Name: 사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: 학습하세요 포유류 세포에서 비표준 아미노산을 이용한 GPCR 사진-가교 매핑 및 바이오직교 표지 기법을 통해 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 수용체 생물학 이해에 필수적입니다.

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이 작품에서 CO822/2-1 (에 미 뇌터 프로그램) 및 CO822/3-1 I.C. 보조금 도이치 가운데 (DFG)에 의해 설립 되었습니다.

저자는 선언에 충돌이 있다.

프로토콜에는 포유류 세포에 표현 된 단백질으로 ncAAs의 설립에 대 한 직교 쌍의 효율성을 평가 하기 위해 간단 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과를 설명 합니다. FACS에 따라 널리 사용 되는 분석 실험에이 방법의 주요 장점은 동시 준비 및 샘플의 더 많은 수의 측정을 쉽게 일반 소프트웨어를 사용 하 여 분석 데이터를 제공 합니다. 포유류 세포에서 직교 쌍을 분석 하는 중간 처리 방법의 가용성은 새로운 직교 쌍의 개발과 기존의 것의 개선에 대 한 매우 중요 하다. 사실, 그건 큰 임의의 라이브러리와 죽은/살아 선택의 세대를 통해 직교 쌍의 감독된 진화 포유류 시스템에서 수행할 수 없습니다. 분석 결과 상대적으로 짧은 시간 내에 합리적인 실험적인 노력을 투자 하 여 상영 작은 크기의 라이브러리를 (회원의 수백) 수 있습니다. 이 분석 결과 통해 합리적으로 설계 된 tRNA 세트를 심사 하 여 우리 소설 tRNAs30pyrrolysine 시스템 효율성을 크게 향상을 생성할 수 있습니다....

단백질으로 화학 감지기의 유전 결합 구조와 동적 라이브 셀의 네이티브 컨텍스트에서 직접 단백질 기능 측면의 조사를 용이 하 게 하는 강력한 방법입니다. 요즘, 정식이 아닌 아미노산 (ncAAs) 가장 이질적인 화학 그룹으로 갖춰진 수백 수 있습니다 site-specifically 통합 단백질 생 합성1,2,,34. 서로 한 crosslinkers 사진5, 사진 갇힌6,7,,89 사진 전환 아미노산10, 등 사진에 민감한 ncAAs 발견 11, 아미노산 베어링 긴장 된 알 켄 및 촉매 무료 bioorthogonal 화학2,12,13,14,15,16 alkynes ,17, dansyl18,19coumarin9,및 prodan20,21 fluorophores, 운반 하는 아미노산 및 아미노산으로 다른 생물 프로브 장착 게시물 변환 수정1,2,3,4,22,23,,2425와 마찬가지로 잘.
유전자는 ncAA의 인코딩는 전용된 아미노-acyl-tRNA-합성 (AARS)는 동족 억압-tRNA, 일반 ribosomal 합성 중 황색 정지 codon에 번의 전미 대학 통합을 쌍으로 사용 됩니다. ncAARS/tRNA 쌍 호스트 유기 체, 즉 생 쌍 하지 잡담에에서 직교 수 있도록 설계 됩니다. 기술은 간결한 및 진 핵 호스트와 쉽게 적용 포유류 세포에서 잘 설립 이다. 포유류 세포에 있는 번의 전미 대학 설립에 대 한 쌍은 세 가지 주요 직교 시스템에 기반으로: B. stearothermophilus27 (Ec tyrosyl 호박 억압 대장균26 에서 TyrRS를 결합 하 여 tyrosyl 시스템 TyrRS /Bst참 마 쌍), 대장균 leucyl 시스템 (Ec그들/tRNA레이CUA 쌍)6,,1828 그리고 archaeal pyrrolysyl 시스템 (PylRS/tRNA Pyl 쌍)3, 그것에 의하여는 tRNAPyl 천연 호박 억압. 일반적으로, 각 ncAA 전문된 ncAARS에 의해 인식 된다. NcAA의 구조에 따라 일부 synthetases 이상의 ncAA를 받아들일 수 있지만 ncAARS TyrRS, 그들 또는 PylRS의 감독된 진화를 통해 얻어진 다.
직교 쌍 단순히 플라스 미드 벡터를 사용 하 여 셀에 가져오기 됩니다. 가장 일반적이 고 효율적인 플라스 미드는 bicistronic 하 고 모두는 합성 및 직교 쌍29를 형성 하는 tRNA를 인코딩합니다. 두 번째 플라스 미드 인코딩 수정에 대 한 지정 사이트에는 호박 codon 베어링 관심사의 단백질에 대 한 공동 transfected 이다. NcAA는 단순히 셀 성장 매체에 추가 됩니다. 그러나, 다른 전문된 그룹 종종 같은 ncAA의 설립에도 플라스 미드 구조물의 다른 이체를 사용합니다. 구문을 벡터은 합성 유형의 합성 유전자, 발기인 사용, tRNA와 tRNA 식 카세트의 수의 변종에 codon 사용법에 유전자의 배열에서 다르다. 또한, 다른 ncAAs의 관 효율 크게 다른 synthetases, tRNA, 및 다른 요인30의 품질의 다른 촉매 효율성으로 인해 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 손에 원하는 응용 프로그램에 대 한 가장 적합 한 시스템을 선택 하 고 전체 단백질 식이 개선 하는 몇 가지 최적화 단계를 수행 하는 직교 쌍의 효율성을 평가 하는 신속 하 고 안정적인 방법을 갖는 것이 중요 생성합니다.
우리는 간단 하 고 강력한 형광 기반 분석 결과 직교 쌍29 (그림 1)의 효율성을 평가 하기 위해 설립. 분석 결과, 세포는 플라스 미드 인코딩을 모두 허용 위치 (EGFP태그)에 황색 정지 codon를 베어링 녹색 형광 단백질에 대 한 인코딩 bicistronic 기자 플라스 미드와 직교 쌍에 대 한 공동 transfected와 mCherry 유전자입니다. 전체 세포 lysates의 빨강과 녹색 형광 96 잘 접시에서 플레이트 리더에 별도 채널에서 읽혀집니다. 빨간 형광의 강도 측정된 샘플 크기 transfection 효율의 직접적인 견적 제공 하는 반면 녹색 형광의 강도 직접 호박 억제의 효율성과 상관 한다. 형광에 따라 유사한 분석 실험에 관하여 보조 셀 정렬 (FACS) 읽기31,32, 밖으로 더 전체 세포 인구에 단백질 식의 즉각적이 고 포괄적인 평가 제공 하는 분석 결과 일반적인 실험 조건의 대표는 쉽게 데이터 수집 및 처리 표준 소프트웨어를 제공 합니다. 전반적으로, 분석 결과의 주요 장점은 샘플의 다 수 매체 동시에 분석할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 억압-tRNAs Pyl 직교 시스템30의 효율성을 개선 하기 위해 합리적으로 설계 된 도서관을 상영 했습니다. 이 작업 수행이 분석 결과 사진-가교 ncAA p-azido-L-페닐알라닌 (매)의 설립에 대 한 직교 쌍의 최적화와의 비교를 포함 하 여 그 응용 프로그램의 예를 보여을 실험 프로토콜을 설명 합니다. 다른 아미노산 (그림 2)의 법인 효율성
지난 년 동안 ncAA 도구 구조를 조사 하기 위해 매우 강력한 입증 된 및 기능적 측면의 G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs)33,34,35,,3637 , 38. 인간, GPCRs 막 수용 체 (800 명)의 대 가족을 형성 하 고 치료 약물에 대 한 주요 목표를 나타냅니다. GPCRs의 직접 구조 특성 아직도 도전 이며 보완적인 생 화 확 적인 방법 그들의 조사에 필요한 높은. 우리 사진 가교 ncAAs GPCR 표면 지도 ligand 바인딩 주머니34를 발견 하 고의 사용을 개척 했습니다. 체계적으로 라이브 포유류 세포에서 직접 GPCR의 전체 juxtamembrane 도메인에 걸쳐 매를 통합 매 관에 대 한 최적화 된 시스템을 사용 하 여, 우리. UV 조사에 따라 매를 covalently 이웃 분자 반응성이 매우 높은 nitrene 종 형성. 리간드를 시스템에 추가 될 때 매 근접 프로브는 수용 체의 위치는 바인딩된 ligand 가까이 서 공개를 제공 합니다. 이 방법에서는, Urocortin (Ucn1) 클래스 B GPCR corticotropin 풀어-팩터 수용 체에 입력 1 (CRF1R)33 neuropeptide 호르몬의 바인딩 모드 처음 공개 됐다. 최근에, 우리는 촉진제와38동일한 수용 체 길 항 근의 고유한 바인딩 패턴 공개는. 유사한 접근은 orthosteric와 다른 펩 티 드 및 다른 GPCRs39,40,,4142에 작은 분자 ligands의 allosteric 바인딩 사이트에 다른 사람에 의해 적용 되었다. 이 원고는 GPCR 표면 사진 가교 매핑에 대 한 우리의 실험실에서 적용 실험 프로토콜을 설명 합니다. 메서드는 비교적 빠르고, 간단 하 고 표준 생화학 실험실에 적용 되도록 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다. 중요 한 것은, 접근 제공 뿐만 아니라 ligand 바인딩 사이트 3D 구조 데이터 부족, 식별 뿐만 아니라 기존의 체 외에 데이터에 post-translationally 완전히 수정 된 수용 체에서 정보를 보완 하기 위해 유용한 도구는 살아있는 세포의 생리 적인 환경입니다.
소설 ncAAs 측면 체인 화학 그룹 초고속 촉매 무료 bioorthogonal 화학에 대 한 적합 한 베어링의 최근 개발은 단백질으로 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 마지막 세대 fluorophores 설치 가능성 열었다 라이브에 직접2,43세포. 이러한 화학 앵커 포함 긴장된 cyclooctyne SCOK14, BCNK12,17, bicyclo [6.1.0] nonyne 및 TCO에 트랜스-cyclooctenes * 다른 ncAAs 중 K13,,1517 norbornene16,17,44 또는 cyclopropene45,46 moiety 은닉. 일반적으로 PylRSAF 로 표시 하는 PylRS의 변형에 의해 부피가 ncAAs bioorthogonal 화학에 대 한 통합 (돌연변이 나타내는 Y271A와 Y349F M. barkeri PylRS에), 뿐만 아니라 다른 임시 진화 ncAARSs17 에 의해 , 44. bioorthogonal 앵커 tetrazine 시 약47 역 전자-수요 Diels 오리 나무 cycloaddition 몇 분43,48내 높은 라벨 수익률을 제공을 통해 반응. 그러나, 레이블을 GPCRs이 강력한 방법의 응용 프로그램 직교 ncAA 법인 시스템의 낮은 전반적인 효율성 때문 도전 하고있다. 우리의 향상 된 Pyl 시스템을 사용 하 여, 우리 최근 GPCRs 및 초고속 GPCR30라이브 포유류 세포 표면에 라벨에 같은 아미노산의 높은 수율 설립을 증명 하고있다. 레이블이 지정 된 수용 체 그들은 생리 적으로 길 항 제와 수용 체 활성화에 따라 내 면 여전히 작동 했다. Bioorthogonal의 설립에 대 한 실험 프로토콜 GPCRs로 고정 하 고 라벨 다음과 설명. 작은 밝은 fluorophores GPCRs 장비 고급 현미경 기술을 통해 라이브 셀에서 GPCR 구조 역학의 연구 향한 첫 기본 단계입니다.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>브롬페놀블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>칼 로스</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>카르보벤질옥시-L-라이신(리스(Z))</td><td>노바바이오켐</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>시클로옥틴-L-라이신(SCOK)</td><td>시켐</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>칼 로스</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>향상된 화학발광 시약(ECL)&nbsp;</td><td></td><td>0.1 M Tris-HCl pH 8.6에서 집에서 만든 10 mg / l luminol ; 1100 mg / l&nbsp; DMSO의 p-coumaric acid ; 30&nbsp; % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)</td>EDTA Carl Roth 8043.1 EGTA Carl Roth 3054.1 엔도-바이사이클로[6.1.0]노닌-L-라이신(BCNK)Sichem SC-8014 FBS 써모 피셔 (<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Gibco)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Carl Roth</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Applichem</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Carl Roth</td><td>0082.3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>p-Coumaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 막 Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>탈지 분유&nbsp;</td><td>시그마</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트 (SDS)</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>테트라진-Cy3</td><td>예나 바이오사이언</td>스 <td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)</td><td>칼 로스</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>트랜스 사이클로옥텐-L-라이신 (TCO*K)</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2.5%</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30%)</td><td>Merck</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td>세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 세포</td><td>독일 컬렉션 Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-305</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-635</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td><td>5 x 8 와트 튜브</td></tr><tr><td>플레이트 리더 BMG LABTECH FLUOstar Omega&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid</td><td>E2AziRS E2AziRS에 대한 휴민화된 유전자는</td> <td>human U6 promoter에 의해 구동되는 suppressor tRNA Bst-Yam의 탠덤 사본 4개와 PGK promoter에 의해 구동되는 Azi-tRNA synthetase(EAziRS)의 향상된 변이체에 대한 인간화 유전자 사본 1개를 포함하는</td> Geneart (Life Technologies)<td></td>Plasmid에 의해 합성되었습니다</tr><tr><td>POI-TAG 돌연변이 플라스미드</td><td></td><td></td><td>CMV 프로모터에 의해 구동되는 POI를 인코딩하는 플라스미드, 원하는 위치에 TAG 코돈을 지닌 FLAG 태그에 C-말단으로 융합&nbsp;</td></tr><tr><td>CRF1R-95TAG-EGFP</td><td></td><td></td><td>pcDNA3.1</td></tr><tr><td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td><td></td><td></td><td>의 MCS에서 복제</td></tr>됨 <tr><td>Genart (Life Technologies)</td><td></td>에 의해 합성된 pcDNA3.1<td>Arrestin3-FLAG</td>의 <td>MCS에서 복제됨 pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2 항체 결합체의</td> MCS에서 복제됨&nbsp;<td>시그마-알드리치</td><td>A8592&nbsp;</td><td>마우스 클론 M2에서 생산되는 단클론</td></tr><tr><td>염소-안티-토끼-HRP 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit-anti-CRF 항체</td><td>집에서 만든</td><td>PBL #rC69</td><td>다클론 Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr><tr><td>Rabbit-anti-Ucn1 항체</td><td>집에서 만든</td><td>PBL #5779</td><td>polyclonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999년)</td></tr></tbody></table>

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 bioorthogonal 화학 gpcrs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

호박 정지 codon 억제를 통해 정식이 아닌 아미노산 (ncAAs)의 유전 결합 인공 프로브 및 단백질에 반응 moieties 라이브 셀에 직접 설치 하는 강력한 기술입니다. 각 ncAA 호스트 유기 체로 가져온 전용된 직교 억압-tRNA/아미노-acyl-tRNA-합성 (AARS) 쌍으로 통합 됩니다. 다른 ncAAs의 관 효율 크게 다, 하 고 어떤 경우에 만족 될 수 있습니다. 직교 쌍은 AARS 또는 tRNA를 조작 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 그러나, tRNA 또는 AARS 큰 라이브러리를 사용 하 여 죽은/살아 선택 방법의 감독된 진화 되지 않습니다 가능한 포유류 세포에서. 여기, 손쉬운 고 강력한 형광 기반 분석 결과 직교 쌍 포유류 세포에서의 효율성을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 분석 결과 적당 한 노력으로 적절 한 시간 내 AARS/tRNA 변종의 수백 수만 심사 가능 Pyrrolysine 직교 시스템의 효율성을 크게 향상 시킬 새로운 tRNAs 생성 하는이 분석 결과의 사용 설명, G-단백질의 연구 ncAAs의 응용 프로그램과 함께 결합 수용 체 (GPCRs), 미식 축구에 대 한 개체에 도전 mutagenesis입니다. 첫째, 통합 하 여 체계적으로 수용 체의 세포 외 표면에 걸쳐 사진 가교 ncAA, 그대로 수용 체에 다른 ligands의 바인딩 사이트는 라이브 셀에 직접 매핑됩니다. 둘째는 GPCR에 마지막 세대 ncAAs를 통합 하 여 초고속 촉매 무료 수용 체는 형광 염료와 라벨 시연 되는 bioorthogonal 스트레인 승진 역 Diels 오리 나무 cycloaddition (SPIEDAC) 라이브 셀에 악용. NcAAs 크기에 독립적으로 어떤 단백질에 일반적으로 적용할 수 있는로 방법은 응용 프로그램의 수에 대 한 일반적인 관심의 이다. 또한, 번의 전미 대학 설립 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 쉽게 표준 생화학 실험실에서 수행 됩니다.

형광 분석 결과의 개요는 그림 1에 묘사 된다. 분석 결과 세 가지 응용 프로그램에서 채택 된다. 첫 번째 장소에서 tRNA 변종 Pyl 직교 쌍에 의해 Lys(Boc)의 설립에 대 한 수는 상영 된다. Lys(Boc)은 sterically Pyl 유사 아미노산. Pyl 상용으로, Lys(Boc)는 일반적으로 PylRS에 대 한 표준 기판으로 사용. tRNA를 기반으로하는 스크린된 tRNAsPyl. 각 tRNA 변형을 단일 기지 또는 루프에 합리적으로 tRNA 안정성과 진 핵 변환 기계와의 호환성을 개선 하도록 설계 된 줄기의 기본적인 쌍의 변이 맺는 다. 우리의 최근 작품30tRNA 디자인에 대 한 모든 세부 사항은 설명 합니다. 일반적인 결과 그림 2A에 설명 되어: 다른 tRNAs 줄 다른 억제 효...

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 포유류 세포에서 비표준 아미노산의 통합 속도를 향상시켜 단백질-단백질 상호 작용 표면 매핑 및 표면 수용체의 생체 직교 표지를 포함하여 살아있는 세포 환경에서 생물학적 문제를 해결하는 것입니다. 호박색 코돈 억제를 사용하여 서로 다른 비표준 아미노산이 서로 다른 효율로 통합됩니다. 우리는 포유류 세포의 non-canonical 아미노산 통합 속도를 짧은 시간 내에 쉽게 비교할 수 있도록 형광 분석을 확립했습니다.GPCR 표면을 통한 광가교결합, 비표준 아미노산의 체계적인 통합은 리간드 결합 부위의 매핑을 가능하게 하고 생명 세포에서 직접 흡입 수용체에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 생물직교 화학을 위해 마지막 세대의 비표준 아미노산을 통합함으로써, 당사는 살아있는 포유류 세포에서 고급 이미징 응용 분야를 위해 작고 밝은 형광단을 가진 GPCR의 부위 특이적이고 초고속 무촉매 라벨링을 달성합니다. 먼저, 600, 000 HEK 293 세포를 2개의 6웰 플레이트에 웰당 2밀리리터의 완전 성장 배지에 파종합니다.야생형 EGFP와 모의 transfected 샘플에 대해 각각 샘플 수와 2개의 추가 well을 준비합니다. 형질주입 1시간 전에 최종 아미노산 농도가 0.25 - 0.5 밀리몰이 되도록 새로 준비된 적절한 양의 비표준 아미노산 원액을 모든 웰에 첨가합니다. 세포를 transfection하려면 1마이크로그램의 플라스미드 DNA를 혼합하고 마이크로 원심분리기 튜브에서 1마이크로그램의 리포터 플라스미드 DNA와 함께 테스트할 synthetase t-RNA 쌍을 코딩합니다.별도의 튜브에서 EGFP wild type reference 및 mock transfection을 사용하여 동일한 transfection을 준비합니다. 다음으로, DNA가 들어 있는 각 튜브에 100마이크로리터의 젖산 완충 식염수를 추가합니다. 간단히 혼합한 후 PEI당 1마이크로그램 6마이크로리터를 첨가하고 각 튜브에 젖산 완충 식염수를 추가합니다.즉시 소용돌이치고 실온에서 10-15분 동안 배양합니다. 각 웰에서 400마이크로리터의 세포 배지를 DNA PEI 혼합물로 전달하여 pH를 중화합니다. 그런 다음 DNA 혼합물을 세포에 떨어뜨립니다.배지를 흡인하고 2ml의 예열된 PBS로 세포를 한 번 헹궈 transfection 후 48시간 후에 세포를 수확합니다. 0.5 밀리몰 EDTA가 보충된 800마이크로리터

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 채용함으로써, 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 효율성의 픽셀 수준의지도 게이 oligomeric 단지를 형성하기 위해 가상 막 수용체를 표현하는 세포를 얻을 수있다. 효율성의지도 걱정부터, 우리는 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 정보를 추정 할 수 있습니다.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

이 기사는 유전자 코드 확장(GCE) 부위 특이적 표지를 사용하여 살모넬라균 분비 이펙터에 라벨을 붙이고 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 이미지화하는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공합니다...

유전자 코드 확장을 이용한 박테리아 분비 단백질의 초고해상도 이미징

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

이 연구는 HEK293T 세포에서 빛 유도 유전자 발현을 최적화하기 위해 3D 프린팅 LED 어레이를 사용하는 고처리량 실험 방법을 설명합니다.

포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

학습하세요 포유류 세포에서 비표준 아미노산을 이용한 GPCR 사진-가교 매핑 및 바이오직교 표지 기법을 통해 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 수용체 생물학 이해에 필수적입니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

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