Name: 실험실 주택의 청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)에 대 한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 학습하세요 청록색 송사리(Nothobranchius furzeri) 실험실 사육 프로토콜로 노화 및 연령 관련 질병 연구를 위한 고효율 방법을 익히세요. 이 기술은 유전자 돌연변이와 환경 개입이 척추동물 노화 과정에 미치는 영향을 탐구하는 데 활용됩니다.

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우리 감사 Alessandro Cellerino, 타이론 Genade, 앤 검은 머리, 사 브리 나 샤 프, 미키 파월, 시몬 Keil, 김 유미, 패트릭 스미스, 카이 Mathar 및 Valenzano 연구소의 모든 구성원 막스 플랑크 연구소에서 노화의 생물학에 대 한 다양 한 측면에 기여 년 동안 현재 송사리 축산 프로토콜.

<ol><li>Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+aging+model+systems+and+why+we+need+them%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Non-canonical aging model systems and why we need them.</a> EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).</li>
<li>Harel, I., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish%3A+A+Model+for+Exploring+Vertebrate+Aging+and+Diseases+in+the+Fast+Lane%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+life+span+by+the+gut+microbiota+in+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).</li>
<li>Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short-lived+African+turquoise+killifish%3A+an+emerging+experimental+model+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).</li>
<li>Blazek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intraspecific+divergence+in+life+span+and+aging+of+African+annual+fishes+along+an+aridity+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient.</a> Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).</li>
<li>Terzibasi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+differences+in+aging+phenotype+between+strains+of+the+short-lived+annual+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri.</a> PLoS One. 3 (12), e3866(2008).</li>
<li>Kirschner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+quantitative+trait+loci+controlling+lifespan+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri--a+new+vertebrate+model+for+age+research%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research.</a> Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+loci+associated+with+tail+color+and+sex+determination+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

모든 저자는 아무 경쟁 금융 및 비 금융 관심사를 선언합니다.

우리 실험실 청록색 송사리, 성인 물고기 주택 뿐만 아니라 태아 컬렉션, 부 화, 등의 재배에 대 한 프로토콜을 설명, 사육 및 먹이. 우리의 프로토콜 노화와 수명에 대 한 실험 연구에 대 한 특히 성인 물고기에 초점을 맞춘 연구 실험실을 구체적으로 타겟팅 됩니다. 청록색 송사리 표준 zebrafish 시설;에 올려질 수 있다 그러나, 송사리 농업의 중요 한 측면에서 표준 zebrafish 케어16다. 이러한 배아 부 화, 액체와 건조 부 화 단계 구성의 특정 단계 뿐 아니라 단백질이 풍부한 혈액 벌레, 보충 다이어트 소금물 새우만 다이어트에서 초기 전환 포함 됩니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계 8-30 ° C의 온도 범위 내에서 운송 배아를 포함합니다. 번 식, 경우 통치 주파수 및 식품 품질; 먹이에 따라 달라 집니다. 따라서, 배아 수율 (참조 섹션 5.6.) 인상 탱크 사육 당 하루 두 개 이상 feedings를 좋습니다. 태아는 표백, 동안 표백 솔루션에서 태아 외피를 확장 하지 않습니다. 이 계란 chorion 및 증가 태아 사망률에 손상을 일으킬 수 있습니다. 메 틸 렌 블루와 배아를 배양 할 때로 그들의 생존 능력을 극적으로 감소 될 것 이다 2 주에 이상에 대 한 준비-해치 배아의 부 화를 연장 하지 마십시오. 청록색 송사리를 부 화, 대 한 humic 산 성 솔루션의 낮은 온도 향상 부 화 하며 솔루션에 배아의 완전 한 침수 동기화 된 해칭 가스 방광을 채울 수 없는 튀김의 높은 가격에 부 화 결과 동안 충분 한 통 기 통풍 ("배꼽-슬라이더" 표현 형, 섹션 5.1 참조 하십시오).
번 식에 대 한 프로토콜의 한계는 포즈에 여과 시스템을 중앙 집중식 도전과 미래에 다른 방법으로 대체 한다 모래 기판의 사용을 포함. 가능한 대안 zebrafish 사육 탱크의 사용 될 수 있습니다. 배아 표백 변경된 chorion 생리학 및 부 화 성공 귀 착될 수 있는 계란 chorion에 주요 물리 화학 변화를 일으킬 수 있습니다. Methylene 청색에 배아의 지속적인 노출 성인 물고기 생리학에 장기적인 변화 유도 수 있습니다. 성인 물고기 생존 코 호트 연구에 대 한 개별 탱크에서 높이 생선 행동과 건강을 부정적인 영향을 수 있습니다. 그러나, 생존 코 호트 연구 그룹 주택 엄격한 사회 계층으로 이어지는 사회 지배와 남성 영토의 설립으로 인해 상당한 혼란 요소를 추가 합니다. 따라서, 우리는 생존 연구에 대 한 남성 생선의 절연은 합리적인 타협 판단. 취소 제어 소스에서 라이브 음식 먹이 실험실 송사리 식민지는 기생충과 잠재적으로 병원 성 미생물 지역 사회에서 외부 오염에 대 한 위험을 추가합니다. 미래에 ad hoc 메 마른 물고기 피드 개발 되어야 한다.
이 프로토콜에 미래 개선 여전히 3-4 주 이내 성적 성숙 완료 리드 제어, 비-라이브 다이어트에 집중할 것 이다. 요약 하자면, 우리의 프로토콜 넓은 과학계에 청록색 송사리 실험실 경작에 대 한 접근을 제공 합니다.

그들의 짧은 생애 경 간 및 빠른 라이프 사이클을 감안할 때, 청록색 송사리를 유망한 새로운 모델 유기 체 생물학1,2,3로 급속 하 게 성장 하고있다. 이 종 한 teleost, 미 발달 diapause, 급속 한 성적인 성숙, 및 post-reproductive 수명 연장된 단계4,5의 구성에 대 한 고유한 라이프 사이클에 의해 특징입니다. 최근 작품은 포로 야생6,7에서이 종의 생물학 elucidating에 기여 했다. 청록색 송사리 짐바브웨, 모잠비크는 아프리카 사바나에 우기 동안 양식 계절 신선한 물 시체에 살고 있습니다. 건조 한 계절, 태아 건조 진흙 물 diapause 이라는 스트레스 저항 생활 단계 미 덕의 부재에 남아 있다.
이 종족에 대 한 유전자 지도 생성 된8,9, 그리고 최근에 그들의 게놈 시퀀스 및 조립10,11되었습니다. 여러 가지 타고 난된 실험실 물고기 종자를 개발 하 고 transgenesis 및 CRISPR/Cas9를 통해 편집 하는 게놈이이 종, 사실상 경쟁 실험실 척추 모델 유기 체 로 청록색 송사리를 홍보에 제공 되 12,,1314.
실험실 프로토콜 이미이 종15게시 되었습니다, 비록 현재 프로토콜에서 우리 개발 특히 노화 및 생존을 조사 연구 목적으로 실험 실험실 지침의 포괄적인 목록. 현재 프로토콜 연구원은 제 브라와 메 다카 축산에 이미 익숙한 키 조정의 최소 수를 채택 하 여 청록색 송사리 축산에 조예가 될 수 있습니다. 동시에이 프로토콜 번성 청록색 송사리 식민지를 필수 도구로 생선 농업에 사전 경험 없이 연구를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>프로브 교정 버퍼 용액 pH=7.0</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>1L 버퍼 용액 pH=7.0 용수 시스템 pH 전극 교정을 위한</td></tr><tr><td>프로브 교정 버퍼 용액 pH=4.0</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>1L 버퍼 용액 pH=4.0 용수 시스템 pH-전극</td></tr><tr><td>교정 전도도 표준</td><td>VWR</td><td>83607.260</td><td>500 mL 용수 시스템 교정을 위한 전도도 표준 1,413 uS/cm 전도도 전극</td></tr><tr><td>Easy Strips Test 6in1</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>시스템 물의 염소 값 측정을 위한 테스트</td></tr><tr><td>스트립 암모니아 테스트</td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>시스템 물의 암모니아 함량을 결정하기 위한 테스트</td></tr><tr><td>홍해 소금</td><td>홍해</td><td></td><td>22kg 양동이</td></tr> 탄<tr><td>산수소나트륨</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>부식산</td><td>시그마- Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>새로운 HUFA Artemia 농축</td><td>ZM Systems UK</td><td></td><td>75g 병</td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>Roth</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>코코넛 섬유</td><td>Dragon</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 종이</td><td>GE 헬스케어</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 순수</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100%</td></tr> <tr><td>실리카 모래</td><td>현지 애완 동물 가게</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Artemia Eggs 프리미엄 등급</td><td>샌더스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloodworm</td><td>현지 유통업체</td><td></td><td>Poseidon Aquakultur 독일</td></tr><tr><td>dNTP 솔루션 믹스</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5U/열</td></tr><tr><td>PCR 10x 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH=8.0 용액</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>어항</td><td>Aquaneering</td><td></td><td>용량: 0.8L, 2.8L, 9.5L; 배플, 튀김 메시 및 뚜껑 장착</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>모델 5000</td></tr><tr><td>미생물 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>50125882</td><td>모델 IMC18; 액체 상태에서의 저장 배아의 경우, t=27-28°deg로 설정; C</td></tr><tr><td>냉각 인큐베이터</td><td>바인더</td><td>9020-0209</td><td>모델 KT115; 고체상의 저장 배아의 경우 t = 27-28 °C로 설정; C</td></tr><tr><td>부화 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>모델 OGS180; 배아 부화의 경우 t = 27-28 &deg로 설정; C</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>모델 M80</td></tr><tr><td>번식 모래 / 부화 상자</td><td>Roth</td><td>1598.1</td><td>1000mL</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>92x16mm</td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td>로스</td><td>EA71.1</td><td>2mL; 벌레로 물고기를 먹이거나 배아를 선택하는 경우 팁을 잘라 직경 3-4mm의</td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td>을 엽니다. <td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td><td>50mL</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10mL</td></tr><tr><td>금속 여과기</td><td></td><td></td><td>섬도 < 1 밀리미터 ; 배아 수집용</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Dumont</td><td>0508-5/45-PO</td><td>type5/45; 배아 이식용</td></tr><tr><td>25 L 염수 새우 부화기</td><td>Aquaneering</td><td>ZHBS25</td><td>메인 부화기</td></tr><tr><td>500 mL 염수 새우 부화기</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>모델 Artemio 1; 백업 부화기</td></tr><tr><td>좁은 메쉬 어망</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>모래 비커</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td><td>5000mL</td></tr><tr><td>소금물 새우 분리 비커</td><td>VWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000mL</td></tr><tr><td>플라스틱 지퍼 백</td><td>Roth</td><td>P279.2</td><td>죽은 물고기 보관</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td>155000</td><td>모델 Pipetboy acu2</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>에어 튜빙</td><td>www.zajac.de</td><td>AQ380</td><td>4-6mm 직경</td></tr><tr><td>1L 유리병</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L 유리병</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 스퀴즈 병</td><td>Roth</td><td>K665.1</td><td>소금물 새우로 물고기 먹이기</td></tr><tr><td>120-&#956; m 소금물 새우 여과기</td><td>플로리다 아쿠아 팜</td><td>BB-PC2</td><td>소금물 새우/벌레 수집용</td></tr><tr><td>마감 필터 양말</td><td>Aquaneering</td><td>MFVB025C</td><td>25-&#956; m</td></tr><tr><td>중앙 여과 어류 하우징 시스템</td><td></td><td></td><td>Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz</td></tr></tbody></table>

실험실 주택의 청록색 송사리 (nothobranchius furzeri)에 대 한 프로토콜

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

실험적인 목적을 위해 사용 하는 비 모델 실험실 물고기에서 농업 관행의 개발은 크게 혜택 참조 물고기의 설립에서 모델 시스템, 제 브라와 메 다카. 최근 몇 년 동안, 신흥 물고기-청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)-노화와 생태의 생물학의 분야에서 연구 그룹의 성장 수에 의해 채택 되었습니다. 4-8 개월의 포로 생활 스팬,이 종 감 금에서 발생 하는 shortest-lived 척추 이며 노화 속도와 수명이 변경으로 이어질 수 있는--짧은 시간에에서 테스트 실험 개입을 과학적으로 지역 사회를 수 있습니다. 이 종, 미 발달 diapause, 특징의 독특한 생물학 주어 폭발적인 성적 성숙, 표시 형태학과 행동 성적인이 형태 성-그리고 그들의 상대적으로 짧은 성인 수명- 임시 농업 관행은 긴급 수요입니다. 이 프로토콜 허용 최적의 청록색 송사리 실험실 관리, 강력한 실험실 동물 모델로이 종 채택 하 사회 과학을 사용 하는 주요 축산 측정값 집합을 보고 합니다.

청록색 송사리 적절 한 농업 메디아 생존 GRZ 변형 (예: 그림 4A)에 12-18 주 사이에 발생 합니다. 메디아 생존의 다이어트, 주파수, 수 유 및 주택 온도 조건에 따라 달라 집니다. 불 쌍 한 축산 결과 제시 하는 생존 곡선에서 초기 사망률 및 반복, 갑자기 여러 굴절 포인트 (그림 4B) 특징, 시간에 걸쳐 생존의 증가.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg"> 그림 1: 각 인큐베이션 기판 대표 배아 발달 단계. (A) 갓 배아, 28 ° c.에 인큐베이터에서 메 틸 렌 블루 솔루션에서 incubated 수집 (B) 고체 매체를 전송할 준비가 배아 중 종이 또는 코코넛 섬유 필터. (C) 배아 준비가 해치 할 일반적인 황금 홍 채를 표시 합니다. 눈금 막대는 1 mm.에 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg"> 그림 2: 청록색 송사리 후 부 화 개발의 단계. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg"> 그림 3: 3 단계 이후에서 물고기에 대 한 대표적인 물고기 ID 태그. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg"> 그림 4: 70 남성 청록색 송사리에 대 한 대표적인 생존 곡선. (A) 실험실 제기 청록색 송사리에 대 한 일반적인 생존 곡선. (B) 생존 곡선의 비교는 최적의 농업 조건 (블랙)에서 발생 하는 물고기에서 얻은 고 가난한 농업 (빨간색과 파란색). 수평 빨간색 파선 50% 생존, 평균 수명 (x 축에 표시)에 교차 생존 곡선을 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">앞으로 뇌관</td>
			<td colspan="2">반전 뇌관</td>
			<td>크기 범위 (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166-214</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220-272</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209-240</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198-238</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164-226</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196-197</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252-295</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216-248</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174-205</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355-373</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">*-섹스 결정 마커</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 스트레인 식별 유전형 뇌관입니다.

실험실 주택 터키석 송사리 집 고 효율적으로 개별 물고기의 수천 고용 표준 zebrafish 시설에 사용 하는 동일한 인프라는 중앙 집중식된 물 여과 시스템에서 확장할 수 있습니다. 여기 우리가 유지 보수 효율적 송사리 수 있도록 표준화 된 절차의 목록을 자세하게.

실험실 주택의 청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)에 대 한 프로토콜

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 청록색 송사리의 실험실 군체를 성공적으로 키워 빠르고 높은 처리량 방식으로 노화 및 노화 관련 질병을 연구하는 것입니다. 이 방법은 단일 유전자 돌연변이 또는 환경 개입이 척추 동물 종의 노화 과정을 조절할 수 있는지 여부와 같은 노화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기본 프로토콜을 따름으로써 여러 실험실에서 청록색 송사리를 사용하여 실험을 수행할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 송사육에는 몇 가지 고유한 기능이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 예를 들어, 배아는 부화 전에 건조한 기질에서 자랍니다., 이것은 제브라피시와 같은 표준 물고기 모델과는 매우 다릅니다. 시작하려면 9.5리터 크기의 번식 탱크를 각각 5주 된 수컷 한 마리와 6주에서 7주 된 암컷 두 마리로 구성하십시오.그런 다음 플라스틱 용기에 약 2-3cm 깊이의 오토클레이브 모래를 채우고 모래 상자를 사육 탱크 중앙에 놓습니다. 청록색 송사리가 지속적으로 번식할 수 있도록 하고 배아 부화를 위해 일주일에 한 번 배아를 수확합니다. 형질전환 계통의 주입 및 생성에 사용할 하나의 세포 단계 배아를 채취하기 위해, 방금 시연한 것처럼 수컷 물고기 1마리와 암컷 물고기 2마리로 번식 탱크를 설정합니다.배아 채취 이틀 전에 수컷을 개별 수조로 옮기고 성인 암컷과 시각적 접촉을 유지합니다. 채취 당일에는 수컷과 샌드박스를 번식 탱크에 추가하고 물고기가 2시간 동안 산란하도록 합니다. 탱크에서 샌드박스를 생성하고 제거한 후 샌드박스를 여과기에 비우고 시스템 물을 사용하여 헹굽니다.그런 다음 스트레이너를 시스템 물에 부분적으로 담그고 배아가 중앙에 함께 모이도록 부드럽게 소용돌이칩니다. 2밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 채취하여 약 40밀리리터의 시스템 물이 담긴 90밀리미터 페트리 접시에 옮깁니다. 광학 현미경으로 페트리 접시에 있는 배아를 검사하고 융모막 파열과 손상 징후가 있는 배아를 제거합니다.텍스트 프로토콜에 따라 배아를 표백한 후 파란색으로 염색될 수 있는 죽은 배아를 검사하고 제거합니다. 배아가 신선한 메틸렌 블루 용액에서 배양하도록 허용되면 발달된 배아에 검은 눈이 보이는지 확인합니다. 그런 다음 일회용 파스퇴르 피펫 또는 미세한 곡선 핀셋을 사용하여 배아를 여과지 플레이트에 옮깁니다.발달하지 않은 배아는 메틸렌 블루로 보관하고 매일 모니터링하십시오. 검은 눈이 발달하면 단단한 기질 매체로 옮깁니다. 겸자를 사용하여 90mm 플레이트당 최대 100개의 배아까지 약 5mm 간격으로 배아를 펼칩니다.그런 다음 파라핀을 사용하여 접시를 밀봉하고 배아가 황금 붓꽃이 완전히 발달하고 부화할 준비가 될 때까지 섭씨 28도에서 2-3주 동안 배아를 배양합니다. 최대 1년까지 장기 보관하려면 메틸렌 블루 용액에서 3일 동안 배양한 후 방금 설명한 대로 배아를 고체 기질 배지 플레이트에 이식하고 섭씨 17도에서 배양합니다. 물고기를 부화시키려면, 가늘고 구부러진 핀셋을 사용하여 50 내지 100개의 발달된 배아를 조심스럽게 부화 상자에 넣고 섭씨 4도에서 2cm 이하의 부식산 용액에 완전히 담급니다.이 프로토콜의 중요한 단계는 송사리 배아를 부화시키는 것인데, 이는 건조한 기질에서 배양된 배아를 충분한 폭기가 제공되는 부식산을 함유한 부화 용액으로 전달함으로써 달성됩니다. 부화 상자를 뚜껑으로 덮고 부화 인큐베이터에서 섭씨 28도에서 배양합니다. 충분한 통기를 공급하려면 튜브가 있는 공기 공급 장치에 상자를 연결하십시오.부화 상자에서 적절한 수질을 유지하려면 부화 후 날부터 하루에 한 번 최종 깊이를 2cm로 유지하는 고압멸균 시스템 물을 1:1 비율로 상자에 보충합니다. 부화하지 않은 배아는 모두 고체 기질로 다시 옮기고 일주일 후에 부화를 시도합니다. 부화 후 5일 후에 어린 물고기와 성어를 키우려면 일회용 플라스틱 피펫이나 플라스틱 숟가락을 사용하여 400마이크로미터 치어 스크린이 장착된 0.8리터 탱크당 5마리의 어린 물고기를 조심스럽게 옮겨 어린 물고기를 물 재순환 시스템으로 이동합니다.생후 14일이 되면 어린 물고기를 850마이크로미터 치어 스크린이 장착된 2.8리터 수조로 옮깁니다. 이 시점부터 각 수조에 물고기 ID를 표시하십시오.생존 분석을 위해 각 물고기를 단일 수조에 개별적으로 수용하십시오. 생존 분석을 위해 사육된 물고기도 2.8리터 탱크에 개별적으로 보관됩니다.다음 7일 동안은 하루에 두 번 1-3마리의 살아있는 혈액 벌레가 보충된 5ml의 소금물 새우를 어린 새끼에게 먹이십시오. 생후 4주가 되면 하루에 두 번씩 각 물고기에게 소금물 새우와 1밀리리터의 혈액 벌레를 먹이십시오. 이 단계에서 수컷의 경우 착색 징후가 있는 큰 등지느러미, 항문 지느러미, 꼬리 지느러미가 있고 암컷의 경우 알로 가득 찬 둥근 복부의 존재를 확인하여 물고기가 완전한 성적 성숙에 도달하도록 합니다.여기에 보이는 것은 70마리의 수컷 청록색 송사리의 대표적인 생존 곡선입니다. 적절한 축산은 GRZ 균주에서 12주에서 28주 사이의 평균 생존율을 가져옵니다. 평균 생존율의 변화는 식단, 수유 빈도 및 사육 온도 조건에 따라 달라집니다.열악한 축산 환경에서 자란 어류의 생존 곡선은 최적의 사육 조건에서 자란 어류에 비해 시간이 지남에 따라 조기 폐사율이 증가하고 반복적으로 생존율이 급격히 감소하는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜을 따르는 동안 깨끗한 환경에서 유지하는 것이 필수적이므로 갓 부화한 치어의 물 상태와 과도한 음식을 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 형질전환 발생, 게놈 편집 및 식이 조작을 포함하여 청록색 송사리에서 실험적 조작을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 실험실에서 청록색 송사리를 성공적으로 키우는 방법을 잘 이해하고 이 모델을 사용하여 포로 상태에서 키울 수 있는 가장 수명이 짧은 척추 동물의 노화 생물학을 탐구해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 zebrafish 축산을위한 최적의 조건을 유지하기 위해 정기적 인 유지 보수 및 관리를 간략하게 설명합니다. 비디오 시스템 유지 보수, 일반 주택, 먹이, 사육하고, zebrafish 애벌레의 양육에 대한 프로토콜을 보여줍니다.

Zebrafish의 일반 관리 및 유지 관리 (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) 실험실 : 소개

번식 및 생체 내 연구에 적합한 제브라피시 시설이 쉽고 저렴한 방식으로 지어졌습니다. 유지 보수가 최소화됩니다. 이 시설은 학생 참여 및 독립적인 연구에 이상적입니다.

저렴하고 간편한 구축 Zebrafish의 시설의 건설

이 연구는 항생제에 의해 피부와 장내 마이크로 바이 옴의 사회 구성의 변경 다음 모델 물고기 호스트에 효과를 나타 내기 위해 방법을 포함한다.

호스트 표현형의 시험에<em&gt; Gambusia의 affinis입니다</em&gt; 다음은 항생제 치료

이 프로토콜에는 기름 통 면봉의 사용 및 Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 와 같은 병원 체를 검출 하기 위하여 센 티 넬의 단독 사용에 비해 증가 탐지에 이르게 zebrafish 시스템의 슬러지 분석 설명 합니다. Pseudocapillaria tomentosa. 검역에 P. tomentosa 계란을 모니터링 하는 시스템도 제안 했다.

Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 Pseudocapillaria tomentosa Zebrafish 시스템에서의 환경 심사

이 프로토콜에 붙일 레이블된 T. cruzi 투명 zebrafish 애벌레로 주입 했다 그리고 기생충 운동 성에서 관찰 되었다 vivo에서 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여.

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

이 작품에서는, 우리는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 단일 및 결합 된 스트레스의 효과 공부 하는 급성, 만성 및 대가족제 검정을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 공부 하도록 설계 되었습니다.

급성 및 만성 Ecotoxicity 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 의 테스트에 대 한 프로토콜

이 프로토콜에서 우리 Astyanax mexicanus 성인 사육, 애벌레, 인상 하는 방법을 보여 하 고 표면의 고기를 비교 하 여 morphotypes 동굴 후 애벌레 물고기에 전체 마운트 immunohistochemistry를 수행 합니다.

Post-larval 고기 분석 및 전체 마운트 Immunohistochemistry 멕시코 Tetra Astyanax mexicanus 를 높이

포로 생활에서 동물의 복지를 평가하는 근본적인 측면은 동물이 원하는 것을 가지고 있는지 묻는 것입니다. 여기서, 우리는 환경 농축의 존재/부재 및 물의 흐름에 대한 접근에 관하여 제브라피시(Daniorerio)의주거 선호도를 결정하는 프로토콜을 제시한다.

생선 복지 를 평가하기 위한 선호도 테스트를 위한 표준화된 프로토콜

여기에서 우리는 단일 핵 RNA 시퀀싱 또는 시퀀싱을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 단일 핵 분석(ATAC-seq)과 같은 다운스트림 애플리케이션을 위해 수명이 짧은 척추동물 모델 Nothobranchius furzeri의 뇌에서 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

성인 아프리카 청록색 Killifish의 뇌 조직에서 핵의 부드러운 분리, 노화 연구를위한 자연적으로 수명이 짧은 모델

여기서는 제브라피시 사육 재순환을 위한 새롭고 건설이 쉬우며 저비용의 프로토콜을 소개합니다.

맞춤 제작된 순환 제브라피시 사육 시스템

학습하세요 청록색 송사리(Nothobranchius furzeri) 실험실 사육 프로토콜로 노화 및 연령 관련 질병 연구를 위한 고효율 방법을 익히세요. 이 기술은 유전자 돌연변이와 환경 개입이 척추동물 노화 과정에 미치는 영향을 탐구하는 데 활용됩니다.

실험실 주택의 청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)에 대 한 프로토콜

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