Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법
2018년 4월 16일
여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.
이 절차의 전반적인 목표는 성체 마우스에서 심근내 아데노바이러스 주사를 통해 생체 내에서 심장 특이적 유전자 조작을 달성하는 것입니다. 이 방법은 분자 메커니즘 및 심장 손상 정렬, 유전자 치료의 효능에 대한 심혈관 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 환기가 필요 없고 생쥐가 수술 후 빠르게 회복하며 재현 가능하고 수행하기 쉽다는 것입니다.
이제 시작하겠습니다. 시술 당일, 정제된 아데노바이러스 벡터 용액을 섭씨 영하 80도에서 따뜻하게 데우고 얼음 위에 보관합니다. 아데노바이러스가 해동되면 안면 마스크, 멸균 가운, 멸균 장갑을 착용하십시오.
그리고 아데노바이러스 튜브에 75% 에탄올을 분사합니다. 바이러스를 멸균 층류 후드로 옮기고 50마이크로리터의 바이러스 용액을 50마이크로리터의 멸균된 해밀턴 주사기로 흡인합니다. 주사기에 30게이지 바늘을 부착합니다.
주사기를 똑바로 세웁니다. 바늘 끝에 용액 한 방울이 보일 때까지 플런저를 부드럽게 눌러 바늘 끝에 바이러스를 채웁니다. 그런 다음 30마이크로리터의 아데노바이러스 용액을 주사기에 조심스럽게 흡입하고 주사기를 얼음 위에 놓습니다.
아데노바이러스를 쥐의 심장에 주입하려면 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 적절한 수준의 진정 효과를 확인하고 동물의 눈에 연고를 바릅니다. 동물의 가슴 위쪽과 복부를 면도하십시오. 노출된 피부에 시중에서 판매하는 제모 크림을 바르십시오.
젖은 거즈를 사용하여 1분 후에 크림과 남아 있는 머리카락을 제거합니다. 3가지 요오드 클로르헥시딘 기반 소독 스크럽을 사용하여 가슴의 왼쪽 아래를 살균합니다. 그런 다음 수술 부위에 구멍을 뚫어 수술용 드레이프로 동물을 덮고 새 멸균 장갑을 착용하십시오.
그런 다음 멸균 기술과 기구를 사용하여 xiphoid에서 겨드랑이까지 0.5cm 피부를 절개하고 집게와 Micro Mosquito 지혈을 사용하여 가슴의 대근육과 소근육을 둔탁하게 절개합니다. 주요 가슴 근육과 작은 가슴 근육을 수축시켜 늑간 공간을 노출시킵니다. 그리고 Micro Mosquito 지혈제를 사용하여 네 번째 늑간 공간을 뚫고 엽니다.
주로 사용하지 않는 손의 검지로 흉벽의 오른쪽을 부드럽게 눌러 심장을 절개 부위 쪽으로 움직입니다. 그런 다음 같은 손의 검지와 엄지로 외부화된 심장을 조심스럽게 고정하고 주로 사용하는 손을 사용하여 좌심실의 복부, 등쪽 및 측벽 각각의 심근에 10마이크로리터의 아데노바이러스 용액을 주입합니다. 마지막 주사 후 즉시 심장을 흉곽 내 공간으로 되돌립니다.
그리고 흉벽을 절개 부위 쪽으로 부드럽게 눌러 흉곽 내 공간에서 공기를 수동으로 배출합니다. 수평 매트리스 패턴으로 5개의 오트 실크 봉합사로 피부를 닫고 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 섭씨 37도의 열 패드에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 사용한 해밀턴 주사기와 30게이지 바늘을 고온 고압 살균기로 살균하고 살균한 바늘을 적절한 날카로운 물건 용기에 버립니다.
루시퍼라아제를 둘러싸고 있는 아데노바이러스의 심근내 주사 5일 후, 생체 내 이미징은 특히 심장에서 루시퍼라아제의 강력한 과발현을 나타내며, 이는 웨스턴 블롯 분석으로 확인할 수 있으며, 이는 비표적 장기 형질도입의 부재를 시사합니다. 웨스턴 블롯 분석은 또한 비타민 D 수용체 발현이 크게 증가했음을 나타냅니다. 그리고 비타민 D 수용체를 암호화하는 아데노바이러스를 주입한 쥐의 좌심실.
RNA 비타민 D 수용체를 표적으로 하는 짧은 머리핀을 인코딩하는 아데노바이러스를 주입한 동물에서 수용체의 발현 감소가 분명합니다. 대조적으로, 비타민 D 수용체 발현은 좌심실 주입 동물의 우심실에서 크게 변화하지 않습니다. 이 방법을 마스터하면 제대로 수행하면 2 분 이내에 완료 할 수 있습니다.
이 절차에 따라 심근 경색에서 특정 세포 요법의 효능과 같은 추가 질문에 답하기 위해 심장 세포 주입과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
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개요
이 프로토콜은 심근 내 아데노바이러스 주사를 통한 성체 마우스에서의 심장 특이적 유전자 조작 방법을 설명합니다. 이 기술은 빠른 회복과 재현성을 가능하게 하여 심혈관 연구에 적합합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심혈관 연구
- 유전자 치료
- 심장 생물학
배경
- 심장 손상의 분자 메커니즘 이해.
- 심장 질환에서의 유전자 치료 효능 평가.
- 생체 내 유전자 조작 기술의 중요성.
- 동물 모델에서의 비 인공호흡 절차의 장점.
연구 목적
- 심장 특이적 유전자 조작 달성.
- 특정 유전자가 심장 기능에 미치는 영향 조사.
- 향후 심혈관 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법 제공.
사용된 방법
- 제4 늑간 공간을 통한 마우스 심장의 외부화.
- 심근으로 특정 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 주사.
- 생체 내 이미징을 통한 단백질 발현 측정.
- 유전자 발현을 평가하기 위한 웨스턴 블롯 분석.
주요 결과
- 심장 조직에서의 성공적인 유전자 조작.
- 수술 후 마우스의 빠른 회복.
- 실험 간의 기술 재현성.
- 단백질 발현 수준의 효과적인 측정.
결론
- 이 프로토콜은 심장 유전자 기능 연구를 위한 귀중한 도구입니다.
- 심장 질환에서의 유전자 치료 응용 탐구를 용이하게 합니다.
- 이 방법은 심장 분자 메커니즘에 대한 이해를 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables precise cardiac-specific gene manipulation in mice, supporting target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery. By minimizing off-target transduction and enabling rapid recovery, it improves predictive confidence in preclinical models. The technique aligns with early discovery workflows requiring reproducible, scalable, and physiologically relevant gene modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through cardiac-specific overexpression or silencing of target genes like VDR.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating cardiac effects from systemic confounders.
- Strategic Value: Supports target confidence assessment prior to lead identification campaigns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable cardiac-specific readouts via luciferase imaging and Western blot for assay validation.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for consistent compound or vector screening in disease-relevant systems.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by enabling standardized myocardial delivery across studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling cardiac-specific gene modulation in vivo.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation with minimal procedural variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by confirming on-target cardiac effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling reliable cardiac gene modulation before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through precise cardiac gene manipulation.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with quantitative, heart-specific outputs.
- Analytics: Provides measurable endpoints via in vivo imaging and Western blot for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cardiac targeting without off-target effects.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for cardiac gene, cell, or material delivery across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target-specific modulation and reduced biological noise.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cardiac studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by isolating cardiac mechanisms and reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on confirmed cardiac target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery and sterile technique.
- Necessitates Hamilton syringes, 30-gauge needles, and sterile laminar flow hoods.
- Demands cross-team standardization for consistent myocardial injection volumes and depths.
- Involves adaptation considerations when scaling to different cardiac disease models.
- Limited by manual externalization technique, which may require training for reproducibility.
