실험실 주택의 청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)에 대 한 프로토콜

이 프로토콜의 전반적인 목표는 청록색 송사리의 실험실 군체를 성공적으로 키워 빠르고 높은 처리량 방식으로 노화 및 노화 관련 질병을 연구하는 것입니다. 이 방법은 단일 유전자 돌연변이 또는 환경 개입이 척추 동물 종의 노화 과정을 조절할 수 있는지 여부와 같은 노화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기본 프로토콜을 따름으로써 여러 실험실에서 청록색 송사리를 사용하여 실험을 수행할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 송사육에는 몇 가지 고유한 기능이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 예를 들어, 배아는 부화 전에 건조한 기질에서 자랍니다., 이것은 제브라피시와 같은 표준 물고기 모델과는 매우 다릅니다. 시작하려면 9.5리터 크기의 번식 탱크를 각각 5주 된 수컷 한 마리와 6주에서 7주 된 암컷 두 마리로 구성하십시오.

그런 다음 플라스틱 용기에 약 2-3cm 깊이의 오토클레이브 모래를 채우고 모래 상자를 사육 탱크 중앙에 놓습니다. 청록색 송사리가 지속적으로 번식할 수 있도록 하고 배아 부화를 위해 일주일에 한 번 배아를 수확합니다. 형질전환 계통의 주입 및 생성에 사용할 하나의 세포 단계 배아를 채취하기 위해, 방금 시연한 것처럼 수컷 물고기 1마리와 암컷 물고기 2마리로 번식 탱크를 설정합니다.

배아 채취 이틀 전에 수컷을 개별 수조로 옮기고 성인 암컷과 시각적 접촉을 유지합니다. 채취 당일에는 수컷과 샌드박스를 번식 탱크에 추가하고 물고기가 2시간 동안 산란하도록 합니다. 탱크에서 샌드박스를 생성하고 제거한 후 샌드박스를 여과기에 비우고 시스템 물을 사용하여 헹굽니다.

그런 다음 스트레이너를 시스템 물에 부분적으로 담그고 배아가 중앙에 함께 모이도록 부드럽게 소용돌이칩니다. 2밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 채취하여 약 40밀리리터의 시스템 물이 담긴 90밀리미터 페트리 접시에 옮깁니다. 광학 현미경으로 페트리 접시에 있는 배아를 검사하고 융모막 파열과 손상 징후가 있는 배아를 제거합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 배아를 표백한 후 파란색으로 염색될 수 있는 죽은 배아를 검사하고 제거합니다. 배아가 신선한 메틸렌 블루 용액에서 배양하도록 허용되면 발달된 배아에 검은 눈이 보이는지 확인합니다. 그런 다음 일회용 파스퇴르 피펫 또는 미세한 곡선 핀셋을 사용하여 배아를 여과지 플레이트에 옮깁니다.

발달하지 않은 배아는 메틸렌 블루로 보관하고 매일 모니터링하십시오. 검은 눈이 발달하면 단단한 기질 매체로 옮깁니다. 겸자를 사용하여 90mm 플레이트당 최대 100개의 배아까지 약 5mm 간격으로 배아를 펼칩니다.

그런 다음 파라핀을 사용하여 접시를 밀봉하고 배아가 황금 붓꽃이 완전히 발달하고 부화할 준비가 될 때까지 섭씨 28도에서 2-3주 동안 배아를 배양합니다. 최대 1년까지 장기 보관하려면 메틸렌 블루 용액에서 3일 동안 배양한 후 방금 설명한 대로 배아를 고체 기질 배지 플레이트에 이식하고 섭씨 17도에서 배양합니다. 물고기를 부화시키려면, 가늘고 구부러진 핀셋을 사용하여 50 내지 100개의 발달된 배아를 조심스럽게 부화 상자에 넣고 섭씨 4도에서 2cm 이하의 부식산 용액에 완전히 담급니다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 송사리 배아를 부화시키는 것인데, 이는 건조한 기질에서 배양된 배아를 충분한 폭기가 제공되는 부식산을 함유한 부화 용액으로 전달함으로써 달성됩니다. 부화 상자를 뚜껑으로 덮고 부화 인큐베이터에서 섭씨 28도에서 배양합니다. 충분한 통기를 공급하려면 튜브가 있는 공기 공급 장치에 상자를 연결하십시오.

부화 상자에서 적절한 수질을 유지하려면 부화 후 날부터 하루에 한 번 최종 깊이를 2cm로 유지하는 고압멸균 시스템 물을 1:1 비율로 상자에 보충합니다. 부화하지 않은 배아는 모두 고체 기질로 다시 옮기고 일주일 후에 부화를 시도합니다. 부화 후 5일 후에 어린 물고기와 성어를 키우려면 일회용 플라스틱 피펫이나 플라스틱 숟가락을 사용하여 400마이크로미터 치어 스크린이 장착된 0.8리터 탱크당 5마리의 어린 물고기를 조심스럽게 옮겨 어린 물고기를 물 재순환 시스템으로 이동합니다.

생후 14일이 되면 어린 물고기를 850마이크로미터 치어 스크린이 장착된 2.8리터 수조로 옮깁니다. 이 시점부터 각 수조에 물고기 ID를 표시하십시오.생존 분석을 위해 각 물고기를 단일 수조에 개별적으로 수용하십시오. 생존 분석을 위해 사육된 물고기도 2.8리터 탱크에 개별적으로 보관됩니다.

다음 7일 동안은 하루에 두 번 1-3마리의 살아있는 혈액 벌레가 보충된 5ml의 소금물 새우를 어린 새끼에게 먹이십시오. 생후 4주가 되면 하루에 두 번씩 각 물고기에게 소금물 새우와 1밀리리터의 혈액 벌레를 먹이십시오. 이 단계에서 수컷의 경우 착색 징후가 있는 큰 등지느러미, 항문 지느러미, 꼬리 지느러미가 있고 암컷의 경우 알로 가득 찬 둥근 복부의 존재를 확인하여 물고기가 완전한 성적 성숙에 도달하도록 합니다.

여기에 보이는 것은 70마리의 수컷 청록색 송사리의 대표적인 생존 곡선입니다. 적절한 축산은 GRZ 균주에서 12주에서 28주 사이의 평균 생존율을 가져옵니다. 평균 생존율의 변화는 식단, 수유 빈도 및 사육 온도 조건에 따라 달라집니다.

열악한 축산 환경에서 자란 어류의 생존 곡선은 최적의 사육 조건에서 자란 어류에 비해 시간이 지남에 따라 조기 폐사율이 증가하고 반복적으로 생존율이 급격히 감소하는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜을 따르는 동안 깨끗한 환경에서 유지하는 것이 필수적이므로 갓 부화한 치어의 물 상태와 과도한 음식을 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 형질전환 발생, 게놈 편집 및 식이 조작을 포함하여 청록색 송사리에서 실험적 조작을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 실험실에서 청록색 송사리를 성공적으로 키우는 방법을 잘 이해하고 이 모델을 사용하여 포로 상태에서 키울 수 있는 가장 수명이 짧은 척추 동물의 노화 생물학을 탐구해야 합니다.