Name: 사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 학습하세요 단백질 결정화를 위한 자동화 장치와 현장 동적 산란(DLS)을 활용한 실시간 모니터링 방법을. 이 기술은 핵 생성과 결정 성장을 정밀하게 제어하여 다양한 크기의 단백질 결정을 생산할 수 있습니다.

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저자는 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램을 통해 BMBF 그랜트 05K16GUA는 "The 함부르크 센터에 대 한 초고속 지원과 마리 퀴리 Sklodowska 약어" X-프로브 "부여 계약 번호 637295에서 자금 인정 이미징-구조, 역학 및 제어 물질의 원자 규모에서 "우수 클러스터 도이치 가운데 (DFG)의.

참고: 전체 프로토콜을 통해 물의 추가 위해 사용 되는 마이크로-복용량 시스템 것입니다 라고 하 Pump0 비례적의 추가 위해 사용 되는 마이크로-복용량 시스템 Pump1 라는 것입니다. 이 실험의 결과 추가 논의 되며 THM2_micro 결정 하 라고.
1. 매개 변수 및 솔루션 설치
<ol><li>16 mL 나 주석산 솔루션 (1.2 M) 및 16 mL 증류수 0.2 µ m 무 균 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 참고: 없음-주석산 솔루션을 결정 화 실험에 대 한 precipitant 솔루션을 나타냅니다.</li>
	<li>필터링된 솔루션의 5 mL을 채울 비례적 및 물 병. 참고: 병 5 mL의 최대 용량을가지고.</li>
	<li>실험 챔버의 펌프 소지자에 병을 탑재 합니다.</li>
	<li>실험적인 매개 변수 창에서에서 설정 소프트웨어는 다음 값으로: 온도 20 ° C, 상대 습도 20, 및 물 용 매에서. 참고: 그림 2 는 디스플레이 창 사용자 온도, 상대 습도, 용 매 등 각 매개 변수에 대 한 올바른 값을 삽입할 수 있습니다. 소프트웨어 창 또한 첨가제 등의 몇 가지 추가 매개 변수를 표시합니다. 이것은 단지 실험에 대 한 중요 한 첨가제는 precipitant 솔루션 에입니다.</li>
	<li>실험 챔버의 현관 문을 열고 coverslip 캐리어를 제거 합니다.</li>
	<li>캐리어에 깨끗 하 고 시 coverslip 놓고 장치에 다시 배치 합니다. 참고:는 coverslip 2.2 c m의 크기는.</li>
	<li>1.4 단계에서 환경 조건을 확보 하기 위해 실험 챔버를 닫습니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>2. 마이크로-복용량 시스템 조정
<ol><li>에 Pump0 전환 주를 사용 하 여 그림 3 에 특성을 펌프 하 고 물 스트림을 만들. 참고: 물 스트림 궤도 조정 될 수 있는 몇 가지 펌프 특성 기반으로 생성 됩니다. 그림 3 주요 펌프 특성 및이 실험을 위해 사용 해야 하는 최적의 값을 보여 줍니다.</li>
	<li>수동으로 지정 된 조정 나사를 운영 하 여는 coverslip의 중심을 향해 위치를 목표로 물 흐름을 조정 합니다. Pump0에서 전환 합니다.</li>
	<li>에 Pump1 전환 하 고 이전 단계 2.1에에서 일 액체 스트림을 생성 합니다. Pump0에 대 한 고정 위치 쪽으로 Pump1의 스트림 위치를 조정 합니다. Pump1에서 전환 합니다.</li>
	<li>새로운 사용된 coverslip를 장착 하 고 결정 화 실험 한 청소. 참고: 부드러운 잎사귀는 일반적으로 이전에 결정 화 실험에 사용 되 고 잔여 먼지에서 새로운 coverslip 청소를 위해 권장 됩니다.</li>
</ol>3. 실험 실에서 Thaumatin 드롭 설정
<ol><li>소프트웨어 패키지를 사용 하 여 새로운 실험 파일을 만듭니다. 실험 파일에 다음 정보를 입력: ( Thaumatococcus daniellii-thaumatin), 단백질 농도 (14 mg/mL), 비례적 (Na-주석산) 단백질과 precipitant 농도 (1.2 M). 참고:이 정보는 비례적 및 단백질 농도 결정 실험 중의 자동된 계산에 대 한 될 것입니다.</li>
	<li>모든 단계의 정보를 3.1 활성화에 있는 새로운 실험 파일을 로드 합니다.</li>
	<li>Pump0를 사용 하 여 작은 물 방울을 추가 하 여 단백질 방울의 위치를 표시 합니다. 참고: 목표는 단백질 샘플 배치 됩니다 랜드마크 역할을 하는 작은 물방울을 만드는 것입니다.</li>
	<li>0는 중량에 의해 주어진 무게를 설정 하려면 자체 버튼을 누릅니다. 참고:이 coverslip의 무게와 단계 3.3에서에서 만든 작은 물 랜드마크에 의해 추가 된 여분의 무게를 제거 합니다.</li>
	<li>실험 챔버의 상단 뚜껑을 열고 물 랜드마크에 thaumatin 솔루션의 8 µ L 플라스틱.</li>
	<li>다음 명령을 수행 하 여 새로운 thaumatin 드롭 등록.<ol>
<li>뉴 드롭 실험 파일에서 초기 조건 속성 버튼을 누릅니다.</li>
		<li>Const 는 작은 물방울에서 물의 자연 증발을 보상 하기 위해 버튼을 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pump0 단백질 드롭에서 목표로 하는 경우 CCD 카메라와 함께 확인 하십시오. 물 흐름이 방울 밖에 서 목표로 하는 경우 Pump0의 위치를 재조정. 참고:이 순간 이후부터 단백질 방울 유지 됩니다 일정 무게에 자동된 물 추가 단백질 방울에서 자연 물 증발에 대 한 보상에 의해. 온도 및 상대 습도 같은 다른 매개 변수 뿐 아니라 단백질 물방울의 무게 표시 창을 사용 하 여 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 실험 여기 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. DL 측정 현장에서
<ol><li>스위치에 에 DL 레이저 수동으로 조정 나사를 사용 하 여 단백질 드롭에서 레이저 광선을 배치.</li>
	<li>다음 DL 매개 변수 입력: 측정 기간 (60 s), 두 측정 사이의 대기 시간 (10 s), 및 측정 (300)의 수. 참고: 먼저 30 측정 단백질 안정성 확인에 대 한 기준 측정 될 것입니다. 측정의 나머지 결정 화 과정의 전체 길이 중 단백질 방울의 전체 조사 될 것입니다.</li>
	<li>DLS 측정을 시작 하려면 시작 단추를 누릅니다. DL 그래픽 표현 중 하나를 선택 하 여 샘플의 품질을 확인 하십시오. 참고: 샘플 솔루션에 모든 집계 없이 모노-dispersity 높은 수준의 표시 해야 합니다. DLS 결과 표시 하 고로 읽을 수: 반경 배급, 반경 히스토그램, 반경 줄거리, 요약, 또는 카운트 속도 강도 대 한 개요로 측정.</li>
</ol>5. 샘플 증발 단계
<ol><li>표 1에 표시 된 데이터를 사용 하 여 일정 테이블 에 증발 단계에 대 한 조건을 입력 합니다. 참고: 기호 "-" 열에 도입 "몰/비율" 두 번째 행에는 손실을 나타냅니다 물의 단백질 방울에서 값 "25" 의미 물방울 볼륨 25%의 감소를 겪게 될 것 이다. 즉,는 물방울의 단백질 농도 25% 증가 합니다.</li>
	<li>Autom버튼을 눌러 샘플 증발 단계를 활성화 합니다. 샘플 증발 단계 끝나면 중지 단추를 누릅니다.</li>
	<li>Const 드롭 샘플 증발을 중지 한 후 지속적인 유지 버튼을 활성화 합니다.</li>
</ol>6. precipitant 추가 단계
<ol><li>표 2에서 제공 하는 데이터를 사용 하 여 그림 4 에 나와 있는 일정 테이블 에 precipitant 추가 단계에 대 한 조건을 입력 합니다. 참고: 테이블의 첫 번째 행은 소프트웨어 계산 비례적 단백질 방울에 추가 되는 금액에 따라 단백질 방울의 자연 증발 속도 보정 단계를 나타냅니다. 소프트웨어이 값이이 연산의 고 자동으로 Pump0에 대 한 총격 사건 주파수를 조정 하 여 자동으로 다음 precipitant 추가 단계에 대 한 물 증발을 보상 하기 위하여.</li>
	<li>Precipitant 추가 단계 Autom버튼을 눌러 활성화 합니다. 참고: 비례적 추가 일정 테이블에서 입력 다음과 같은 자동화 된 프로세스입니다.</li>
</ol>7. 시간이 지남에 따라 결정 화 방울의 진화를 추적
<ol><li>CCD 카메라를 사용 하 여 thaumatin 결정의 모양을 확인 합니다.</li>
	<li>DL 그래픽 표현을 사용 하 여 입자 크기 분포를 확인 하십시오.</li>
	<li>표시 창을 사용 하 여 무게와 실험적인 매개 변수의 진화를 확인 합니다. 참고: 나 주석산 솔루션에 도달 하면 0.74 M의 농도에 단백질 드롭 드롭릿에 풍부한 thaumatin 마이크로-크리스탈 그림 7에서 보이는 것과 같이 된다.</li>
</ol>8입니다. 결정 화 방울의 복구
<ol><li>파라핀 기름 깨끗 한 표준 Terasaki 플레이트 코트.<ol>
<li>플레이트에 파라핀 오일의 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>부드럽게 기름 접시의 모든 72 웰 스 커버를 다른 각도에서 접시를 이동 하 여 격판덮개 우물에 파라핀 오일 분산.</li>
		<li>밖으로 접시에 기름 붓는 여 파라핀 오일의 과잉을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결정 화 실험을 완료 중지 버튼을 누릅니다. 신중 하 게 결정 화 방울을 포함 하는 샘플 캐리어를 꺼내.</li>
	<li>피 펫의 사용으로 결정 화 방울의 2 µ L aliquots의 볼륨 Terasaki 격판덮개의 우물에 놓습니다. 참고: 오일 아래 접시에 결정 화 방울, 복구 하 여 샘플 수 주기적으로 검사 안정성과 현미경 또는 표준 Terasaki 격판덮개로 작동 하는 다른 DL 기술을의 사용 하 여 결정 성장.</li>
</ol>

<ol><li>Xtal Concepts GmbH, Germany . Patent "Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation". , EP 2 588 649 (11754824.8) and US 9,284,659 B2 (2010).</li>
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</ol>

이로써 작가 아르네 메이어, Karsten 더크 스, 및 기독교 Betzel Xtal 개념 GmbH, 프로듀서 XtalController900 기술 회사의 주주가 선언 합니다.

결정 화 장치 모니터링 하 고 수정 된 증기 확산 방법에 따라 결정 화 실험 동안 중요 한 매개 변수를 조작 하는 설계 되었습니다. 이 기술은 수 모니터링 하 고 사용자가 정확한 지식과 결정 화 단계 다이어그램을 통해 단백질 해결책의 제어를 사용 하는 모든 단계에서 단백질 결정 화 실험 점수 기반 현장에서 DL 분석 샘플 현 탁 액.
결정 화 장치 구성 실험 챔버 (그림 1)가 결정 화 방울의 실시간 모니터링을 허용 하는 CCD 카메라에 연결 됩니다. 카메라는 약 2.5 µ m의 최대 해상도 제공 하는 다른 확대 렌즈를 장착 하는 현미경에 적응. 실험 챔버의 핵심은 시간이 지남에 샘플 무게의 진화를 추적 하기 위한 磁 중량. 결정 화 절차 앉아 드롭 증기 확산 실험, 단백질 드롭은 중량에 시 coverslip에 배치 되는 위치에 해당 합니다. 중량 시간이 지남에 단백질과 비례적 농도의 즉시 계산 알고리즘을 정확 하 게 입력을 제공 precipitant 뿐만 아니라, 물/첨가제 추가, 또는 샘플 증발에 의해 발생 하는 작은 물방울의 무게 변화에 따라 . 또한, 중요 한 결정 화 온도 및 상대 습도 같은 매개 변수는 정확 하 게 모니터링 하 고 제어.
결정 화 실험을 수행 하기 위해 장치는 비례적와 물 또한 picoliter 규모에서 작동 (무료 압 전 펌프 문의) 두 마이크로 복용량 시스템을 갖추고 있습니다. 그런 적은 양의 물질을 사용 하 여 농도 기울기 및 단백질 방울 내의 대류 현상이 최소화 됩니다. 압 전 펌프의 주요 역할은 비례적 또는 물, 예를 들면 단백질 방울의 자연 증발에 대 한 보상으로 사용 되 고 후자. 마이크로-복용량 시스템 물질의 추가 지시할 수 있는 기능 집합이 있다. 같은 기능을 포함: 물질, 작은 물방울의 수 초, 너비 및 높이 물질 스트림 궤적 등의 추가 추가 하기 위한 반복 속도. 또한, 펌프의 위치 수 수동으로 조정할 수, 단백질 방울으로 물질의 추가 대 한 정확한 위치를 사용자를 사용.
결정 화 방울의 독특한 피드백 제어 조작 전체 실험 절차 동안 단백질 oligomeric 상태에서 가능한 한 변화를 보여줄 수 있는 DL 데이터 제자리에 의해 이루어집니다. 기술은 입자 크기 분포, 시간이 지남에 따라서 알 수 없는 단백질 관련 메커니즘을 드러내는의 지속적인 평가 허용 한다. DLS 광학 장비 허용 하는 coverslip 통과 고 제자리에서 패션; 단백질 방울을 통해 추가 검출기 및 레이저 빔 coverslip 영역 아래 전략적으로 배치 따라서,는 물방울 내에서 변경 내용만 DL 경로에서 기록 됩니다. 쉬운 취급을 허용 하려면 장치는 2 개의 구멍:는 사용자 마이크로 복용량 시스템의 촬영 위치를 조정할 수는 coverslip 및 제거 될 수 있는 최고 뚜껑의 최적의 위치 뿐 아니라 새로운 단백질 dro 정확도 설정에 대 한 정문 에 coverslip plet입니다.
위에서 언급 한 장치를 사용 하 여 대화형 결정 화 방법 단백질 결정의 크기 제어 생산에 대 한 신뢰할 수 있는 기술입니다. 많은 결정 화 방법이 현재 사용할 수 있지만, 내부는 결정 화에 대 한 정보 자체 메커니즘이 아니다 쉽게 달성. 일반적으로, 기존의 결정 화 방법을 적용 결정 화 단계 다이어그램의 실험 시작 되 면 그 과정을 변경만 몇 가지 가능성에 제한 된 제어를 솔루션의 수 있습니다. 결정 화를 수행 하는 동안 실험 하 고 지식의 거래 단계 다이어그램의 전환에 대 한 얻은 제자리에서 DL, 좋은 함께 이러한 자동된 결정 화 기술을 적용. 일반적으로 비정 질 침전 하 고 균질 nucleation 유도 지역 단계 다이어그램에서 서로 가까이 됩니다. 따라서, 그것의 입자 분포에 대 한 실시간 정보에 따라 결정 화 방울의 과정을 조작 하 여 그것은 점차 nucleation 쪽으로 결정 화 조건을 조정 하 여 단백질의 강 수를 피할 수 및 크리스탈 형성입니다.
요즘, 많은 결정 화 조건에는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 유도체는 광범위 하 게 존재 하는 precipitant 솔루션 포함 됩니다. 이러한 화합물은 보통 pipetting 또는 분배에 대 한 어려움을가지고 수 있는 점도 있다. 현재 사례 연구에서 precipitant 분배에 사용 되는 마이크로-복용량 시스템 picolitre 증가의 추가 가능 하 게 매우 얇은 모 세관을 적용 합니다. 결과적으로, 높은 점성 물질 작업에 몇 가지 제한이 있습니다. 지난 실험의 시리즈 내에서 시스템 다음 말뚝에서 파생 된을 사용 하 여 긍정적인 결과 부여 하고있다: PEG200 50%, PEG3000, PEG6000 20% 10%, PEG800010%. 지금까지 언급 한 솔루션만 테스트 했다, 비록 마이크로 복용량 시스템 솔루션의 점성을 줄이기 위하여 이용 될 수 있는 특별 한 난방 장치를 포함. 또 다른 요인은 단백질 precipitant로 사용 하는 경우 고려해 야 할 소금 솔루션입니다. 작은 금액 precipitant 추가; 동안 마이크로 정량 펌프의 피상적인 차단 일으키는 마이크로 복용량 시스템의 노즐에서 구체화 수 농축된 염을 작업할 때 경우에 매우 높은 상대 습도 실험 챔버에 존재 합니다. 이 문제를 해결 하려면 실험을 보류 노즐에서 소금을 제거 될 수 있도록 해야 합니다. 이 특수 처리가 필요할 수 있습니다 그리고 precipitant 추가 단계에서 오류를 생성할 수 있습니다.
이러한 자동화 된 결정 화 실험을 수행할 때 얻을 수 있는 귀중 한 정보를 바탕으로,이 기술은 확장할 수 있습니다 또한 단백질 결정의 물리 화학 측면을 조사 연구 하. Nucleation 및 크리스탈 성장 반응 속도 파생 하 고 온도, 입자 크기, 그리고 단백질의 성장 실험에서 묘사 하는 시간-의존 정보에 기반 하 고 precipitant를 계산 수 있는 키네틱 현상 농도입니다.

지난 몇 년 동안 성장 단백질 마이크로 포커스 및 나노의 직렬 펨 결정학 (SFX)의 지속적인 개발으로 특히 단백질 결정학 커뮤니티의 관심을 점령 했다. 나노 포즈 같은 결정 정지의 준비에 수요가 높은 관련성의 되고있다 및 소설 엑스레이의 광채로 인해 방사선 및 생산의 단백질 마이크로-지금까지 얻은 성공적인 결과에 따라 2 , 3. 작은 크리스탈 크기-범위 때문에 자유 전자 레이저 (XFELs) 데이터 수집 및 실험 beamtime의 한정 된 가용성에 필요한, 데이터 수집 전에 샘플 특성은 필수적입니다. 단백질 마이크로-또는 nanocrystal 정지 하는 가장 일반적인 기술 지금 전자 현미경과 x 선 분말 회절까지 있습니다.
지금까지 몇 가지 방법은 작은 마이크로미터 범위에서 크기와 단백질 결정의 대량 양을 생성 하는 목적으로 일반적인 결정 화 방법에서 적응 되어 있다. 일괄 처리 메서드는 집중 고 샘플 솔루션 nanocrystallization 선호4수도 높은 포화 단계에 따라서 강제로 precipitant 솔루션의 빠른 혼합을 위해 사용 됩니다. 다른 방법은 분쇄 하는 데 사용할 데이터 컬렉션5nanocrystalline 정지로 봉사 할 수 있는 크리스탈 슬러리를 형성 하기 위하여 큰 단백질 결정을 포함 합니다. 그러나, 결과 발생할 수 있습니다 때때로 감소 회절 품질 악화 결정 낮은 내부 순서 대로. Nanocrystallization 무료 인터페이스 확산에 따라은 또한 사용 가능한 대안, 어디 단백질 해결책 농축된 precipitant 솔루션3작은 금액에 추가 됩니다. 그러나, 모든 기술 중에서 가장 효율적인 방법을 일괄 결정 화 기술과 더 많은 혁신적인 속임수 앉아 방울6에 증기 확산 방법을 사용 하 여 것 처럼.
일반적으로, 단백질의 결정 화에 대 한 에너지 배리어는 nucleation-크리스탈 형성의 첫 번째 열역학 단계를 지원 하기 위해 교차 해야 합니다. 열역학으로 안정 된 상태에서과 포화 단백질 해결책을 이동 하기 위하여 그리고 마지막으로 상전이 유도, 단백질 해결책에 관련 된 몇 가지 변수 수정할 수 있습니다. 이러한 변수는 일반적으로 환경 변화 단백질 용액의 농도 (예., 온도, 습도), 용 매 특성 (예를들면, pH, 이온 강도), 농도 및 버퍼 속성, 등7 ,8 샘플 매개 변수를 변경할 수 있습니다에 대 한 개요는 대개 단계 다이어그램, 용 해도 다이어그램, nucleation 단계 다이어그램 등 더욱 상세한 프레 젠 테이 션의 다른 모드를 허용 하는 의하여 표현 대 한 설명 3 차원 또는 더 복잡 한 다이어그램 고려8,,910으로 올 수 있다. 주요 변수는 다른 매개 변수의 기능으로 단백질 농도 동안 나머지 매개 변수 상수6,11단계 다이어그램의 가장 매력적인 종류는 일반적으로 2 차원. 하나 또는 몇 가지 핵 형성 되 면 더 큰 결정 대량 솔루션에서 추가적인 단백질을 취 함으로써 성장할 수 있습니다. 마이크로-및 nanocrystal 생산 목표로, 같은 기존의 결정 화 접근 가능한 솔루션에 존재 하는 결정의 작은 수 때문에 더 이상 않습니다. Nanocrystalline 정지는 보통 부자가 되려면 결정 요소에 따라서 결정 화 통로 재조정 될 nucleation 이벤트 샘플에 존재의 맥시 마는 그런 있다. 결과이 단백질, 또한 아직 되지 않은 완전히 이해12,13지금 미개척된 nucleation 경로까지 새로운, 일부 조사를 요구 한다. 앞에서 설명한 단계 다이어그램 기본을 바탕으로, 고전 이론 확장 되었습니다 새로운 가설 nucleation 2 단계 메커니즘으로 설명 되어: 처음에, 더 높은 단백질 농도 전환 일어난다 (조밀한 액체 단계) 및 두 번째, 더 높은 내부 순서 (격자 구조와 크리스털 핵)14,15,16밀도 풍부한 단계에서 전환. 단백질 결정 화는 많은 요인, 그리고 따라서 결정 화 조리법 다른 크기의 결정 결과를 재정리는 때 조리법 수 없습니다 항상 의존 이전 지식. 새로운 통찰력을 각 개별 단백질 대상에 대 한 설정 필요: 버퍼 구성, 순도, 단백질 용 해도, 등의 샘플, 정확한 지식의 안정성의 조정.
동적 산란 분석 및 크기-다양 한 조사 수 입자 인 단백질 결정 화 공정의 최적화에 대 한 기초가 튼튼한 방법입니다 오늘: 나노 및 작은 microcrystals 단위체 단백질에서. 방법을 악용 솔루션에서 입자 브라운 모션을 받아야 하 고이 운동의 평균 속도 매체 및 입자 형상의 점성에 의해 입자의 크기, 그들의 열 에너지에 의해 결정 됩니다. 처음에, 액체 매체는 레이저의 사용으로 일관 된 광원에 의해 조명입니다. 입자에 의해 흩어져 빛 간섭 패턴을 형성 합니다. 입자 영구 모션에서 때문에 간섭 패턴 변경 영구적으로 됩니다. 때 특정 방향에서 찾고, 강도 변화를 관찰할 수 있습니다. 이러한 변동 지금 브라운 모션으로 인 한 입자 움직임을 보이고 있다. 측정된 농도 변동에서 자기 상관 함수 (ACF) 계산 됩니다. 피 오의 분석 및 스톡-아인슈타인 방정식을 사용 하 여 입자의 속도 분포 (더 정확 하 게 확산 계수)에 대 한 측정값을 줄 것 이다, 입자 반경 유통17로 변환 됩니다. 다양 한 간행물 및도 서18,19DLS 기능 및 작동 원리와 관련 된 추가 정보를 찾을 수 있습니다.
여기 우리가 적용 하 고 독특한 자동된 결정 화 장치, XtalController900, XtalController 기술6, 정확 하 게 상호 작용 단백질 결정 화 실험 모니터링에 대 한 개발의 업그레이드 된 버전을 설명. 이 기술은 높은 식별 및 실시간 nucleation 이벤트의 추적, 결정 화 단계 다이어그램을 통해 정확한 기동 시키기 허용에 대 한 잠재적인 보여줍니다. 이 특정 결정 절차의 목표는 고품질 단백질 마이크로-및 나노 마이크로 초점을 맞춘 싱크 로트 론 엑스레이 근원, 전자 회절, 활용 하는 응용 프로그램에 대 한 적합 한 단백질 결정 화를 최적화 하거나 SFX입니다.

<table><tbody><tr><td>Thaumatococcus daniellii의 Thaumatin</td>, <td></td>프로토콜 Bis-Tris 14880 <td>Sigma-Aldrich</td><td>1002365940</td></tr><tr><td></td><td></td><td>2302377</td><td>단백질 용액 용 완충액</td></tr><tr><td>: 주석산 나트륨 이수화물</td><td>AppliChem</td><td>A0451,0500</td><td>단백질 용액 용 침전제</td></tr><tr><td>: Siliconized coverslips</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1051203</td><td>결정화를 위한 커버슬립</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Starstedt</td><td>831826001</td><td>필터 기공 0.2 &마이크로; m</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Omnifix</td><td>4617207V</td><td>Luer Lock Solo 20mL</td></tr><tr><td>파라핀 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2323842</td><td>플레이트 코팅용 오일</td></tr><tr><td>표준 Terakasi 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5812270EA</td><td>결정화 액적 회수용</td></tr><tr><td>플레이트 소프트 와이프</td><td>KIMTECH Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XtalController900</td><td>Xtal-Concepts GmbH</td><td>XTC900</td><td>결정화 장치</td></tr></tbody></table>

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

자동화 된 결정 화 장치는 특히 nucleation 및 단백질 결정의 결정 성장으로 원하는 크기를 정확 하 게 기동 하는 목적으로 단백질 결정 화 실험 모니터링 용으로 개발 된 특허 기술1 . 샘플 조사에서 현장에서 동적 빛 분산 (DLS) 제어 결정 화 기반 모든 시각적인 변화는 작은 물방울은 전체 활성화 CCD 카메라를 결합 하는 현미경의 도움으로 온라인 모니터링 하는 동안 결정의 모든 단계 동안 단백질 방울의 조사. 전체 실험 통해 DL 측정 현장에서 의 사용 새로운 단계-결정 핵의 형성에 전환 높은 포화 단백질 해결책의 정확한 식별 수 있습니다. 단백질 nucleation 단계를 식별 하 여 결정 화 단백질 microcrystals의 생산에 큰 단백질 결정에서 최적화 수 있습니다. Precipitant 또한, 물이 증발 유도 높은 포화에 대 한 정확한 자동된 단계를 기반으로 하는 접근 둔화에 대 한 샘플 희석 유도 균질 nucleation 실험 프로토콜 대화형 결정 화 보여줍니다 또는 상전이 반전 하 고

결정 화 실험 기간 동안 DL 측정 하 여 얻은 결과 결과 시간이 지남에 개발 하는 두 주요 입자 분포 분수에 유체 입자 반지름의 상세한 진화를 보여줍니다. 실험의 첫 번째 부분에는 샘플은 천천히 증발, 높은 단백질 농도 달성 하기 위하여. 그림 5B같이 단백질 드롭 19.5 mg/mL에 14 mg/mL에서 집중 했다. 이 시간 동안, 그림 5A, radius 배포 패턴에 따라 단백질에서는 단위체 동작 솔루션 일정 한 입자 크기의 약 2.5 nm. 샘플은 더 이상 증발 되 고, 단위체 단백질 변성 또는 샘플 집계의 어떤 표시 없이 솔루션에서 안정적인 남아 있습니다.
단백질 드롭 precipitant 솔루션의 추가 즉시 샘플 증발 후에 시작 하 고 더 나은 시각화 (그림 5)에 대 한 radius 배포 패턴 및 균형 곡선에 회색으로 강조 표시 됩니다. 샘플 중량에서 파생 된 계산을 기반으로, 강조 표시 된 입자 분수 크리스탈 nucleation, 약 200-400 nm의 반지름 크기 결과의 개시에 기인 된다. (Nucleation 라고도 함)이이 현상은 실험 하 고 비례적의 개시에 약 23 분의 개시에서 약 66 분의 기간에 단백질 방울에 0.6 M의 precipitant 농도에서 시작 됩니다. 또한입니다. Precipitant 증가의 농도, 반경 배포 솔루션에서 입자의 광범위 한 배포를 보여 줍니다. 더 많은 핵 형성, 결정 초기 엔터티 800-1300 nm 사이의 radius 분포에 도달 하는 크기에서 성장 하 고. 그것은이 단계에서 결정 핵 성장, 계속 고 단백질 분수 가난한으로 단백질 분자는 찍은 업 microcrystals에 의해 점차 종결 될 수 있다. 단백질 드롭에서 precipitant 농도 천천히 증가, microcrystals의 형성은 때 radius 분포 500 및 1, 500 nm 사이 개발 하 고 쉽게 75 분 후 식별 됩니다. Radius 유통의 진화 또한 CCD 카메라 이미지, 어디 단백질 microcrystals 솔루션 (그림 7)에서 0.7 M의 precipitant 농도에서 볼 수 있습니다 의해 확인 된다. Precipitant 추가 완료 되 고 결정 화 방울 일정 하 게 유지 됩니다, 반경 배포 nucleation 이벤트의 일부 시간이 지남에 따라 감소 하는 동안 1, 000와 3000 nm 사이의 주된 단계를 표시 합니다. 이 순간, 결정 화 방울은 완전히 microcrystals 포화 그리고 더 nucleation 이벤트가 없습니다는 솔루션에 존재.
피드백 데이터는 중량에 의해 주어진 실험적인 입력으로 사용 하 여, 결정 화 단계 도표는 thaumatin 결정 화 과정의 포괄적인 이해를 위해 그려 했다. 그림 6, 실험 단계 다이어그램 thaumatin T. danielli microcrystals의 생산 THM_2 마이크로 결정 (프로토콜)으로 표시 됩니다 3 개의 독립적인 결정 화 실험을 보여줍니다. 두 가지 추가 결정 화 실험 레이블된 THM_1 매크로 결정 및 THM_3 매크로-크리스탈으로 사용 되었습니다 단계 도표에 다른 분야의 올바른 매핑을 하려면 데이터를 입력 (예., 가용성 또는 준 지역). 이후이 실험에 대 한 프로토콜 다른 결정 경로 따라, 따라서 더 정확 하 고 쉽게, nucleation 지역 식별이 된다. 각 실험에 대 한 결정 화 경로 강조 표시 됩니다 다른 접근을 강조 하는 주문 번호와 회색 화살표 대표 최종 단백질의 추정 하는 동안 특정 결과 대 한 사용 된 결정 화 단계 크리스탈 성장 uptakes 단백질 분자 형성의 잘 정의 된 솔루션에서 안정적인 단백질 결정 때 농도.
그림 6 에 제시 하는 3 개의 thaumatin 실험 nucleation 영역을 입력할 때 다른 정보를 표시 하 고 그것으로 따라서 다른 최종 결정 결과 단계 다이어그램 아래 사진에서 볼 수 있습니다. THM1 및 THM3, 단백질 해결책 nucleation 단계를 전달 하 고 재입력 한다 지역, 어디 결정 형태까지 달려있다. 따라서, 실험 어머니 주류에 의해 포위 하는 큰, 잘 정의 된 모양의 크리스탈 리드. 그러나, THM2_micro-크리스탈, 프로토콜 섹션에서 제시 하는 실험에 대 한 결정 화 경로 특정 접근을 다음과 같습니다. 이전 섹션에서 우리는 microcrystals에 게 샘플을 단백질 해결책 있다는 nucleation 위상에 깊은 nucleation 이벤트 최대 속도로 형성할 수 있도록 말 하였다. THM2_micro-크리스탈의 경우 precipitant 농도 단백질의 비율이 조정 되었습니다 같은 패션에 샘플 뿐만 아니라 nucleation 지역을 입력 하지만,는 비례적 추가 단백질 해결책에 추가 되는 조건에 이동 하지 않습니다 단계 도표에 다른 지역의 하지만 nucleation 지역 내에서 높은 포화 상태에 남아 있습니다. 결과적으로, 솔루션의 엔트로피 감소 크게으로 단백질 방울 즉시 작은 결정 엔터티와의 포화 된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig1.jpg"> 그림 1입니다. 결정 화 실험의 도식 대표. 그리기 자동된 결정 화 실험 수행에 필요한 모든 기술 부분 결정 화 실험 챔버의 개요를 보여줍니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57070/57070fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig2.jpg"> 그림 2: DL에 대 한 소프트웨어 창 및 결정 화 실험에 대 한 관련 된 예제 매개 변수. 매개 변수는 온도, 상대 습도, 점도 등을 포함합니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig3.jpg"> 그림 3: 결정 화 실험에 관련 된 마이크로 복용량 시스템 소프트웨어 제어 창. 기능 방울 또는 솔루션 스트림을 생성에 대 한 특정 매개 변수 조정을 허용합니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig4.jpg"> 그림 4: 결정 화 단계는 실험에 관련 된 설명 일정 테이블에 대 한 소프트웨어 창. 결정 화 방울의 초기 조건 또한이 창에 통합 됩니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig5.jpg"> 그림 5입니다. Thaumatin T. daniellii microcrystals 생산의 개요. (A) 전체 결정 화 과정에서 단백질 드롭에서 입자 크기의 반경 배포. (B) 실험 매개 변수 모니터 드 개요. 음모는 계산된 단백질 농도 (빨간 곡선) 및 precipitant 농도 (파란색 곡선) 단백질 방울 (검은색 곡선)의 무게에 대 한 시간이 지남에 진화를 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57070/57070fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig6.jpg"> 그림 6: 결과 결과 함께 T. danielli thaumatin에 대 한 실험 결정 화 단계 다이어그램. 모든 음모는 중량에 의해 주어진 피드백 정보에 따라 실험 데이터에서 파생 됩니다. 괄호 사이 표시 되는 숫자 각 실험에 순서와 단계 결정 프로토콜 중 수를 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57070/57070fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig7.jpg"> 그림 7: THM2_Micro-크리스탈 (프로토콜) microcrystals 솔루션에서 포화의 풍부한 번호에 대 한 기록된 사진. 그림 4 h (240 분)에서 결정 화에 대 한 실험 실에서 단백질 방울을 설정한 후 찍은. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57070/57070fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig8.jpg"> 그림 8: THM_1 매크로 결정 안정적인 솔루션에 몇 가지 큰 thaumatin 결정을 보여주는 대 한 기록된 사진. 그림 결정 화에 대 한 실험 실에서 단백질 드롭릿 설정 후 20 h 찍은. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57070/57070fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57070/57070fig9.jpg"> 그림 9: THM_3 매크로 결정 솔루션에서 thaumatin 결정의 다양 한 크기를 보여주는 대 한 기록된 사진. 그림 결정 화에 대 한 실험 실에서 단백질 드롭릿 설정 후 20 h 찍은. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57070/57070fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>물질</td>
			<td>몰/비율</td>
			<td>시간 (s)</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td>-25</td>
			<td>2100</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td>0</td>
			<td>2100</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 샘플 증발에 대 한 자동화 된 일정 입력 thaumatin microcrystals의 생산에서 단계.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>물질</td>
			<td>몰/비율</td>
			<td>시간 (s)</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>prec</td>
			<td>0.8</td>
			<td>1800</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td>0</td>
			<td>18000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: precipitant 추가 대 한 자동화 된 일정 입력 단계 thaumatin의 생산에서 microcrystals.

여기 선물이 단백질 microcrystals의 제어 생산을 위한 프로토콜. 프로세스의 여러 결정 화 매개 변수 제어 조작 수 있도록 자동화 된 장치를 사용 합니다. 단백질 결정 화는 수행-아웃 모니터링 및 결정 화 방울 입자의 반경 분포를 조사 하는 동안 결정 화 솔루션의 제어 및 자동화 된 추가 의해.

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

이 방법은 함부르크 초고속 이미징 센터(Hamburg Center for Ultrafast Imaging)에서 조사한 바와 같이 핵형성 시점, 결정 성장 메커니즘 또는 나노/마이크로 결정을 준비하는 방법과 같은 단백질 결정화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시료 진화를 실시간으로 모니터링하여 다양한 결정화 단계에서 용액 내 입자의 방사형 분포와 같은 귀중한 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 단백질 미결정화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 고전적인 결정학에 사용되는 단백질이나 중성자 회절에 사용되는 큰 단백질 결정의 성장에도 사용할 수 있습니다.이 방법의 시각적 시연은 고유한 결정화 장치의 작동 원리를 보여주기 때문에 중요합니다. 먼저 2미크론 멸균 주사기 필터를 사용하여 16ml의 1.2몰 주석산나트륨 용액과 16ml의 증류수를 여과합니다. 침전제와 물병에 여과된 용액 5ml를 채웁니다.그런 다음 실험실의 펌프 홀더에 병을 장착합니다. 소프트웨어 창에서 온도가 섭씨 20도, 상대 습도가 20도, 물을 용매로 사용하여 실험 매개변수를 설정합니다. 실험 실험실의 전면 도어를 열고 커버슬립 캐리어를 제거합니다.깨끗하고 실리콘으로 처리된 커버슬립을 캐리어에 놓고 장치에 다시 넣습니다. 환경 조건을 확보하기 위해 실험실을 닫습니다. 텍스트 프로토콜에 있는 주요 펌프 특성을 사용하여 Pump Zero를 켜고 물줄기를 생성합니다.지정된 조정 나사를 수동으로 작동하여 커버슬립 중앙을 향한 위치를 조준하여 물줄기를 조정합니다. Pump Zero를 끈 다음 Pump One을 켜고 이전과 같이 액체 흐름을 생성합니다. 펌프 1의 스트림 위치를 펌프 제로에 대해 고정된 위치로 조정합니다.Pump One을 끈 후 결정화 실험을 위해 사용한 커버슬립을 새롭고 깨끗한 커버슬립으로 교체하십시오. 소프트웨어 패키지를 사용하여 새 실험 파일을 만듭니다. 실험 파일에서 단백질을 Thaumatococcus daniellii의 Thaumatin으로 입력합니다. 단백질 농도는 밀리리터당 14mg, 침전물은 주석산나트륨, 침전제 농도는 1.2몰입니다.이 정보를 활성화하기 위해 새 실험 파일을 로드한 후 Pump Zero를 사용하여 작은 물방울을 추가하여 단백질 방울의 위치를 표시합니다. Tara' 버튼을 눌러 마이크로 저울을 영점 조정하십시오. 실험 챔버의 상단 뚜껑을 열고 물 랜드마크에 8마이크로리터의 타우마틴 용액을 피펫으로 삐걱거립니다.새로운 Thaumatin 드롭을 등록하려면 먼저 New Drop'을 클릭하여 실험 파일의 초기 조건을 지정합니다. 그런 다음 Constant' 버튼을 클릭하여 물방울에서 물의 자연 증발을 보상합니다. CCD 카메라를 사용하여 Pump Zero가 단백질 드롭을 조준하고 있는지 확인합니다.물줄기가 낙하 바깥쪽을 향하고 있는 경우 펌프 제로의 위치를 다시 조정하십시오. DLS 레이저를 켜고 조정 나사를 사용하여 수동으로 레이저 빔을 단백질 방울에 넣습니다. 측정 시간이 60초, 두 측정 사이의 대기 시간이 10초, 측정 횟수가 300인 DLS 매개변수를 입력합니다.시작 버튼을 클릭하여 DLS 측정을 시작합니다. DLS 그래픽 표현 중 하나를 선택하여 샘플의 품질을 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 일정 테이블에 증발 단계에 대한 조건을 입력합니다.그런 다음 Automation' 버튼을 클릭하여 샘플 증발 단계를 활성화합니다. 샘플 증발 단계가 완료되면 중지' 버튼을 클릭합니다. 물방울의 무게를 일정하게 유지하려면 상수 버튼을 활성화하십시오.이 기능은 자연 시료 증발의 사태를 보상하고 추가 조치가 취해질 때까지 농도 변경이 발생하지 않도록 합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 일정 테이블에 침전제 첨가 단계에 대한 조건을 입력합니다. Automation' 버튼을 클릭하여 precipitant addition step을 활성화합니다.시간 경과에 따른 결정화 액적의 진화를 추적하려면 CCD 카메라를 사용하여 Thaumatin 결정의 모양을 확인하십시오. DLS 그래픽 표현을 사용하여 입자 크기 분포를 확인합니다. 또한 디스플레이 창을 사용하여 중량 및 실험 매개변수의 변화를 확인합니다.이 창에 표시되는 모든 정보는 결정화 중 중량 변화를 기반으로 실시간으로 계산되고 표시되며, 이는 초고감도 저울에 의해 온라인으로 기록됩니다. 플레이트에 파라핀 오일 3ml를 추가하여 깨끗한 표준 Terasaki 플레이트를 코팅합니다. 오일이 72개의 웰을 모두 덮도록 플레이트를 다른 각도로 부드럽게 움직여 플레이트 웰에 파라핀 오일을 분배합니다.접시에 떠 있는 기름을 부어 여분의 파라핀 오일을 제거합니다. 중지' 버튼을 클릭하여 결정화 실험을 마칩니다. 결정화 액적이 들어있는 샘플 캐리어를 조심스럽게 꺼냅니다.피펫을 사용하여 결정화 방울의 2 마이크로 리터 aloquots를 Terasaki 플레이트의 웰에 놓습니다. 오일 하의 플레이트에서 결정화 방울을 복구함으로써 현미경 또는 Terasaki 플레이트와 함께 작동하는 기타 diolist 기술을 사용하여 샘플의 결정 성장 안정성을 주기적으로 확인할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 단량체 단백질에서 핵, 나노 결정 및 미세 결정의 형성을 향한 전체 결정화 과정 동안 단백질 방울의 입자 크기 성장을 보여주는 반경 플롯 분포입니다.여기서 플롯은 계산된 단백질 농도 및 침전물 농도와 함께 단백질 방울의 무게에 대한 시간 경과에 따른 변화를 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 실험이 끝날 때 Thaumatin 미세결정의 기록된 사진입니다. 물방울은 단백질 용액에 포화된 매우 풍부한 양의 작은 미세 결정을 보여줍니다.이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 1시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 마이크로투징 시스템의 DLS 레이저를 단백질 방울로 조정하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단백질 샘플을 성공적으로 결정화하기 위해 이 결정화 장치를 쉽게 다루는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 방법은 결정화 액적에 직접 결합되는 in situ dynamic light scattering 때문에 가능합니다. 이를 통해 반경 분포의 모든 변화를 모니터링할 수 있으므로 결정화 또는 단백질 침전에 대한 특정 분포 패턴을 정확히 찾아낼 수 있습니다. 이 절차에 따라 초저온 전자 현미경 또는 전자 회절과 같은 다른 방법을 적용하여 추가 질문에 답하고 용액 내 마이크로미터 미만 크기의 입자의 결정 상태를 확인할 수 있습니다.이 기술의 의미는 핵형성의 2단계 이론으로 확장되는데, DLS 맵은 결정 성장 전에 용액 내 입자의 두 배 크기 분포에 대한 명확한 패턴을 보여주기 때문입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

이 프로토콜은 자세하게에서 조작 상 온에서 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 미세 장치를 작동 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 그것은 동적 산란에 의해 단백질 결정 화를 모니터링 하는 방법 설명 하 고 처리 하 고 분석 하는 방법을 얻은 회절 데이터.

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

이 논문은 투석 방법과 시투X선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세유체 칩의 제조 프로토콜을 자세히 설명합니다. 미세 제조 공정을 통해 반과소성 재생셀룰로오스 투석 막을 칩의 두 층 사이에 분자량 차단과 통합할 수 있습니다.

시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

결정학에 의한 생체 거대 분자의 구조 적 연구는 고품질의 결정이 필요합니다. 여기에서는 OptiCrys(실험실에서 개발된 완전 자동화 기기) 및/또는 미세diadiasis 버튼에서 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 큰 고품질 결정을 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 시연합니다.

중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

이 기사의 목적은 시청자에게 대규모 단일 단백질 결정을 성장시키기 위한 소량의 증기 확산 프로토콜을 직렬 결정학을 위한 대용량 배치 미세 결정화 방법으로 변환하는 방법에 대한 확실한 이해를 제공하는 것입니다.

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

여기서는 EMBL 그르노블의 HTX 연구소의 CrystalDirect 기술을 기반으로 단백질-투 구조, 신속한 리간드 단백질 복합 분석 및 대규모 단편 스크리닝을 위해 자동화된 거대 분자 결정도 파이프라인을 사용하는 방법을 설명합니다.

그르노블의 EMBL HTX 시설의 자동 결정화 파이프라인

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

단백질 미세 결정을 사용하는 X 선 결정학을위한 프로토콜이 제시됩니다. 정제 후 또는 cellulo에서 미세 -grown 생체 분석 두 예가 비교된다.

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

학습하세요 단백질 결정화를 위한 자동화 장치와 현장 동적 산란(DLS)을 활용한 실시간 모니터링 방법을. 이 기술은 핵 생성과 결정 성장을 정밀하게 제어하여 다양한 크기의 단백질 결정을 생산할 수 있습니다.

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

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