사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

이 방법은 함부르크 초고속 이미징 센터(Hamburg Center for Ultrafast Imaging)에서 조사한 바와 같이 핵형성 시점, 결정 성장 메커니즘 또는 나노/마이크로 결정을 준비하는 방법과 같은 단백질 결정화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시료 진화를 실시간으로 모니터링하여 다양한 결정화 단계에서 용액 내 입자의 방사형 분포와 같은 귀중한 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 단백질 미결정화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 고전적인 결정학에 사용되는 단백질이나 중성자 회절에 사용되는 큰 단백질 결정의 성장에도 사용할 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 고유한 결정화 장치의 작동 원리를 보여주기 때문에 중요합니다. 먼저 2미크론 멸균 주사기 필터를 사용하여 16ml의 1.2몰 주석산나트륨 용액과 16ml의 증류수를 여과합니다. 침전제와 물병에 여과된 용액 5ml를 채웁니다.

그런 다음 실험실의 펌프 홀더에 병을 장착합니다. 소프트웨어 창에서 온도가 섭씨 20도, 상대 습도가 20도, 물을 용매로 사용하여 실험 매개변수를 설정합니다. 실험 실험실의 전면 도어를 열고 커버슬립 캐리어를 제거합니다.

깨끗하고 실리콘으로 처리된 커버슬립을 캐리어에 놓고 장치에 다시 넣습니다. 환경 조건을 확보하기 위해 실험실을 닫습니다. 텍스트 프로토콜에 있는 주요 펌프 특성을 사용하여 Pump Zero를 켜고 물줄기를 생성합니다.

지정된 조정 나사를 수동으로 작동하여 커버슬립 중앙을 향한 위치를 조준하여 물줄기를 조정합니다. Pump Zero를 끈 다음 Pump One을 켜고 이전과 같이 액체 흐름을 생성합니다. 펌프 1의 스트림 위치를 펌프 제로에 대해 고정된 위치로 조정합니다.

Pump One을 끈 후 결정화 실험을 위해 사용한 커버슬립을 새롭고 깨끗한 커버슬립으로 교체하십시오. 소프트웨어 패키지를 사용하여 새 실험 파일을 만듭니다. 실험 파일에서 단백질을 Thaumatococcus daniellii의 Thaumatin으로 입력합니다. 단백질 농도는 밀리리터당 14mg, 침전물은 주석산나트륨, 침전제 농도는 1.2몰입니다.

이 정보를 활성화하기 위해 새 실험 파일을 로드한 후 Pump Zero를 사용하여 작은 물방울을 추가하여 단백질 방울의 위치를 표시합니다. Tara' 버튼을 눌러 마이크로 저울을 영점 조정하십시오. 실험 챔버의 상단 뚜껑을 열고 물 랜드마크에 8마이크로리터의 타우마틴 용액을 피펫으로 삐걱

새로운 Thaumatin 드롭을 등록하려면 먼저 New Drop'을 클릭하여 실험 파일의 초기 조건을 지정합니다. 그런 다음 Constant' 버튼을 클릭하여 물방울에서 물의 자연 증발을 보상합니다. CCD 카메라를 사용하여 Pump Zero가 단백질 드롭을 조준하고 있는지 확인합니다.

물줄기가 낙하 바깥쪽을 향하고 있는 경우 펌프 제로의 위치를 다시 조정하십시오. DLS 레이저를 켜고 조정 나사를 사용하여 수동으로 레이저 빔을 단백질 방울에 넣습니다. 측정 시간이 60초, 두 측정 사이의 대기 시간이 10초, 측정 횟수가 300인 DLS 매개변수를 입력합니다.

시작 버튼을 클릭하여 DLS 측정을 시작합니다. DLS 그래픽 표현 중 하나를 선택하여 샘플의 품질을 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 일정 테이블에 증발 단계에 대한 조건을 입력합니다.

그런 다음 Automation' 버튼을 클릭하여 샘플 증발 단계를 활성화합니다. 샘플 증발 단계가 완료되면 중지' 버튼을 클릭합니다. 물방울의 무게를 일정하게 유지하려면 상수 버튼을 활성화하십시오.

이 기능은 자연 시료 증발의 사태를 보상하고 추가 조치가 취해질 때까지 농도 변경이 발생하지 않도록 합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 일정 테이블에 침전제 첨가 단계에 대한 조건을 입력합니다. Automation' 버튼을 클릭하여 precipitant addition step을 활성화합니다.

시간 경과에 따른 결정화 액적의 진화를 추적하려면 CCD 카메라를 사용하여 Thaumatin 결정의 모양을 확인하십시오. DLS 그래픽 표현을 사용하여 입자 크기 분포를 확인합니다. 또한 디스플레이 창을 사용하여 중량 및 실험 매개변수의 변화를 확인합니다.

이 창에 표시되는 모든 정보는 결정화 중 중량 변화를 기반으로 실시간으로 계산되고 표시되며, 이는 초고감도 저울에 의해 온라인으로 기록됩니다. 플레이트에 파라핀 오일 3ml를 추가하여 깨끗한 표준 Terasaki 플레이트를 코팅합니다. 오일이 72개의 웰을 모두 덮도록 플레이트를 다른 각도로 부드럽게 움직여 플레이트 웰에 파라핀 오일을 분배합니다.

접시에 떠 있는 기름을 부어 여분의 파라핀 오일을 제거합니다. 중지' 버튼을 클릭하여 결정화 실험을 마칩니다. 결정화 액적이 들어있는 샘플 캐리어를 조심스럽게 꺼냅니다.

피펫을 사용하여 결정화 방울의 2 마이크로 리터 aloquots를 Terasaki 플레이트의 웰에 놓습니다. 오일 하의 플레이트에서 결정화 방울을 복구함으로써 현미경 또는 Terasaki 플레이트와 함께 작동하는 기타 diolist 기술을 사용하여 샘플의 결정 성장 안정성을 주기적으로 확인할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 단량체 단백질에서 핵, 나노 결정 및 미세 결정의 형성을 향한 전체 결정화 과정 동안 단백질 방울의 입자 크기 성장을 보여주는 반경 플롯 분포입니다.

여기서 플롯은 계산된 단백질 농도 및 침전물 농도와 함께 단백질 방울의 무게에 대한 시간 경과에 따른 변화를 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 실험이 끝날 때 Thaumatin 미세결정의 기록된 사진입니다. 물방울은 단백질 용액에 포화된 매우 풍부한 양의 작은 미세 결정을 보여줍니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 1시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 마이크로투징 시스템의 DLS 레이저를 단백질 방울로 조정하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단백질 샘플을 성공적으로 결정화하기 위해 이 결정화 장치를 쉽게 다루는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 방법은 결정화 액적에 직접 결합되는 in situ dynamic light scattering 때문에 가능합니다. 이를 통해 반경 분포의 모든 변화를 모니터링할 수 있으므로 결정화 또는 단백질 침전에 대한 특정 분포 패턴을 정확히 찾아낼 수 있습니다. 이 절차에 따라 초저온 전자 현미경 또는 전자 회절과 같은 다른 방법을 적용하여 추가 질문에 답하고 용액 내 마이크로미터 미만 크기의 입자의 결정 상태를 확인할 수 있습니다.

이 기술의 의미는 핵형성의 2단계 이론으로 확장되는데, DLS 맵은 결정 성장 전에 용액 내 입자의 두 배 크기 분포에 대한 명확한 패턴을 보여주기 때문입니다.