrl + Shift + S 또한 사용할 수 있습니다).</li>
		<li>REF, 수익과 BG를 선택 하 고 다음을 클릭 합니다 (Ctrl + A 또한 사용할 수 있습니다) "2D 이미지 보기" 창에서 "시리즈의 분석".</li>
		<li>행 FRAP 데이터를 취득 하 고 "저장" 라이브 작 창에서 버튼을 클릭. 참고: 행 FRAP 양적 데이터를 csv 파일로 저장 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZFRAP 통제, 형광 관찰에서 효과 피하기 위해 유리 하단 접시의 가장자리에 가까이 있는 드롭에서 mRNA와 주입 zygotes의 일부를 넣어.</li>
</ol>7. 데이터 계산
<ol><li>사용 하는 동안 얻은 정량적 데이터 참조3,7 일부 수정 (참조 추가 하 고 아래 엑셀 파일)와 같이 "복구 곡선" 및 "모바일 분수" Excel에서 그래프를 확인 합니다.</li>
	<li>각 시간 지점에 대 한 12 그림에 투자 수익 및 REF의 BG의 값을 빼서 상대 강도 계산 합니다.</li>
	<li>심판의 투자 수익의 값을 나눕니다. 그 결과, 각 시간 지점에서 12 상대 강도 표준화 된 점수를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>3 이미지를 표백 하는 사진 전에 찍은 투자 수익에 대 한 상대 점수 평균을 계산 합니다.</li>
	<li>복구 속도 계산 합니다. 나누기 12 사진 (7.1.3에 획득) 표백 하기 전에 상대 점수의 평균 (7.1.2에서 획득) 각 시간 지점에서 촬영 한 이미지에 투자 수익에 대 한 상대 점수를 획득 합니다. 이 점수를 사용 하 여 복구 곡선 그리기 (그림 2E).</li>
	<li>표백 속도 계산 합니다. 참고: 표백 비율 (%) = 100-4번째 이미지의 복구 속도.</li>
	<li>다음과 같이10,,1112 에서 수식을 사용 하 여 모바일 분수 (MF) 계산 MF (%) = (끝점)-에서 12번째 복구 속도 4일 복구 속도 비율 × 100 표백 /.</li>
</ol>8. 배아 전송
<ol><li>8-12 개월 vasectomized 남성 ICR 마우스 배아 하룻밤 같은 장에 될 하 여 전송 하기 전에 밤에 성숙된 ICR 여성 친구.</li>
	<li>ZFRAP 분석 되었고 냉동 단계로 개발 결정 배아를 수집 합니다.</li>
	<li>0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취 또는 0.35-0.45 mL 배아 전송 전에 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol 혼합된 대리인의 intraperitoneally 여성 쥐를 주입. 참고: 마 취의 볼륨은 생쥐의 몸 무게에 의해 결정 됩니다. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g의 몸 무게; medetomidine/midazolam/butorphanol 에이전트 혼합: 몸 무게의 0.1 mL/10 g.<ol>
<li>0.5 일 게시물 coitum (dpc)에서 질 플러그 pseudopregnant 여성 ICR 생쥐의 oviducts에 이들 2 세포 단계 배아를 전송 합니다.</li>
		<li>배아 전송 후 37 ° C에서 설정 하는 그들이 깨어 때까지 히터에 여성 쥐를 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>18.5 dpc에서 대리 모 자 궁 경부 전위에 의해 희생 하 고 제왕 절 개에 의해 zFRAP 분석 zygotes에서 파생 된 새끼를 복구 합니다. 일부 복구 된 새끼 양 어머니에 게 전달 했다 고 그들의 몸 무게는 각 주를 평가 했다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 밝혀, zFRAP 분석 전체 용어 개발,이 방법은 분자 이벤트와 배아 발달 잠재력 사이 협회를 공개 하는 매우 유용한 도구 제안에 중요 한 손상을 발생 하지 않습니다. 그 세포의 차동 잠재력 된다 2 셀 단계 배아의 높은 ES 세포의 상태 처럼 2 셀으로 프로그래밍 하는 동안 chromatin 설사 변경으로 2 세포 단계 태아5와 비교 합니다. 따라서, zygotic chromatin 설사 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 하다는 것이 가능 하다. 체세포 핵 oocytes 보여준 아버지 pronuclei 뿐만 아니라 모성 pronuclei, 체세포 핵 이식 zygotes에서 인수 오픈 chromatin의 부족은 제안에 비해 낮은 chromatin 풀림의 세포질으로 전송 그들의 빈약한 발달 잠재력에 참여. ZFRAP 분석 elucidating 게놈 메커니즘을 프로그래밍 하는 데 유용할 것으로 보인다.
ZFRAP 시스템 높은 발달...

수정, 후 염색 질 구조를 동적으로 변경 하 고 zygotic 염색 질 구조는 다음 결국 설립된1,2. 아버지 pronuclei에이 기간 동안 지배적인 chromatin 단백질 히스톤으로 protamine에서 변경 됩니다. 결과 chromatin sperms와 몇 가지 포인트 (예, 히스톤 변형 구성, 히스톤 수정) 여성 oocytes에서 매우 다르다. 따라서, 형성된 zygotic chromatin 이후의 배아 발달에 대 한 중요 한 것으로 생각 된다. 그러나, 오랜 기간 동안 zygotic chromatin 구조의 세부 정보를 공개 하는 노력에 불구 하 고 방법을 zygotes의 품질을 평가 하거나 1 셀 단계에서 그들의 전체-용어 개발의 염색 질 구조를 분석 하 여 예측 하는 적 설립.
이전 연구에서 그것은 발견을 zygotes 매우 느슨하게 chromatin 구조3. 현재, chromatin 풀림 또는 개방 세포 분화 배아 줄기 (ES) 세포4잠재력에 대 한 중요 한 요소가 될 여겨진다. ES 세포 자연, 동질성을 전시 하지 않습니다 하지만 오히려 다른 유형의; ES 세포 식민지, 일부 정도 높은 감 별 법 잠재력 blastomeres 2 셀 단계 배아의 비교를 획득. 상태 처럼 2 셀으로이 전환 중 ES에서 chromatin 설사 2 세포 단계 태아5와 비교에 변화 세포. 따라서, chromatin 설사 세포질 감 별 법 잠재력과 그것은 가능한 광범위 하 게 chromatin zygotes에서 열리는 중요 한 것 zygotic 개발 잠재력의 평가 위해 유용 하는 것 같다.
라이브 영상 때문에이 메서드는 후속 개발 및도 전체 용어 개발6수 있습니다 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 라이브 이미징 방법 중 하나로 FRAP 분석 preimplantation 배아와 ES 세포3,,45chromatin 설사 검사를 사용 되었습니다. Zygotic chromatin 설사 FRAP 분석 개발 전체-용어에 해로운 효과 없이 분석할 수 있습니다, 만약 1 셀 단계에서 배아의 품질 평가 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 그러나,이 실험 방법으로 전체 용어 개발에 효과 있다 하지 조사 되었습니다. 최근, FRAP를 사용 하 여 zygotic chromatin 풀림을 평가 하는 실험 시스템 개발 되었다. 왜냐하면이 zygotes 위한 새로운 관측 시스템, 그것 zygotic FRAP (zFRAP) 되 나 했다. zFRAP 전체 용어 개발을 비판적으로 미치지 않았다 고 되었습니다 보고 다른 곳에서7. 이 보고서에서이 실험 방법의 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000은 FRAP 분석에도 사용할 수 있습니다(참조 #7)열</td></tr><tr><td>판</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매뉴필러</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pieze 마이크로 마이크로 매니퓰레이터</td><td>프라임 테크</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>35mm 배양 접시</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>35 x 100mm 스타일, IVF</td></tr><tr><td>60mm 배양 접시</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>60 x 15mm 스타일, 배아 배양</td></tr><tr><td>50mm 배양 접시</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>50 x 9mm 스타일, 무대 조작</td></tr><tr><td>50mm 유리 바닥 접시</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>50mm 접시, 27mm &phi, 구멍 크기, FRAP 분석 용</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>유기 spceiality 화학 물질</td><td>625071</td><td>유리 바닥 접시의 FRAP 분석용</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>IVF 및 배아 배양</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>마우스 접합자 처리용</td></tr><tr><td>붕규산 유리</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>mRNA</td></tr><tr><td>Micropipett 풀러의 미세 주입용</td><td>셔터 기기</td><td>P-97/IVF</td><td>주입 준비 또는 홀딩 니들(외측 직경: 80 & 마이크로; m, 내경 : 10 & 마이크로; m)&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로포지</td><td>&nbsp; Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 전사 키트</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>폴리(A) 테일링 키트</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>PVP 솔루션 10% (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HEPES 완충 HTF 함유 10%</td></tr><tr><td>PVP 나트륨 HEPES</td><td>시그마</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-H2B mRNA용 pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>템플릿 플라스미드 (참조 #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly 샘플 로딩 염료&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>체외에서 전사된 mRNA의 전기영동을 위해</td></tr><tr><td>페놀 클로로포름 이자밀 알코올</td><td>nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>nacalai tesque</td><td>&nbsp; 08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Not I</td><td>TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Otical 파워 미터</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&nbsp; 레이저 파워</td></tr><tr><td>입체 현미경</td><td>올림푸스</td><td>SZX16</td><td></td></tr> 용 파워 미터</tbody></table>

zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 chromatin 풀림에 대 한 분석

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

라이브 영상 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 최근, chromatin 풀림 또는 개방 만능 배아 줄기 세포의 세포질 감 별 법 잠재력에 포함 될 표시 되었습니다. 그것은 이전에 비해 알려졌다 배아 줄기 세포와 zygotes 항구 그들의 totipotency와의 연결을 제안 하는 매우 느슨하게 chromatin 구조를. 그러나, 지금까지 그것은 되지 해결 되었습니다이 매우 느슨하게/오픈 chromatin 구조 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 한 인지. 현재 연구에서이 가설을 시험 하는 실험 시스템 형광에 의해 분석 된 어떤 zygotes 사진 표백 후 복구 기간 어떤 뜻깊은 손상도 없이 개발할 수 있는 개발 되었다. 중요 한 것은,이 실험적인 시스템만 보온병 플레이트 히터 confocal 레이저 스캐닝 현미경 이외에 필요 합니다. 이 연구의 결과 분석 (FRAP) 분석 사진 표백 zygotic chromatin에서 분자 이벤트 전체 기간 개발에 대 한 중요 한 인지 조사를 사용할 수 있는 후 그 형광 복구를 좋습니다.

eGFP H2B zFRAP 분석
제대로 생산 mRNA eGFP-H2B, 미행 (그림 2A) 폴 리로 인 한 이동된 밴드 볼, 인코딩 수정 (그림 2B) 후 1-3 h 2 극 시체 zygotes의 세포질으로 주입 했다. 8 12 수정 후 h, 2 pronuclei eGFP H2B의 식을 보여주는 함께 zygotes 수집 하 고 zFRAP 분석 (그림 2C)를 받게 했다. 표백 및 복구 단계 FRAP 분석에 의하여 이루어져 있다. 미리 표백 단계에서 eGFP H2B의 신호 (그림 2D-1), 관찰 될 수 있었다 그러나 표백, 일단 ...

Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

이 zygotic FRAP 또는 zFRAP의 전반적인 목표는 zygotic chromatin looseness와 배아 발달 가능성 사이의 연관성을 조사하는 것입니다. 이 방법은 배아 발달과 같은 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석된 접합자가 심각한 손상 없이 만삭까지 발전할 수 있다는 것입니다.이 분석에 대한 실험 조건 설정 및 작동이 매우 복잡하기 때문에 zFRAP 분석 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 eGFP-H2B RNA를 준비한 후 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 마이크로리터당 250나노그램으로 희석합니다. 60mm 접시에 PVP-HTF 2-3방울, Hepes-buffered CZB 5-6방울, eGFP-H2B mRNA를 각각 2-3방울 떨어뜨립니다.그런 다음 미네랄 오일을 사용하여 방울을 덮습니다. 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리를 당깁니다. 팁을 부러뜨린 후 마이크로포지를 사용하여 유리 피펫을 약 30도로 구부립니다.미세주입 전에 mRNA 주입 중 접합자를 죽이는 것을 방지하기 위해 미세조작기 스테이지의 플레이트 히터가 꺼져 있는지 확인합니다. 그런 다음 10% PVP-HTF를 사용하여 주사 바늘 내부를 세척하고 코팅합니다. 다음으로 팁에서 희석된 eGFP-H2B mRNA로 유리 모세관을 채웁니다.두 번째 극성체로 수정된 접합자를 모으고 그 중 20-25개를 현미경 스테이지의 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 잡고 있는 피펫으로 접합자를 잡고 피에조 드라이브로 투명대와 세포질 막을 파괴합니다. 약 10피코리터의 mRNA를 각 접합자의 세포질에 주입합니다.인큐베이터 외부에서 접합자 배양으로 인한 손상을 방지하기 위해 10분 이내에 주입을 완료하십시오. 미세주입 10분 후 접합자를 CZB 3방울 이상으로 세척하고 FRAP 분석이 완료될 때까지 섭씨 38도에서 배양합니다. zFRAP 분석 1시간 전에 컨포칼 현미경의 스테이지에 부착된 레이저와 핫 플레이트를 켭니다.온도를 섭씨 38도로 설정합니다. 60mm 유리 바닥 접시에 6-10 마이크로 리터의 Hepes 완충 CZB 배지를 피펫으로 넣고 미네랄 오일로 덮습니다. 그런 다음 접합자가 수집될 때까지 히터에서 접시를 데웁니다.컨포칼 현미경으로 접합자를 쉽게 찾을 수 있도록 접시 중앙 전체에 방울을 놓는 것이 중요합니다. 수정 후 8-12시간 후에 5-10개의 eGFP-H2B 발현 접합자를 수집하여 6-10마이크로리터의 예열된 Hepes-buffered CZB 배지로 옮깁니다. 정확한 정량 분석을 수행하려면 접합자를 Hepes-buffered CZB 방울의 중심쪽으로 배치하는 것이 중요합니다.제조업체의 지침에 따라 표백 및 이미징 조건을 설정합니다. 예를 들어, 획득 설정에서 스캔 속도를 픽셀당 4마이크로초로 설정하고 크기를 512로 설정합니다. 디지털 줌을 5로 늘리고 DyeList를 엽니다."그런 다음 eGFP"를 선택합니다.그런 다음 관찰 시간을 1점 6초로 설정하고 사진 수를 12로 설정합니다.그런 다음 자극 설정"패널을 시작하고 UseScanner"에서 메인"을 클릭하고 스캔 속도를 픽셀당 10마이크로초로 설정합니다. 시리즈에서 활성화를 클릭하십시오."PreActivation"을 3 프레임으로 설정하고 활성화 시간을 5 초로 설정합니다. 그런 다음 Focus x2"를 클릭하고 Stop을 클릭합니다."자극 설정 패널에서 Clip Rect를 클릭합니다."ROI를 40 x 40 픽셀로 설정합니다.시간"및 XY"를 클릭한 다음 광 파워 미터를 사용하여 레이저 출력에 액세스합니다. 레이저를 측정할 때 조명을 끄는 것이 중요합니다. 레이저 게이지를 조정하여 표백 및 이미징 레이저 출력을 설정한 후 도구 모음에서 Live"를 클릭한 다음 Live Plot을 시작합니다."대물 렌즈에 오일을 놓습니다.챔버를 무대에 놓고 방울에서 접합자를 찾으십시오. 접합자를 찾은 후 Focus x2"를 클릭하여 ROI 위치를 결정한 다음 Live Plot" 창에서 eGFP" 채널 형광 강도에 대한 HV 전력 게이지를 약 2, 000으로 조정합니다. zFRAP 분석을 시작하려면 XY"FRAP 분석 후 시리즈 완료"FRAP 분석 데이터를 얻은 다음 다른 이름으로 저장을 클릭하여 파일 2D 뷰 이미지"를 기본 명명된 파일로 저장합니다.Copy"ROI 및 Paste"ROI를 사용하여 참조 영역과 배경을 각각 준비합니다. 그런 다음 ROI, REF 및 BG를 선택한 다음 2D View"이미지 창에서 Series Analysis"RoFRAP 데이터 획득을 클릭 한 다음 Live Plot"창에서 Save"버튼을 클릭합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터 계산을 수행합니다.수정 후 8-12시간 후에 eGFP-H2B"의 발현을 보이는 2개의 프로뉴클레아이가 있는 접합자를 채취하여 zFRAP 분석을 실시했습니다. 표백 후 eGFP-H2B 형광 신호의 강도는 핵질의 표백되지 않은 영역에서 ROI로 eGFP-H2B가 유입되어 약간 회복되었습니다. 회복 곡선은 수컷 pronucleai가 암컷 pronucleai보다 더 빨리 회복되고 더 많은 이동성 분획으로 회복됨을 보여줍니다.이러한 이미지와 그래프에서 볼 수 있듯이, zFRAP 분석 후 CZB 배지에서 접합자를 세척 및 배양한 후 심각한 손상 없이 배반포 단계까지 발달했습니다. 전체 만삭 발달을 분석하기 위해, 두 세포 단계의 배아를 유사 임신한 산모의 난관으로 이식했습니다. 이 표에서 보고된 바와 같이, zFRAP을 분석한 배아의 출생률은 경미했지만 온전한 배아보다 현저히 낮았으나 zFRAP이 없는 대조군과 같았습니다.또한 zFRAP을 분석한 접합자에서 파생된 새끼는 건강하고 완전히 발달한 것처럼 보였습니다. 이 절차를 시도하는 동안 다른 확장팩을 기다려야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 초점 드리프트를 피하기 위한 모든 예산 이의.이 비디오를 시청한 후에는 접합체에서 염색질 느슨함을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 배아 줄기 (ES) 세포에서 염색질 단백질 역학을 모니터 (플립) Photobleaching에서 형광 손실을 포함하여 photobleaching 방법을 설명합니다. 염색질 소성을 연구하는 방법 중 하나가 될 것으로 간주됩니다 염색질 단백질 역학은, pluripotent 세포 향상됩니다.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어...

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세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

고도로 압축된 유사분열 염색질의 축합의 분자 메커니즘은 잘못 정의되어 있습니다. 당사는 HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물에서 분리한 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 응축 과정을 충실하게 재구성하는 cell-free 분석을 제시합니다.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

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라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

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